細(xì)胞衰老相關(guān)基因MTMR2功能初探及相互作用蛋白的鑒定

李超群陳亞麗肖冬光裴華東，

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2. 北京蛋白質(zhì)組研究中心 蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

細(xì)胞衰老相關(guān)基因MTMR2功能初探及相互作用蛋白的鑒定

李超群1陳亞麗2肖冬光1裴華東1，2

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2. 北京蛋白質(zhì)組研究中心 蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老在腫瘤形成中有重要作用，為進(jìn)一步研究其內(nèi)在機(jī)制，通過(guò)全基因組shRNA文庫(kù)篩選出與之相關(guān)的MTMR2（Myotubularin-related protein 2）基因，并通過(guò)β-半乳糖苷酶染色試驗(yàn)證實(shí)其在H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老中發(fā)揮重要作用。通過(guò)克隆質(zhì)粒、表達(dá)純化并結(jié)合質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)了MTMR2的一個(gè)可能的重要相互作用蛋白14-3-3，并通過(guò)生化方法對(duì)兩者的相互作用進(jìn)行確認(rèn)。

過(guò)氧化氫 細(xì)胞衰老 MTMR2 shRNA文庫(kù)篩選 shRNA

細(xì)胞衰老是一種不可逆的生長(zhǎng)停滯狀態(tài)，與人類(lèi)衰老和腫瘤形成有著密切的關(guān)系［1］。體外培養(yǎng)的人體成纖維細(xì)胞（Human diploid fibroblasts，HDFs）像大部分體內(nèi)細(xì)胞一樣，在經(jīng)歷有限次的細(xì)胞分裂后便失去增殖能力，進(jìn)入復(fù)制性衰老狀態(tài)。衰老細(xì)胞的形態(tài)變化主要體現(xiàn)在細(xì)胞皺縮，膜通透性、脆性增加，核膜內(nèi)折，細(xì)胞器數(shù)量特別是線粒體數(shù)量減少，胞內(nèi)出現(xiàn)脂褐素等異常物質(zhì)沉積等。

多種應(yīng)激因素可以誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的發(fā)生，目前研究最廣泛的是癌基因相關(guān)的衰老，癌基因的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞的增殖及腫瘤的形成，也可誘導(dǎo)細(xì)胞趨向衰老，即癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老（Oncogeneinduced senescence，OIS），從而抑制腫瘤的形成［2］。細(xì)胞可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控OIS的發(fā)生。例如，癌基因可激活p16-Rb途徑，抑制E2F并最終導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯及OIS的發(fā)生。此外，癌基因的表達(dá)可激活A(yù)rf-p53途徑，引起細(xì)胞凋亡或OIS的發(fā)生。p53也可通過(guò)DNA損傷應(yīng)答（DNA damage response，

DDR）等不依賴于Arf的途徑而被激活，研究證實(shí)此過(guò)程同樣在OIS的發(fā)生中發(fā)揮重要作用［3］。當(dāng)前，對(duì)于過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老研究較少，H2O2常用于獲得短時(shí)間內(nèi)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老［4］。但是H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的具體分子機(jī)制仍不是很清楚。因此，深入研究H2O2誘導(dǎo)的衰老機(jī)理，篩選參與該過(guò)程的相關(guān)基因，對(duì)進(jìn)一步理解人類(lèi)的衰老和年齡相關(guān)性疾病的診斷治療具有重要意義。鑒于shRNA文庫(kù)技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于篩選參與某一信號(hào)通路或某一表型的基因［5］，本研究也采用shRNA文庫(kù)篩選H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞衰老過(guò)程中的相關(guān)基因，并對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)行生化分析，旨在為進(jìn)一步研究其內(nèi)在機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、文庫(kù)與細(xì)胞 帶有FLAG標(biāo)簽的真核表達(dá)載體pIRES為本實(shí)驗(yàn)室保存，人胚腎細(xì)胞293T和人胚肺成纖維細(xì)胞WI38均購(gòu)自ATCC。shRNA文庫(kù)購(gòu)自Dharmacon公司。MTMR2（Myotubularin-related protein 2）shRNA靶標(biāo)序列：5'-TCAGAGAATTCAGTGCATACA-3'。

