毒素蛋白基因mazF在基因修飾系統(tǒng)中的應(yīng)用進(jìn)展

石楊董會娜張大偉

（1.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072；2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

毒素蛋白基因mazF在基因修飾系統(tǒng)中的應(yīng)用進(jìn)展

石楊1，2董會娜2張大偉2

（1.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072；2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

毒素-抗毒素系統(tǒng)（Toxin-antitoxin system，TA系統(tǒng)）存在于大部分細(xì)菌中。mazEF是大腸桿菌中一種毒素-抗毒素系統(tǒng)。毒素基因mazF編碼的MazF毒素蛋白可以特異性地剪切自由mRNA的ACA序列，從而抑制蛋白合成、引起細(xì)胞生長停滯；近些年，許多學(xué)者利用mazF基因作為反向篩選標(biāo)記對不同種微生物建立了無標(biāo)記或無痕的基因修飾系統(tǒng)，并實(shí)現(xiàn)了不同菌株的基因組修飾。主要綜述了大腸桿菌mazF基因作為反向篩選基因的應(yīng)用原理及其在不同種類微生物的基因修飾系統(tǒng)中的應(yīng)用進(jìn)展，然后對mazF基因及其他毒素基因在基因修飾系統(tǒng)中的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

mazF 毒素蛋白基因 反向篩選標(biāo)記 基因修飾方法

近年來，隨著后基因組學(xué)研究（如基因組簡化工程、反向代謝工程和合成生物學(xué)）的快速發(fā)展，人們更加需要簡單高效的遺傳操作工具來對多基因進(jìn)行修飾以研究分子生物學(xué)機(jī)制?；蛐揎椣到y(tǒng)中常用的方法包括位點(diǎn)特異性重組（FRT/Flp、Cre/lox等）［1，2］，嘌呤代謝基因或代謝途徑中相關(guān)基因及其他阻遏蛋白基因和啟動子作為反向篩選標(biāo)記的操作方法［3-6］等。但位點(diǎn)特異性重組會在修飾的基因處留有疤點(diǎn)（Scar），而以嘌呤代謝基因或代謝途徑中相關(guān)基因?yàn)榉聪蚝Y選標(biāo)記的方法需要在基因組上缺失特定的基因才能發(fā)揮作用。mazF基因作為反向篩選標(biāo)記在基因修飾系統(tǒng)中應(yīng)用可以克服上述方法的缺點(diǎn)，因此，它作為新的分子改造工具，越來越廣泛地被用于多種微生物的遺傳改造中。本文對mazF基因在基因修飾系統(tǒng)中的作用機(jī)理和應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并對其應(yīng)用進(jìn)行了展望。

1 mazF的作用機(jī)理

mazEF是一類研究最為廣泛，作用機(jī)理鑒定最為清晰的毒素-抗毒素系統(tǒng)（TA系統(tǒng)），Ⅱ類TA分類系統(tǒng)根據(jù)同源性分為6個組，分別為：kid家族（kid/kis、toxiN、mazEF、ccdAB和ydcDE），relE家族（relBE、yoeB/yefM、mqsAR和parDE），doc家族（phD/doc），vapC家族（vapBC、fitAB），hipA家族（hipAB、pezAT）和ξ家族（ξ/ε），mazEF屬于kid

家族［7］。mazF基因是TA系統(tǒng)mazEF的下游基因，編碼穩(wěn)定的毒素蛋白。MazF是一種不依賴于核糖體的mRNA干擾酶（核糖核酸內(nèi)切酶），能在特異的序列位點(diǎn)切割單鏈的mRNA，并且在大多數(shù)微生物和一些古生菌種中具有保守性。大腸桿菌的MazF蛋白最早被發(fā)現(xiàn)，隨后學(xué)者們發(fā)現(xiàn)了一系列具有不同mRNA切割位點(diǎn)的MazF結(jié)構(gòu)類似物和其他的mRNA干擾酶。目前，鑒定的MazF結(jié)構(gòu)類似物能夠特異性的在3或5或7個堿基的特定序列處切割mRNA［8］。

