長脈沖Nd:YAG 1064 nm激光對紅色毛癬菌生長及超微結(jié)構(gòu)的影響

禚風(fēng)麟 張蕊娜 王 莉 趙俊英

·論著·

長脈沖Nd:YAG 1064 nm激光對紅色毛癬菌生長及超微結(jié)構(gòu)的影響

禚風(fēng)麟 張蕊娜 王 莉 趙俊英?

目的: 確定長脈沖Nd:YAG 1064 nm激光對臨床分離紅色毛癬菌Y生長及超微結(jié)構(gòu)的影響。方法:長脈沖Nd:YAG 1064 nm激光以200 J/cm2、400 J/cm2、600 J/cm2能量體外照射含有等菌量的紅色毛癬菌Y菌落，觀察照射后菌落生長的變化，同時將激光照射前后的菌落制備成標(biāo)本，分別用掃描電鏡及透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果: 長脈沖Nd:YAG 1064 nm激光能量為400 J/cm2時，可抑制紅色毛癬菌Y菌落的生長，600 J/cm2時，紅色毛癬菌Y菌落停止生長。激光照射后的紅色毛癬菌Y菌落，在掃描電鏡下菌絲結(jié)構(gòu)由光滑變?yōu)榇植?，延長變?yōu)榘櫩s、截短，膨大；透射電鏡下菌體細(xì)胞壁及細(xì)胞器結(jié)構(gòu)破壞，可見髓樣小體及蛋白凝固體。600 J/cm2處理組:菌體崩解、壞死。結(jié)論:長脈沖Nd:YAG 1064 nm激光可抑制或終止紅色毛癬菌菌落的生長，改變菌體的超微結(jié)構(gòu)。

長脈沖Nd:YAG 1064 nm激光； 紅色毛癬菌Y

甲真菌病是皮膚科常見病，我國發(fā)病率為3%～5%。1甲真菌病影響美觀，具有傳染性，給患者的生理和心理帶來負(fù)面影響，受到關(guān)注。甲真菌病由皮膚癬菌、非皮膚癬菌及酵母菌等真菌引起，其中紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum，T.rubrum)是最常見的致病菌，其臨床分離率高達(dá)90%。激光治療甲真菌病是近年發(fā)展的一種新療法，尤其適用于老年人、兒童、肝腎功能不全、免疫功能低下的病人，受到國內(nèi)外學(xué)者的重視，但其治療方案和作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過不同能量長脈沖Nd:YAG 1064 nm激光體外照射紅色毛癬菌菌落，觀察長脈沖1064 nm激光對紅色毛癬菌生長和超微結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 受試的紅色毛癬菌菌株Y(T.rubrum Y)分離自患者激光治療前的病甲，激光治療后該病甲有新甲長出，病甲達(dá)臨床痊愈，激光治療有效，此分離株經(jīng)改良Kane/Fishcher系統(tǒng)鑒定為紅色毛癬菌，菌落表型為絨毛型，我們將其命名為紅色毛癬菌菌株Y。

1.2 儀器和設(shè)備 沙氏瓊脂培養(yǎng)基(Sabouraud Dextrose Agar，SDA)購自青島海博生物技術(shù)有限公司；透射式電子顯微鏡(Philip，NED)，掃描式電子顯微鏡(Hitachi，JPN)。PinpointeTMFootlaserTM長脈沖治療儀(Nd:YAG 1064 nm激光治療儀)由北京世紀(jì)廣通生物科技有限公司提供。