1.1.2 主要試劑 DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；PEI轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；Flag標(biāo)簽抗體、Flag M2 Beads及H2O2溶液購(gòu)自Sigma（中國(guó)）；14-3-3蛋白抗體購(gòu)自Abcam（中國(guó)）；DNA快速純化回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Promega公司，酶切片段回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 文庫(kù)篩選 在293T細(xì)胞中將shRNA文庫(kù)包裝病毒后，收集病毒上清，感染W(wǎng)I38細(xì)胞，用100 μmol/L H2O2處理2 h后，恢復(fù)培養(yǎng)10 d至單細(xì)胞克隆形成，挑取培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出的單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增shRNA靶向序列，將PCR產(chǎn)物克隆到T載體，測(cè)序分析。

1.2.2 β-半乳糖苷酶染色 6孔板中培養(yǎng)WI38細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min。吸除細(xì)胞固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次3 min。 吸除PBS，每孔加入1 mL染色工作液［使用聚丙烯（polypropylene）容器配制染色工作液，染色工作液的配制方法參考試劑盒說(shuō)明書(shū)］。37℃孵育過(guò)夜，用Parafilm或保鮮膜封住6孔板防止蒸發(fā)。普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3 pIRES-MTMR2表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以cDNA文庫(kù)為模板，分別設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)為EcoR I 和Sal I的引物序列（下劃線部分為插入的酶切位點(diǎn)）：sense：5'-CCGGAATTCATGACAAATATGCAGAAGATTT-3'（EcoR I）；anti-sense：5'-ACGCGTCGACGGATGGAG AAGAGCTCGAGCTGCG-3'（Sal I），通過(guò)PCR擴(kuò)增MTMR2 編碼序列。PCR程序：94℃ 4 min；94℃ 40 s，60℃ 1 min，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化并用EcoR I和Sal I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，載體質(zhì)粒pIRES進(jìn)行同樣的雙酶切?；厥彰盖械钠魏唾|(zhì)粒經(jīng)T4連接酶過(guò)夜連接。最后連接體系轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和基因測(cè)序鑒定，重組質(zhì)粒命名為pIRES-Flag-MTMR2。

1.2.4 pIRES-Flag-MTMR2的表達(dá)純化與質(zhì)譜鑒定用轉(zhuǎn)染試劑PEI將pIRES-Flag-MTMR2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，24 h后將細(xì)胞從培養(yǎng)皿刮下，經(jīng)離心收集到EP管中，PBS洗2次，再用NETN 裂解液［20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.5% NP-40］進(jìn)行裂解，20 min后，離心收取上清，加入5×SDS loading buffer，100℃煮沸8 min，樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western blot檢測(cè)。若表達(dá)成功，則依上述步驟，轉(zhuǎn)染12個(gè)培養(yǎng)皿（直徑10 cm）293T細(xì)胞，收取總蛋白并加入80 μL的Flag Beads進(jìn)行IP純化，4℃緩慢旋轉(zhuǎn)孵育4 h，然后離心除去上清，將Flag Beads用NETN洗滌3次，最后在Flag Beads中加入60 μL的2×SDS loading buffer，100℃煮沸15 min。樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色和Western blot確認(rèn)后，剩余樣品再經(jīng)SDS-PAGE電泳，切膠后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.2.5 免疫印跡分析（Western blot） 將Flag-MTMR2蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，凝膠電泳結(jié)

束后，自上而下按照濾紙-膠-膜-濾紙的順序在半干轉(zhuǎn)移儀上放置好，轉(zhuǎn)膜30 min后將膜取出，放入5%脫脂奶粉，于脫色搖床搖蕩（75 r/min）封閉1 h以消除非特異背景。封閉完畢，加入anti-Flag的一抗，于脫色搖床4℃孵育（75 r/min）過(guò)夜，使一抗與特異蛋白結(jié)合?；厥找豢?，用TBST洗3次（75 r/min），每次5-10 min。加入二抗，于脫色搖床孵育1 h，使二抗與一抗結(jié)合。用TBST洗3次。最后加入ECL試劑，于暗室壓片曝光。

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn) 將WI38細(xì)胞接種于放有蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。細(xì)胞密度適中且完全貼壁，用4%多聚甲醛固定20 min，0.25% Triton X-100透膜15 min，用1% BSA封閉1 h，一抗室溫孵育1 h，熒光二抗室溫孵育1 h。取下蓋玻片，細(xì)胞面朝下放在滴有50%甘油PBS的載玻片上封片。熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 shRNA文庫(kù)篩選結(jié)果