大腸桿菌的MazF能識別ACA序列并水解其第一個A位點(diǎn)5'或3'端的磷酸二酯鍵，從而抑制被剪切斷裂的mRNA上核糖體的釋放和蛋白的合成［9］。此后，異常編碼的多肽被釋放，并被胞內(nèi)蛋白酶降解，繼而造成細(xì)胞死亡。MazE抗毒素蛋白形成特殊構(gòu)象后，能識別并結(jié)合MazF毒素蛋白而使MazF失去毒性。相比5個堿基或7個堿基的特定序列，3個堿基的特定序列在基因中出現(xiàn)的概率更大。大腸桿菌的MazF蛋白能夠裂解幾乎所有的mRNA，但是仍然有一些mRNA能夠抵抗MazF，這些mRNA或者不含ACA序列或者其中的ACA序列被mRNA形成的二級結(jié)構(gòu)保護(hù)而避免被MazF切割［10］。

大腸桿菌的MazF蛋白的作用機(jī)理研究得最為清楚，過表達(dá)或誘導(dǎo)表達(dá)MazF蛋白可以抑制蛋白的合成進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，在其他種類的微生物中mazF亦能發(fā)揮毒性作用，從而在遺傳修飾系統(tǒng)中被用作能夠致死的反向篩選標(biāo)記。

2 mazF在基因修飾系統(tǒng)中的應(yīng)用

在宿主細(xì)胞中表達(dá)MazF，不但能引起E.coli的細(xì)胞程序性死亡，同樣也可以引起其他原核生物，如芽孢桿菌、梭桿菌和真核生物如畢赤酵母的程序性死亡［11-13］。MazF蛋白能在不同種類的微生物中發(fā)揮作用的前提，是編碼這些菌株生長和存活的必須蛋白的mRNA上含有ACA序列。目前，mazF基因作為分子改造工具，在微生物的遺傳改造中已有廣泛地應(yīng)用。mazF篩選盒（mazF-cassette）構(gòu)成如圖1所示，共3部分，分別為：正向篩選基因（一般為抗性基因）及其啟動子（Selectable gene和P）；毒素蛋白啟動子的抑制蛋白基因；毒素蛋白基因和常用誘導(dǎo)表達(dá)型啟動子，如Pspac和Pxyl。此方法在不同的微生物中應(yīng)用時，需要把篩選盒中的正向篩選基因和控制mazF表達(dá)的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)替換為在該宿主菌種發(fā)揮作用的正向篩選基因和表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)。

圖 1 mazF篩選盒示意圖

2.1 mazF在芽孢桿菌屬中的應(yīng)用

2006 年，Zhang等［14］首次用大腸桿菌（E.coli）的mazF基因在芽孢桿菌屬（Bacillus species）中建立了一種普適無標(biāo)記的基因修飾系統(tǒng)。在此基因修飾系統(tǒng)中受異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)的啟動子Pspac、mazF及奇霉素（Spectomycin）抗性基因一起構(gòu)成了MazF篩選盒（圖2-A），Pspac受IPTG的誘導(dǎo)而啟動mazF的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。其兩側(cè)是兩個直接重復(fù)序列（Directly-repeated，DR）。線性的質(zhì)粒與基因組發(fā)生雙交換同源重組，mazF表達(dá)盒被整合到基因組的目的位點(diǎn)上。獲得的重組菌菌株對IPTG敏感，有奇霉素抗性。然后，兩個DR片段發(fā)生單交換同源重組，MazF篩選盒被刪除，重組后菌株對IPTG有抗性，對奇霉素敏感。此方法可以將需要的遺傳改變引入到基因組上而不引入任何篩選標(biāo)記。