1.3 方法 ①菌落的制備:臨床分離的T.rubrum Y經(jīng)接種活化后，取適量菌落用生理鹽水配制成菌懸液，用無菌紗布濾過得孢子懸液，比濁儀比濁至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，用移液器?0μL分別接種于8個SDA培養(yǎng)盤中央，28℃培養(yǎng)9天，形成一定大小的菌落備用。②實驗分組:將上述8個已培養(yǎng)9天的SDA培養(yǎng)盤，每4個為一套，共2套，每套包括未照光組(對照組)、激光能量200 J/cm2組，400 J/cm2組、600 J/cm2組。③激光照射能量及方法:PinpointeTMFootlaserTM長脈沖治療儀(Nd:YAG 1064 nm激光)以200 J/cm2、400 J/cm2、600 J/cm2對上述兩套培養(yǎng)皿菌落進(jìn)行垂直照射，光斑直徑為3mm，脈寬30ms。脈沖頻率為1 Hz。未照激光組為平行對照組。照光時激光頭距離平皿約5 cm。激光束照射整個菌落，以螺旋狀移動，從周圍直至中心。每個菌落照射25～30個光斑，如此反復(fù)照3次。④生長曲線測定:其中一套培養(yǎng)皿于激光照射前即刻(作為第1天)、照射后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，于第2～9天，用相機(jī)拍攝菌落大小(培養(yǎng)盤放置于坐標(biāo)紙上，方便計數(shù))，之后用Photoshop 7.0軟件打開菌落圖像，分別計數(shù)菌落所占的像點數(shù)和坐標(biāo)紙小方格的像點數(shù)，二者之比乘以小方格的面積即為菌落生長的面積，未照光組作為對照組，分別計算每株菌的未照光組和不同能量激光照射組的菌落生長面積。此試驗重復(fù)3次。⑤超微結(jié)構(gòu)檢測:a.掃描電鏡樣品制備及觀察:從另一套激光照射后及未照射培養(yǎng)皿中分別挑取一小塊菌落，置于無菌的1.5 mL離心管中，4℃冰箱中以3%戊二醛固定2 h，PBS溶液洗3次，每次20 min，再浸泡于1%鋨酸溶液中，4℃下2 h左右；用30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇各脫水20 min，丙酮脫水3次，每次20 min，臨界點干燥，真空鍍膜，掃描電鏡觀察。b.透射電鏡樣品制備及觀察:樣品的固定、脫水處理等步驟同掃描電鏡，脫水處理后，環(huán)氧樹脂Epon812包埋，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 長脈沖Nd:YAG 1064 nm激光照射對T.rubrum Y菌落生長的影響 記錄紅色毛癬菌Y菌落于激光照射前即刻(第1天)及各能量激光照射后第2～9天的菌落面積，將菌落面積統(tǒng)計分析如表1所示，并繪制成生長曲線(圖1)。激光照射能量200 J/cm2時生長曲線幾乎與對照組生長曲線重合；激光照射能量400 J/cm2時，菌落生長曲線較對照組生長曲線下移，且在第9天時，菌落生長面積又恢復(fù)至與對照組相似；激光照射能量600 J/cm2時，照射后即刻，菌落面積減小，第2～9天，菌落生長面積不變，生長曲線呈直線趨勢，菌落停止生長。

圖1 不同能量激光照射對T.rubrum Y菌落生長的影響

2.2 激光照射對T.rubrum形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 T. rubrum Y菌落未照光時，在掃描電鏡下菌絲形態(tài)規(guī)則，粗細(xì)均勻、筆直細(xì)長，表面光滑飽滿，頂端和局部無膨大。透射電鏡下，菌絲橫切面超微結(jié)構(gòu)顯示菌絲壁為完整的雙層膜結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)密度均勻，內(nèi)見線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器。激光照射T.rubrum Y菌落后，掃描電鏡下，隨著激光照射能量的增加，菌絲表面變粗糙，可見大小不等的凹陷，菌絲萎縮、皺癟，局部可形成膨大(圖2)。透射電鏡下，隨著激光照射能量的增加，菌絲橫切面超微結(jié)構(gòu)顯示菌絲雙層細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不完整，胞質(zhì)密度不均，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊或溶解，可見空泡化、脂滴、髓樣小體、蛋白凝固體等，最后菌體可崩解、壞死(圖3)。

表1 不同能量激光照射前后T.rubrum Y的菌落面積

圖2 T.rubrum Y在不同能量激光處理組掃描電鏡下菌絲結(jié)構(gòu)(SEM，×8000)

圖3 T.rubrum Y不同劑量激光處理組透射電鏡(TEM)下菌絲橫切面超微結(jié)構(gòu)(×50 000)

3 討論

基于傳統(tǒng)口服抗真菌藥的肝腎毒性及耐藥率增高等弊端，近年來，國內(nèi)外學(xué)者嘗試應(yīng)用紫外線、光動力或激光治療作為甲真菌病的一種替代或補(bǔ)充治療。但紫外線照射治療有誘發(fā)照射部位基因突變的潛在危險性，限制了其應(yīng)用。2光動力療法需要將光敏劑外涂于甲板3～5 h后照光，治療時間長，操作復(fù)雜，患者依從性差。3近紅外線激光因波長較長，穿透力強(qiáng)，能量高，操作方便，治療時間短(每個病甲需要幾分鐘)，無誘發(fā)基因突變等優(yōu)點得到了學(xué)者們的認(rèn)可。國外多項研究已證實激光治療甲真菌病取得了較好的療效。4，5我們的前期臨床研究中，長脈沖Nd:YAG 1064 nm激光治療127例病甲，6個月隨訪總有效率約為60%。6