經(jīng)基因組范圍的文庫(kù)篩選，發(fā)現(xiàn)一個(gè)基因MTMR2和H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老有關(guān)。如圖1所示，正常的WI38用100 μmol/L H2O2處理2 h，培養(yǎng)3 d后，用β-半乳糖苷酶染色試劑盒（Senescence β-Galactosidase Staining Kit）染色，能發(fā)現(xiàn)SA-β-Gal（Senescence-associated β-galactosidase）活性水平上調(diào)，表明許多細(xì)胞發(fā)生了衰老。而當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)入了靶向MTMR2的shRNA敲低MTMR2蛋白水平時(shí)，SA-β-Gal的活性水平顯著降低（圖1），此外，在過(guò)表達(dá)MTMR2的WI38細(xì)胞中，沒(méi)有觀察到SA-β-Gal活性水平的變化，這可能是因?yàn)閃I 38細(xì)胞內(nèi)源MTMR2的量已經(jīng)足夠使細(xì)胞衰老。以上結(jié)果表明，MTMR2與H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老緊密相關(guān)。

圖1 MTMR2 調(diào)控WI38細(xì)胞衰老

2.2 MTMR2 編碼基因的擴(kuò)增與表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒，利用EcoR I和Sal I 進(jìn)行酶切鑒定，雙酶切重組質(zhì)粒后產(chǎn)生一條線性載體條帶和一條約1 900 bp的目的條帶（圖2）。對(duì)于酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明插入的目的基因核苷酸序列完全正確。

圖 2 重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES-Flag-MTMR2 酶切分析

2.3 Flag-MTMR2的表達(dá)純化與質(zhì)譜分析

將重組質(zhì)粒pIRES-Flag-MTMR2轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后收集蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，分別用標(biāo)簽抗體anti-Flag和內(nèi)源抗體anti-MTMR2檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)。結(jié)果（圖3）顯示，F(xiàn)lag抗體檢測(cè)到Flag-MTMR2的表達(dá)，而MTMR2抗體則分別檢測(cè)到了內(nèi)源和外源MTMR2蛋白的表達(dá)，表明重組質(zhì)粒pIRES-Flag-MTMR2表達(dá)成功。

圖3 Flag-MTMR2融合蛋白的表達(dá)檢測(cè)

在重組蛋白成功表達(dá)的基礎(chǔ)上，在12盤(pán)（直徑10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿）293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pIRES-Flag-MTMR2，24 h后收集蛋白，使用Flag beads進(jìn)行IP純化，樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色和Western blot檢測(cè)Flag-MTMR2

蛋白的純化效果。結(jié)果（圖4）顯示，考馬斯亮藍(lán)染色和Western blot結(jié)果表明經(jīng)過(guò)IP純化，F(xiàn)lag-MTMR2主帶明顯，并結(jié)合許多相互作用蛋白。

圖4 純化后樣品的SDS-PAGE（A）及FLAG抗體檢測(cè)的Western blot檢驗(yàn)（B）

將確認(rèn)純化成功的樣品，再經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色后，切膠進(jìn)行質(zhì)譜分析，鑒定MTMR2的相互作用蛋白。結(jié)果表明，在質(zhì)譜結(jié)果中，除含有已經(jīng)確認(rèn)的MTMR2的一個(gè)相互作用蛋白SBF1（Myotubularin-related protein 5）之外，還發(fā)現(xiàn)了高豐度的14-3-3蛋白的4個(gè)亞基（表1）。據(jù)報(bào)道，14-3-3蛋白家族在真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)并高度保守，它通過(guò)介導(dǎo)或調(diào)解蛋白相互作用，在細(xì)胞周期、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要的作用。猜測(cè)MTMR2可能通過(guò)與14-3-3蛋白相互作用而在細(xì)胞衰老過(guò)程中發(fā)揮功能。

表1 Flag-MTMR2純化后的質(zhì)譜結(jié)果

2.4 MTMR2與14-3-3蛋白相互作用的驗(yàn)證

為進(jìn)一步確證MTMR2與14-3-3蛋白的相互作用，首先在WI38細(xì)胞中通過(guò)免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證14-3-3蛋白與MTMR2的定位關(guān)系，發(fā)現(xiàn)二者可以共定位（圖5）。此外，通過(guò)內(nèi)源的免疫共沉淀試驗(yàn)檢測(cè)它們之間的相互作用，結(jié)果（圖6）顯示，當(dāng)用MTMR2的抗體做免疫沉淀時(shí)，能共沉淀下來(lái)14-3-3 蛋白的θ亞基，表明在細(xì)胞內(nèi)MTMR2能夠與14-3-3 蛋白的θ亞基相互作用，而MTMR2與14-3-3蛋白其它亞基的相互作用，仍需進(jìn)一步的試驗(yàn)確證。