這種方法也有一定的缺陷：首先，這種基于克隆基因修飾方法需要約2周時間；其次，在枯草芽孢桿菌（B. subtilis）中［15］spac表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)效率低，在缺乏誘導(dǎo)物時會產(chǎn)生泄露表達(dá)［16-18］。mazF顯著的泄露表達(dá)會造成自發(fā)突變的MazF抗性突變株累積，降低分離篩選得到目的突變菌株的陽性率。

隨后，Morimoto等［19］將IPTG誘導(dǎo)的Pspac系統(tǒng)與高保真融合PCR方法結(jié)合建立了一種新方法。他們設(shè)計了與mazF篩選盒相結(jié)合的雙交換序列和一個用于刪除篩選盒的單交換序列。這個方法成功地刪除了長度從8.5 kb到128 kb不等的序列。與Zhang等［14］的方法相比，這個操作過程可以在更短的時間內(nèi)完成。然而此法仍有其局限性，如少量的泄露表達(dá)，4.0 kb PCR融合片段會增加DNA突變的概率而且不同的基因片段組裝也有一定的難度。

啟動子PxylA受木糖阻遏蛋白XylR的抑制。當(dāng)木糖出現(xiàn)時，XylR離開操縱子序列，PxylA被激活。巨大芽孢桿菌（B. megaterium）的xyl操縱子是一個特別嚴(yán)謹(jǐn)?shù)霓D(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)。Yu等［20］把mazF基因放在B. megaterium的啟動子PxylA之后，mazF受木糖誘導(dǎo)表達(dá)（圖2-B）。在B. subtilis基因組上引入突變的無標(biāo)記基因修飾方法。此方法中mazF基因受來自B. megaterium的xyl表達(dá)系統(tǒng)的調(diào)控。因B. megaterium的xyl表達(dá)系統(tǒng)嚴(yán)格進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，且有更高的誘導(dǎo)效率，相對于spac表達(dá)系統(tǒng)具有顯著的優(yōu)越性［18，21］。但需要融合長約3.9 kb的片段和抗mazF的自發(fā)突變菌株的產(chǎn)生仍是這種方法的不足。

有文獻(xiàn)報道B. subtilis的啟動子Pxyl也具有嚴(yán)格的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［22，23］。而且B. subtilis W23的啟動子Pxyl顯示比B. megaterium的Pxyl啟動子有更高的誘導(dǎo)/表達(dá)效率（246-279倍/150-200倍）［16，18］。Lin等［24］構(gòu)建的“mini-mazF-cassette”篩選盒（圖2-C），其包含B. subtilis的啟動子Pxyl，mazF和微型的博萊霉素（Zeocin）抗性基因。用此篩選盒成功地敲除了amyE基因、一個90 kb的基因簇和一個綠色熒光蛋白基因。mini-mazF-cassette可以重復(fù)的對多個基因或基因簇進(jìn)行操作，而且融合片段只有2-2.5 kb，這就可以減小PCR帶來的核酸突變頻率。Lin的方法比上述兩種mazF-cassettes的轉(zhuǎn)化效率高3倍，而且所有克隆中有超過95%的菌株都能丟掉篩選盒，而Yu的方法中只有50%［20］。

本課題組在改造B.subtilis基因組時嘗試應(yīng)用upp基因（編碼尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶，催化5-氟尿嘧啶生成5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸而使菌體致死）和mazF基因?yàn)榉聪蚝Y選標(biāo)記，初步結(jié)果表明以mazF為反向篩選標(biāo)記方法有陽性率更高的優(yōu)勢。upp基因作為反向篩選標(biāo)記時需失活出發(fā)菌的upp基因，使其能在含有5-氟尿嘧啶的基本培養(yǎng)基上生長，而mazF作為反向篩選標(biāo)記時對出發(fā)菌的背景就無要求（數(shù)據(jù)未發(fā)表），且試驗(yàn)周期相比較短。

