夫西地酸生產(chǎn)菌復(fù)合誘變育種及發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究

張 佳，閆 敬，戴 夢(mèng)，任志紅

（華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050015）

夫西地酸是由丹麥利奧制藥公司于1962年首次從脂球真菌（Fusidium coccineum fungus）中提取出來的。夫西地酸在國(guó)外廣泛應(yīng)用50余年，對(duì)多種細(xì)菌敏感但卻極少出現(xiàn)耐藥［1－2］，具有其它抗生素所沒有的抑菌殺菌和抗炎免疫調(diào)節(jié)的雙重特性。其獨(dú)特的抗菌機(jī)理是：通過干擾延長(zhǎng)因子G、阻斷核糖體易位來抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成［3］，從而避免與其它抗生素的交叉耐藥性［4］。

作者在此采用常壓室溫等離子體（ARTP）射流誘變和紫外（UV）照射對(duì)夫西地酸生產(chǎn)菌進(jìn)行復(fù)合物理誘變［5］，并針對(duì)高產(chǎn)突變菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基碳、氮源的均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化［6］，以更有效地提高夫西地酸產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株與培養(yǎng)基

出發(fā)菌株FA－30，自行保存。

分離與斜面培養(yǎng)基：酵母粉0.6%，麥芽粉2%，葡萄糖0.6%，碳酸鈣2%，瓊脂2%，pH值7.0。

活化培養(yǎng)基：酵母粉0.6%，麥芽粉2%，葡萄糖0.6%，碳酸鈣2%，pH值7.0。

母瓶培養(yǎng)基：葡萄糖1%，糊精2%，七水合硫酸鎂0.1%，磷酸氫二鉀0.06%，蛋白胨0.5%，酵母粉0.6%，碳酸鈣0.2%，pH值7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：糊精1.8%，花生餅粉1.5%，蛋白胨0.5%，氯化銨0.3%，七水合硫酸鎂0.3%，硫酸鉀0.6%，碳酸鈣1%，pH值7.2。

1.2 方法

1.2.1 種子斜面培養(yǎng)

將保存的出發(fā)菌株液氮管轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基，25℃下培養(yǎng)7d后備用。

1.2.2 常壓室溫等離子體射流誘變與紫外照射復(fù)合誘變

將出發(fā)菌株斜面以無菌蒸餾水10mL刮下孢子制成孢子液，用玻璃珠打散后取10μL涂布于直徑為0.5cm的不銹鋼反應(yīng)鋼片上，反應(yīng)距離為2mm，注入氦氣（流量10L·min－1），100W處理5min。然后用1mL無菌蒸餾水洗滌鋼片，將所得菌液接入10mL活化培養(yǎng)基25℃下活化24h后，以過濾吸管取4mL活化菌孢子液進(jìn)行紫外誘變（誘變條件為15W、36 cm、1min），將紫外誘變后的孢子液稀釋，以不同梯度涂布于分離培養(yǎng)基平皿中，25℃下培養(yǎng)5～7d。

1.2.3 斜面與搖瓶培養(yǎng)

用接種針挑選單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基，25℃下培養(yǎng)7d后將斜面上的孢子接種于母瓶培養(yǎng)基中，于25℃、220r·min－1搖床培養(yǎng)36h。待母瓶長(zhǎng)成后以5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25℃、220r ·min－1搖床培養(yǎng)120h后，放瓶，采用高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵效價(jià)（μg·mL－1），挑選相對(duì)高產(chǎn)菌株。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基碳、氮源的優(yōu)化

針對(duì)篩選得到的高產(chǎn)菌株，運(yùn)用均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳、氮源進(jìn)行優(yōu)化。以糊精、花生餅粉、蛋白胨、氯化銨為基礎(chǔ)碳、氮源，考察不同碳、氮源對(duì)相對(duì)發(fā)酵效價(jià)（基于出發(fā)菌株FA－30）的影響，以得到更加優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基配方。應(yīng)用軟件為均勻設(shè)計(jì)V4.0。

2 結(jié)果與討論

2.1 誘變育種結(jié)果

夫西地酸生產(chǎn)菌經(jīng)常壓室溫等離子體射流誘變與紫外照射復(fù)合誘變后自分離培養(yǎng)皿中得到276個(gè)菌落，接斜面后，經(jīng)多次搖瓶篩選得到3株高產(chǎn)突變菌株AU－15、AU－37、AU－88，平均發(fā)酵效價(jià)較出發(fā)菌株FA－30提高14%，其中突變菌株AU－37的發(fā)酵效價(jià)提高17%。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

針對(duì)誘變篩選得到的突變高產(chǎn)菌株AU－37進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化。以糊精（X1）、花生餅粉（X2）、蛋白胨（X3）、氯化銨（X4）為自變量，相對(duì)發(fā)酵效價(jià)（Y）為因變量，進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表1。