但激光治療甲真菌病的機(jī)制不清，目前依據(jù)各種激光在臨床應(yīng)用的探索，推測的可能機(jī)制主要包括7: (1)熱剝脫及熱分解效應(yīng):真菌細(xì)胞壁某些色素基團(tuán)可吸收特定波長的激光，將光能轉(zhuǎn)變成熱能，色素基團(tuán)崩解或氣化，從而破壞真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，菌體凋亡，達(dá)到治療目的；(2)熱休克致蛋白變性:通常多種真菌在特定溫度下(如超過40℃)可發(fā)生熱休克，某些蛋白變性或失活，這種熱效應(yīng)反復(fù)持續(xù)刺激，最終達(dá)到抑菌或殺菌的效應(yīng)；(3)活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)的氧化及細(xì)胞毒性作用；(4)激光對真菌的機(jī)械損傷作用。本研究中，長脈沖Nd:YAG 1064 nm激光體外照射臨床分離的T.rubrum Y菌落后，菌落在200 J/cm2處理組，菌落生長曲線與未行激光照射的對照組生長曲線幾乎重合，表明200 J/cm2激光能量不足以抑制T.rubrum Y菌落的生長。400 J/cm2處理組，T.rubrum Y菌落生長曲線較對照組生長曲線下移，說明可抑制T.rubrum Y菌落的生長。值得注意的是，激光照射后第2～8天菌落生長曲線下移，但至第9天時，菌落生長曲線上移至與對照組基本相同，這也許說明激光對T.rubrum Y菌落的抑制效應(yīng)可持續(xù)約1周，這種抑制效應(yīng)停止后，菌落可恢復(fù)正常生長。也為臨床工作中，病人激光治療間隔時間為1周提供了依據(jù)。Vural等8用幾種不同波長的激光對臨床分離的T.rubrum菌落進(jìn)行體外照射，發(fā)現(xiàn)Q開關(guān)Nd:YAG 1064 nm和Q開關(guān)Nd:YAG 532 nm激光對T.rubrum菌落生長具有抑制作用，我們的研究結(jié)果與此文獻(xiàn)報道一致。600 J/cm2處理組，照射后即刻，菌落周圍碳化，顏色變黑，照射后即刻菌落面積縮小，說明當(dāng)激光能量足夠大時，菌體發(fā)生了熱剝脫及熱崩解效應(yīng)，殘余菌落面積維持不變，菌落停止生長。菌落停止生長的原因有兩種可能:①激光能量高，直接殺滅真菌，菌體壞死。②高能量激光作用于培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基變性，不能提供真菌生長所需營養(yǎng)，導(dǎo)致菌體死亡?；谖覀冊陔婄R檢測菌絲超微結(jié)構(gòu)變化時，是將激光作用菌體后即刻標(biāo)本固定于3%戊二醛溶液中，因此可保留激光作用菌體后菌體即刻的形態(tài)結(jié)構(gòu)，結(jié)合600 J/cm2時，SEM和TEM下菌體表現(xiàn)為壞死，故考慮激光破壞真菌結(jié)構(gòu)，使菌體停止生長的可能性大。我們前期的臨床治療中，接受治療的病人病甲應(yīng)用的激光能量為288～324 J/cm2，上述體外實驗表明此激光能量為抑菌劑量，因此病人病甲治愈可能與患者連續(xù)4～8周每周接受1次治療，抑菌效應(yīng)反復(fù)持續(xù)發(fā)生達(dá)到治療作用有關(guān)，也可能與機(jī)體內(nèi)環(huán)境及免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。

本研究表明:激光照射抑制T.rubrum Y菌落生長的同時，也改變了菌體的超微結(jié)構(gòu)。在掃描電鏡下，菌絲的排列方式、菌絲表面的光滑度、菌絲的粗細(xì)及膨大等隨著激光照射能量的增加而改變。透射電鏡下激光照射破壞了菌絲壁的雙層膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)等，可見空泡化、脂滴，可見髓樣小體、蛋白凝固體等凋亡表現(xiàn)，以及菌體崩解壞死的影像，提示激光能量足夠時，不僅僅是抑制真菌生長，也可發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的殺滅真菌作用。Bornstein等7應(yīng)用雙波長(870 nm和930 nm)激光體外生理溫度下作用于紅色毛癬菌菌懸液，未照光組為對照組，孵育91 h后照光組紅色毛癬菌100%被殺死。以上研究均為激光治療甲真菌病提供了有力的客觀證據(jù)。