2.2 mazF在畢赤酵母中的應(yīng)用

Yang等［12］用大腸桿菌的mazF作為反向篩選基因在甲醇營養(yǎng)型酵母——畢赤酵母中建立了一種無標(biāo)記基因修飾方法。mazF的表達(dá)受甲醇誘導(dǎo)型啟動子PAOX1控制，畢赤酵母中MazF被誘導(dǎo)表達(dá)后終止細(xì)胞的生長。他們構(gòu)建了一個模塊化質(zhì)粒，mazF和博萊霉素抗性基因分別作為反向篩選標(biāo)記和正向篩選標(biāo)記，其中的mazF-ZeoR表達(dá)框的兩側(cè)包含CYCl TT同向重復(fù)重組位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)（圖2-D）。通過模塊化質(zhì)?？梢詷?gòu)建引入基因修飾的遞送質(zhì)粒。將遞送質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母，通過同源重組將基因修飾引入畢赤酵母基因組。用博萊霉素篩選出基因改造的菌株，再用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)MazF，通過CYCl TT同向重復(fù)重組位點(diǎn)之間同源重組實(shí)現(xiàn)遺傳標(biāo)記的再利用。應(yīng)用這種方法，研究者在不引入篩選標(biāo)記的情況下，實(shí)現(xiàn)了畢赤酵母ARG1和MET2基因的敲除，一個綠色熒光蛋白表達(dá)盒的敲入和ARG1基因的定點(diǎn)突變。這種方法可以使篩選標(biāo)記基因重復(fù)用于多個基因修飾。

2.3 mazF在梭菌屬中的應(yīng)用

梭菌屬是產(chǎn)孢子的革蘭氏陽性細(xì)菌，屬于厚壁菌門。這個屬的成員是專性厭氧菌，包含許多有醫(yī)學(xué)和商業(yè)價值的重要菌株。但分離得到基于等位基因交換產(chǎn)生的基因替換突變菌株仍然是這些重要菌株應(yīng)用的主要限制。

Dong等［25］發(fā)現(xiàn)mazF基因在丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）中也可發(fā)揮反篩選作用，此發(fā)現(xiàn)對丙酮丁醇梭菌的基因操作工具的開發(fā)有一定的促進(jìn)作用。mazF基因的誘導(dǎo)表達(dá)可以用于ClosTron系統(tǒng)中便攜質(zhì)粒的固化從而使基因失活，或者用于同源重組基因敲除方法中快速篩選雙交換突變株［26］。Al-Hinai等［27］報道了一種利用可誘導(dǎo)的反向篩選標(biāo)記的基因修飾方法，此方法無需營養(yǎng)缺陷型突變株或者應(yīng)用可移動的II類內(nèi)含子，就可快速高效的在基因組的任意位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)無標(biāo)記的DNA缺失和整合。這個方法中將來自大腸桿菌的經(jīng)密碼子優(yōu)化的mazF毒素基因放在來自產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）的乳糖誘導(dǎo)型啟動子Pgal之后。啟動子Pgal控制MazF的表達(dá)，可在含乳糖和抗生素的固體培養(yǎng)基上直接篩選出目的基因被刪除的突變株。進(jìn)而作者又建立了一個可誘導(dǎo)可隔離的不穩(wěn)定質(zhì)粒系統(tǒng)可以使編碼硫霉素抗性的基因快速缺失，即結(jié)合FLP-FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)［28］

（圖2-E），在質(zhì)粒上下游同源臂內(nèi)的抗性標(biāo)記基因兩側(cè)加上了FRT序列。重組完成后，通過在突變株中表達(dá)FLP重組酶剔除抗性基因，以便該抗性基因可被繼續(xù)用作篩選標(biāo)記。該方法既可實(shí)現(xiàn)基因敲除亦可實(shí)現(xiàn)外源基因在染色體上的敲入。大多數(shù)梭菌屬菌種的基因組有相似的低G+C含量和類似的密碼子使用率，因此這個系統(tǒng)有可能應(yīng)用到這些菌株中。但該方法會在刪除基因的位置留下一段FRT疤痕（Scar），并未真正實(shí)現(xiàn)基因無痕刪除。隨著基因敲除數(shù)量的增加，染色體上的FRT疤痕會隨之增多，當(dāng)有FLP重組酶存在時，可能引起這些FRT短序列之間的重組，從而造成非預(yù)期的基因序列缺失。故在一定程度上限制了這種方法的應(yīng)用。