圖5 免疫熒光技術(shù)證明14-3-3蛋白與MTMR2蛋白共定位

圖6 內(nèi)源免疫共沉淀試驗(yàn)證明14-3-3 θ亞基與MTMR2相互作用

3 討論

H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老一直是人們研究的熱點(diǎn)，有報(bào)道指出H2O2處理IMR90細(xì)胞會(huì)使抑癌蛋白p53表達(dá)水平短暫增高，細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑p21表達(dá)水平持續(xù)增強(qiáng)以及抑癌蛋白R(shí)b的去磷酸化［6］。也有文獻(xiàn)報(bào)道H2O2通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1的表達(dá)水平影響細(xì)胞衰老［7］。

本試驗(yàn)利用H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老模型，通過(guò)shRNA文庫(kù)篩選，鑒定了1個(gè)可能與細(xì)胞衰老相關(guān)的基因MTMR2。MTMR2是肌微管素蛋白家族的一員，可以編碼一種酪氨酸磷酸酶［8］，據(jù)報(bào)道，MTMR2可以將底物PI-3-P和PI-3，5-P2分別去磷酸化成為磷脂酰肌醇和PI-5-P，并且在AKT通路中發(fā)揮重要的作用，MTMR2的過(guò)表達(dá)可以抑制表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的降解，促進(jìn)AKT的持續(xù)激活［9］。該基因的突變會(huì)導(dǎo)致4B型進(jìn)行性腓骨肌萎縮，這是一種常染色體隱性脫髓鞘神經(jīng)病［10］。也有報(bào)道該

蛋白可能與DNA損傷修復(fù)相關(guān)［11］。目前，人們對(duì)該蛋白的了解仍然很少。我們通過(guò)質(zhì)譜并結(jié)合生化試驗(yàn)鑒定到MTMR2的一個(gè)可能的重要相互作用蛋白14-3-3，而14-3-3蛋白家族在真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)并高度保守，通過(guò)識(shí)別磷酸化的蘇氨酸/絲氨酸而與靶蛋白結(jié)合［12］。14-3-3蛋白可以（1）作為接頭分子誘導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用［13］；（2）調(diào)節(jié)蛋白的亞細(xì)胞定位［14］；（3）激活或抑制酶的活性［15］。通過(guò)這些功能進(jìn)而影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、細(xì)胞應(yīng)激等許多生命活動(dòng)，這對(duì)我們進(jìn)一步研究MTMR2在細(xì)胞衰老中的功能以及H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的分子機(jī)制具有重要指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)shRNA文庫(kù)篩選，鑒定了1個(gè)可能與H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老相關(guān)的基因MTMR2，并對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其重要的相互作用蛋白，為深入研究H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的內(nèi)在機(jī)制提供了新的方向。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

MTMR2 Interacts with 14-3-3 and Regulates H2O2Induced Cell Senescence

Li Chaoqun1Chen Yali2Xiao Dongguang1Pei Huadong1，2
（1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory Industial Microbiology College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457；2. State Key Laboratory of Proteomics，Beijing Proteome Research Center，Beijing 100850）

H2O2-induced cell senescence plays an important role in tumorigenesis. To further study the underlying mechanism, we identified five relevant members through a genome wide shRNA screening and took MTMR2（Myotubularin-related protein 2） as an example to figure out its function in H2O2-induced cell senescence. By plasmid construction and expression in combination with purification and mass spectrometry, we found a significant interacting protein of MTMR2：14-3-3 proteins family, and their interaction was then confirmed using biochemical methods.

H2O2Cell senescence MTMR2 shRNA pool screening shRNA

2014-04-22

李超群，男，碩士研究生，研究方向：DNA損傷修復(fù)；E-mail：BPRC_LI@126.com

裴華東，男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：DNA損傷修復(fù)與腫瘤細(xì)胞代謝；E-mail：peihuadong@hotmail.com肖冬光，男，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：現(xiàn)代釀造技術(shù)和微生物資源開(kāi)發(fā)；E-mail：xdg@tust.edu.cn