本研究中，對菌落面積的檢測，我們采用Photoshop軟件分析菌落所占的像點數(shù)和坐標(biāo)紙小方格的像點數(shù)，二者之比乘以小方格的面積即為菌落生長的面積，未照光組作為對照組，這種菌落面積的計算較傳統(tǒng)的測量菌落直徑的計算方法，更加可靠，具有說服力。在研究設(shè)計上，我們以未行激光照射的菌落為陰性對照，但沒有考慮到激光照射對培養(yǎng)基質(zhì)量的影響，應(yīng)在以后的研究中明確等量的紅色毛癬菌的菌懸液接種在激光照射的培養(yǎng)基和未行激光照射的培養(yǎng)基中，二者的生長曲線是否一致，從而明確激光照射是否對培養(yǎng)基的質(zhì)量產(chǎn)生了影響。

本研究中，不同能量激光照射后T.rubrum Y菌落的生長曲線趨勢與電鏡下菌體的超微結(jié)構(gòu)變化相輔相成，提示了激光照射對紅色毛癬菌的抑制或殺傷作用，但樣本有限，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

1余進(jìn)，李若瑜.國內(nèi)甲真菌病病原學(xué)的流行病學(xué)調(diào)查.中國真菌學(xué)雜志，2006，1(1):63－64.

2Dai T，Tegos GP，Rolz－Cruz G，etal.Ultraviolet C inactivation of dermatophytes:implications for treatment of onychomycosis. Br JDermatol，2008，158(6):1239－1246.

3 Sotiriou E，Koussidou T，Patsatsi A，et al.5－Aminolevulinic acid－photodynamic treatment for dermatophytic tinea pedis of interdigital type:a small clinical study.JEur Acad Dermatol Venereol，2009，23(2):203－204.

4 Hochman LG.Laser treatment of onychomycosis using a novel 0.65－millisecond pulsed Nd:YAG 1064－nm laser.JCosmet Laser Therapy，2011，13(1):2－5.

5ChoilMJ，Zheng Z，Goo B，etal.Antifungal effects of a1444－nm neodymium:Yttrium－aluminum－garnet laser on onychomycosis:a pilot study.JDermatolog Treat，2014，25(4):294－297.

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7 Bornstein E.A review of current research in light－based technologies for treatment of podiatric infections diseases states.J Am Podiatr Med Assoc，2009，99(4):348－352.

8Vural E，Winfield HL，Shingleton AW，et al.The effects of laser irradiation on Trichophyton rubrum growth.Lasers Med Sci，2008，23(4):349－353.

(收稿:2014－06－06 修回:2014－06－09)

Effect of long pulse Nd:YAG 1064 nm laser irradiation on the grow th and ultrastructural changes of trichophyton rubrum

ZHUO Feng-lin，ZHANG Rui-na，WANG li，et al.Department of Dermatology，Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050

Objective:To determine the effect of long pulse Nd:YAG 1064 nm laser irradiation on the growth and ultrastructural changes of richophyton rubrum Y(T.rubrum Y).Methods:Colonies of T.rubrum Y(same amount in each plate)was irradiated with long pulse Nd:YAG 1064 nm laser in different energy (0 J/cm2，200 J/cm2，400 J/cm2，600 J/cm2).The changes of colonies and growth curve after laser irradiation in day 1 to day 9 were observed.Themorphology of T.rubrum Y was observed under scanning electronmicroscope(SEM)and transmission electronmicroscope(TEM)images.Results:Growth of T.rubrum Y colonieswas inhibited following 400 J/cm2laser irradiation.The growth of T.rubrum Y colonieswas stopped after 600 J/cm2laser irradiation.Under SEM，T.rubrum Y hyphae become rough，fragmented，punctured with small destructive holes，shrunked and deflated.TEM images showed that the two layers of the cellwall disappeared or nonholonmic.The cytoplasmic membrane was discontinuous and myeloid body and small electron granuleswere found between retracted membrane and the cellwalls.In the cytoplasm，the cell organelleswere unclear.Hyphae of T.rubrum Y was disintegrated and necrosis following 600 J/cm2laser irradiation.Conclusion:These findings suggest that enough laser energy can inhibit or terminate the growth of T.rubrum colonies and change the ultrastructure of T.rubrum Y.

Long pulse Nd:YAG 1064 nm laser；Trichophyton rubrum Y

國家自然科學(xué)基金(編號:81301385)

首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項資助項目(編號:2011－1003－03)

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院皮膚科，北京，100050

?通信作者