2.4 mazF在藍(lán)藻細(xì)菌中的應(yīng)用

藍(lán)藻菌集胞藻屬是光合生物，能有效的集合光能同時利用環(huán)境中的CO2。集胞藻屬有兩個主要的變種，一個變種（認(rèn)為是野生型，WT）只能光合自養(yǎng)生長，第二個變種（葡萄糖耐受型菌，GT）既可光合自養(yǎng)也可進(jìn)行光合異養(yǎng)生長。GT型集胞藻屬可以利用來自枯草芽孢桿菌的sacB基因作為反向篩選標(biāo)記，但WT型不可以，因?yàn)閟acB編碼的果聚糖蔗糖酶可將蔗糖轉(zhuǎn)化為果聚糖將WT型細(xì)胞殺死。

Cheah等［29］建立了一種新的可用于GT和WT型集胞藻屬基因修飾方法。研究者用集胞藻屬自有的鎳響應(yīng)系統(tǒng)（nrs）來控制mazF的表達(dá)。此響應(yīng)系統(tǒng)在Ni2+的濃度很低（約0.5 μmol/L）時就可以被誘導(dǎo)表達(dá)［30］。鎳響應(yīng)系統(tǒng)由nrsBACD操縱子和其上游的兩個基因nrsR和nrsS組成。nrsBACD操縱子主要將細(xì)胞質(zhì)中額外的Ni2+泵出，nrsS和nrsR分別響應(yīng)Ni2+和誘導(dǎo)啟動子PnrsB啟動轉(zhuǎn)錄［31］。受NrsR誘導(dǎo)的啟動子PnrsB位于nrsR和nrsBACD操縱子的間隔區(qū)。NrsR、NrsS和啟動子PnrsB被用來驅(qū)動mazF的表達(dá)?？敲顾乜剐曰颍╝phII）作為正篩選標(biāo)記放在mazF的下游，形成mazF/aphII篩選盒（圖2-F）。此方法中應(yīng)用了兩個質(zhì)粒，一個含有篩選盒和目的基因的上下游同源臂；另一個則只含有特定基因的上下游同源臂。通過第一次同源重組，第一個質(zhì)粒與基因組發(fā)生基因交換將篩選盒整合到基因組的特定位點(diǎn)，利用卡那霉素抗性篩選正確的菌株。第二次同源重組是第二個質(zhì)粒與第一步篩選到的菌株的基因組進(jìn)行基因交換，用Ni2+篩選出彈掉篩選盒的菌株。此方法成功的用于slr1609基因的部分敲除和PHB（聚-β-羥基丁酸）合成基因（slr1993和slr1994）的完全敲除，也可將其他基因整合入特定的位點(diǎn)。此方法有可能應(yīng)用于能進(jìn)行同源重組的藍(lán)藻細(xì)菌和藻類等的基因修飾。

圖2 mazF篩選盒示意圖［14，20，24，12，27，29］

3 其他毒素蛋白基因在基因修飾系統(tǒng)中的應(yīng)用

除了mazEF外，ccdAB也是II類TA系統(tǒng)中研究和應(yīng)用較多的毒素-抗毒素系統(tǒng)之一。ccdAB來自于F質(zhì)粒，最初用于大腸桿菌中篩選陽性轉(zhuǎn)化子［32］。CcdB蛋白通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II的一個亞基旋轉(zhuǎn)酶A來殺死細(xì)胞，CcdA蛋白可以解除CcdB蛋白的毒性活性。商用系統(tǒng)StabyCloningTM，StabyExpressTM和Delphi Genetics SA都是基于CcdB蛋白的毒性作用而使質(zhì)粒穩(wěn)定的保存。其應(yīng)用方式有兩種：一種是將ccdB基因整合到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)。獲得的質(zhì)粒