采用最優(yōu)回歸子集法得到相對(duì)發(fā)酵效價(jià)（Y）與4個(gè)因素的回歸方程：Y＝31.3418829＋153.8538016 X1－426.4993159 X3－62.9280683 X21＋267.2214172 X1X3＋556.6651815 X22－176.6655414 X23，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9988。

對(duì)回歸方程的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。

表1 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的因素與水平／%Tab.1 Factors and levels of uniform design experiment／%

表2 方差分析Tab.2 Analysis of variance

由表2可知，P值和相關(guān)系數(shù)R2值均在合理范圍，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，說明方程擬合度高，具顯著意義。

糊精、花生餅粉、蛋白胨、氯化銨對(duì)相對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響見圖1。

圖1 糊精（a）、花生餅粉（b）、蛋白胨（c）、氯化銨（d）對(duì)相對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響Fig.1 Effects of dextrin（a），peanut cake powder（b），peptone（c）and ammonium chloride（d）on relative fermentation potency

由圖1可知：糊精、蛋白胨均在實(shí)驗(yàn)選取范圍內(nèi)得到最優(yōu)解；花生餅粉對(duì)相對(duì)發(fā)酵效價(jià)有明顯的促進(jìn)作用，但由于花生餅粉含量過高會(huì)使發(fā)酵液過于黏稠，不建議繼續(xù)增大濃度，即選擇最大值作為最優(yōu)解；氯化銨對(duì)相對(duì)發(fā)酵效價(jià)影響最小，直接選取最大值作為最優(yōu)解。因此，所得最優(yōu)解為：X1＝1.8609%、X2＝ 2.5000%、X3＝0.3000%、X4＝0.5000%，此時(shí)Y＝139.85532%。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化配方的驗(yàn)證

按照均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)得到的優(yōu)化配方進(jìn)行3批平行實(shí)驗(yàn)，其相對(duì)發(fā)酵效價(jià)分別為112.2%、116.7%、114.3%，平均相對(duì)發(fā)酵效價(jià)為114.4%，即發(fā)酵效價(jià)較用初始配方發(fā)酵的突變菌株AU－37提高14.4%，較出發(fā)菌株FA－30提高33.8%。且指標(biāo)優(yōu)于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中任一配方。

最終得到的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化配方為：糊精1.86%、花生餅粉2.5%、蛋白胨0.3%、氯化銨0.5%、七水合硫酸鎂0.3%、硫酸鉀0.6%、碳酸鈣1%、pH值7.2。

3 結(jié)論

利用常壓室溫等離子體射流誘變和紫外照射對(duì)夫西地酸生產(chǎn)菌株FA－30進(jìn)行復(fù)合誘變，經(jīng)多次篩選得到了較出發(fā)菌株發(fā)酵效價(jià)提高17%的突變菌株AU－37，并采用均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，得到優(yōu)化配方為：糊精1.86%、花生餅粉2.5%、蛋白胨0.3%、氯化銨0.5%、七水合硫酸鎂0.3%、硫酸鉀0.6%、碳酸鈣1%、pH值7.2。AU－37以此配方進(jìn)行發(fā)酵的發(fā)酵效價(jià)較初始配方提高14.4%，較出發(fā)菌株FA－30提高33.8%，表明，常壓室溫等離子體射流誘變和紫外照射復(fù)合誘變是選育夫西地酸高產(chǎn)菌株的有效手段，而將此手段與均勻設(shè)計(jì)相結(jié)合，可以使菌種選育效率最大化。

［1］ COLLIGNON P，TURNIDGE J.Fusidic acid in vitro activity［J］.Int J Antimicrob Agents，1999，12（S1）：45－58.

［2］ TURNIDGE J.Fusidic acid pharmacology，pharma cokinetics and pharmacodynamics［J］.Int J Antimicrob Agents，1999，12（S2）：23－34.

［3］ 陸一鳴，望亭松.夫西地酸國(guó)外應(yīng)用現(xiàn)狀及進(jìn)展［J］.中國(guó)感染控制雜志，2002，（1）：71－74.

［4］ WILKINSON J D.Fusidic acid in dermatology［J］.Br J Dermatol，1998，139（S 53）：37－40.

［5］ 龐德欽，周蓬蓬，魯明波，等.等離子體－紫外線復(fù)合誘變選育高產(chǎn)谷胱甘肽酵母菌［J］.生命科學(xué)研究，2007，11（3）：238－241.

［6］ 關(guān)亞鵬，婁忻，張莉，等.均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化咪唑立賓發(fā)酵培養(yǎng)基配方［J］.中國(guó)抗生素雜志，2008，33（8）：471－473.