在缺少CcdA蛋白的情況下，其毒性可以殺死細(xì)菌。當(dāng)在多克隆位點(diǎn)插入外源DNA片段后，ccdB失活，重組質(zhì)粒不能產(chǎn)生CcdB蛋白，從而不會影響宿主細(xì)胞的生存。這種用于重組克隆的正篩選方法非常有效，并且簡化了克隆程序。另一種是在基因組上整合ccdB基因，當(dāng)含有ccdA的目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，細(xì)胞生存，而未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的細(xì)胞則會因?yàn)镃cdB蛋白的毒性作用而死亡。隨后，研究者用來自質(zhì)粒R1的毒素蛋白Gabant［33］和質(zhì)粒RK2的ParE［34］研發(fā)了相似的技術(shù)。

燦爛弧菌（Vibrio splendidus）是海水中一種具有優(yōu)勢培養(yǎng)的弧菌，與一些海洋動物的死亡密切相關(guān)。但是菌株中編碼致病蛋白的基因卻知之甚少。牡蠣病原菌（V. splendidus）LGP32菌株的全基因組測序?yàn)橥ㄟ^候選基因的破壞而解密毒性蛋白提供了可能。Le等［35］構(gòu)建了一種新的自殺質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含依賴pir的R6K復(fù)制起始位點(diǎn)以及由啟動子PBAD控制的來自質(zhì)粒F的ccdB基因。其起始位點(diǎn)可以通過基于RP4的接合作用轉(zhuǎn)移到任何弧菌。該自殺質(zhì)粒通過兩步等位基因替換作用可以將特定的基因敲除。首先，等位基因兩端的任何一端均可與基因組發(fā)生等位交換，通過氯霉素篩選，選出正確整合菌株。然后，用含阿拉伯糖的培養(yǎng)基進(jìn)行第二步篩選，只有菌株中帶有PBAD-ccdB的質(zhì)粒被重組掉后才能夠在含阿拉伯糖的培養(yǎng)基上生長。該方法可以有效的在燦爛弧菌和霍亂弧菌（Vibrio cholerae）中進(jìn)行無痕等位基因替換。

ccdB和parE基因等毒素基因在微生物篩選中開發(fā)應(yīng)用較早較多，但是其在微生物的基因修飾方面應(yīng)用卻非常有限。這些毒素基因是非常有效的反向篩選標(biāo)記，若將其應(yīng)用到基因修飾方面，相信會發(fā)展出許多高效、準(zhǔn)確的無標(biāo)記基因修飾方法，豐富分子操作工具，極大地提高遺傳操作的速度和效率。

4 毒素蛋白基因作為反向篩選標(biāo)記的基因修飾策略

毒素蛋白基因（如mazF、ccdB）作為反向篩選基因應(yīng)用于微生物基因修飾系統(tǒng)中是通過同源重組實(shí)現(xiàn)的?；蛐揎棽呗灾饕謨刹竭M(jìn)行，第一步將整合片段插入到微生物的染色體上；第二步將篩選標(biāo)記剔除。整合片段可以以質(zhì)粒形式通過單交換或雙交換同源重組整合到染色體上或者以融合PCR片段形式通過雙交換同源重組整合到染色體上。篩選標(biāo)記的剔除可以通過同源DNA片段或者直接重復(fù)片段進(jìn)行重組而實(shí)現(xiàn)。以敲除為例，圖3-圖5分別為不同基因修飾策略的示意圖。這些修飾策略實(shí)現(xiàn)了無痕敲除和篩選盒的再利用，即可以進(jìn)行特定基因或大片段基因的敲除，亦可以進(jìn)行基因點(diǎn)突變和相關(guān)基因的敲入。對于不同的微生物菌種應(yīng)選用合適的策略。

圖3 雙交換，通過down片段同源重組實(shí)現(xiàn)的基因敲除

圖4 單交換，通過up或down片段實(shí)現(xiàn)的基因敲除

毒素蛋白基因作為反向篩選基因應(yīng)用于微生物基因修飾系統(tǒng)應(yīng)滿足以下要求：（1）基因修飾系統(tǒng)的目標(biāo)菌株中編碼其生長和存活的必須蛋白的mRNA應(yīng)含有ACA序列，即保證MazF蛋白能夠正

常發(fā)揮作用；（2）目標(biāo)菌種中有能夠發(fā)揮作用的正向篩選的抗性基因和可選用的誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，以便第一步的正向篩選和mazF的誘導(dǎo)表達(dá)。

圖5 雙交換，通過DR片段同源重組實(shí)現(xiàn)的基因敲除

5 結(jié)語

近年來，在分子操作工具研究方面取得了較大進(jìn)展，研究人員開發(fā)出了一系列用于基因中斷、敲除和敲入的新方法和新工具。mazF作為反向篩選標(biāo)記不僅可用于操作手段成熟的菌株（如枯草芽孢桿菌、畢赤酵母等），使其遺傳操作更加快捷和精準(zhǔn)，而且也可用于操作手段不完善的菌株（如梭菌、藍(lán)藻等）的分子水平改造及遺傳學(xué)方面的基礎(chǔ)性研究。mazF等反向篩選標(biāo)記的運(yùn)用推進(jìn)了微生物遺傳操作的發(fā)展。反向篩選能夠?qū)е抡狭朔聪蚝Y選基因的微生物死亡。經(jīng)過這樣的處理，不僅篩選更為容易，而且沒有引入標(biāo)記基因，這使得基因的連續(xù)操作成為可能?；谝陨戏治觯瑸榱双@得操作更簡便，篩選效率更高，通用性更強(qiáng)的基因修飾系統(tǒng)，可從幾方面進(jìn)行升級和改進(jìn)。第一，進(jìn)一步優(yōu)化現(xiàn)有的基于毒素蛋白基因的遺傳操作方法或結(jié)合其他的基因修飾系統(tǒng)，降低假陽性出現(xiàn)的概率，提高篩選效率。第二，開發(fā)其他TA系統(tǒng)中通用性更好的毒素蛋白基因作為反向篩選標(biāo)記，建立新的通用性更強(qiáng)的基因修飾系統(tǒng)和方法。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Application Progress of mazF Gene in Genetic Modification System

Shi Yang1，2Dong Huina2Zhang Dawei2
（1. School of Pharmaceutical Science and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072；2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Science，Tianjin 300308）

Toxin-antitoxin system（TA）exists in most of the genetic material of bacteria. mazEF is a kind of toxin-antitoxin system in E. coli. MazF encoded by mazF is an mRNA interferase that specifically cleaves free mRNAs at ACA sequences, resulting in inhibited protein synthesis and cell growth arrest. Recently, some scholars have used mazF as a counter-selection marker in genetic modification systems, and achieved modifications of the genome in various strains. In this article, the research advances of E. coli mazF used as counter-selection marker in bacterial genetic modification were reviewed, followed by application of other toxin gene. Finally, perspective of the possible new pathways for developing new genetic modification methods were addressed.

mazF Toxin gene Counter-selection marker Genetic modification method

2014-03-27

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31200036，31370089），天津市科技支撐計劃重點(diǎn)項(xiàng)目（12ZCZDSY12700，11ZCZDSY08500）

石楊，男，碩士研究生，研究方向：枯草芽孢桿菌代謝途徑的改造；E-mail：yun1986feiyang@sina.com

張大偉，男，博士，研究員，研究方向：微生物代謝工程和芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)；E-mail：zhang_dw@tib.cas.cn