拳參黃酮與VC、蘆丁協(xié)同抗氧化作用研究

劉軍軍，劉金蘭，李 帥，安紅鋼，吳冬青

（河西學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅張掖734000）

拳參（Polygonum bistorta L.）別名紫參、倒根草、地蝦，為蓼科屬（Polygonaceae）植物拳參的根莖，其味苦澀，性微寒，具有清熱解毒、止瀉、鎮(zhèn)驚息風(fēng)、消腫止血之功效，用于赤痢、熱瀉、肺熱咳嗽、癰腫、瘰疬、口舌生瘡、吐血、痔瘡出血、毒蛇咬傷等病癥［1］，主要分布于河南、吉林、山東、遼寧、四川、甘肅等地。近年有文獻(xiàn)報(bào)道從拳參中分離得到?jīng)]食子酸、樹(shù)膠、樹(shù)脂、酚酸等活性成分，并對(duì)拳參黃酮進(jìn)行了純化和抗氧化性研究［2－5］。

不同藥物復(fù)配后可產(chǎn)生相加性、協(xié)同性或拮抗性等相互作用。目前研究復(fù)配效應(yīng)的方法有等輻射分析法、分?jǐn)?shù)分析法、概率分析法和響應(yīng)曲面分析法等［6］。其中等輻射分析法是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外常用于判斷藥物之間相互作用的方法，能夠簡(jiǎn)便、精確地對(duì)藥物之間的相互作用進(jìn)行定性、定量分析［7－8］。有研究表明，復(fù)合抗氧化劑的抗氧化活性高于單個(gè)組分在添加濃度下的活性之和，即表明組分之間存在協(xié)同抗氧化作用［9］，可使產(chǎn)品更高效、更經(jīng)濟(jì)、更具安全性，且抗氧化性能得到改善［10］。作者在此采用Isobologram分析和清除·DPPH法相結(jié)合的方法對(duì)拳參黃酮與VC、蘆丁的協(xié)同抗氧化作用進(jìn)行了考察，以期為拳參的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

拳參，2013年采自甘肅隴西。

蘆丁（生化試劑，批號(hào)F20040304），醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；·DPPH（生化試劑，批號(hào)1898－66－4），梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；抗壞血酸（VC）、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇等均為分析純。

WFJ－2100型可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司；RE－2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；HH－4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 拳參黃酮溶液的制備

取拳參干燥藥材粉碎，過(guò)50目篩，以料液比1∶10（g∶mL）加入60%乙醇，在40℃下超聲提取1h，抽濾，濾液濃縮，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中用60%乙醇定容，冷藏備用。

1.2.2 拳參黃酮質(zhì)量濃度的測(cè)定［11］

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：準(zhǔn)確稱(chēng)取已烘干至恒質(zhì)量的蘆丁0.0235g，用60%乙醇溶解并定容至100mL，得0.2350mg·mL－1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確移取1.00 mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于25mL容量瓶中，分別加入5% NaNO2溶液1.00mL，搖勻，靜置6min；加入10% Al（NO3）3溶液1.00mL，搖勻，靜置6min；加入5% NaOH溶液10.00mL，用60%乙醇定容，搖勻，靜置15min后，在500nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以蘆丁濃度（c）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，擬合得到回歸方程：A＝11.079c－0.029，R2＝0.9999，線(xiàn)性范圍為0.0094～0.0564mg·mL－1。

2）移取0.10mL拳參黃酮溶液于25mL容量瓶中，按照上述方法測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算拳參黃酮質(zhì)量濃度。

1.2.3 拳參黃酮清除·DPPH能力測(cè)定［12］

移取不同濃度的拳參黃酮溶液1.00mL，用50%乙醇補(bǔ)加至4.00mL，再加0.1mg·mL－1的·DPPH溶液1.00mL，搖勻，靜置，室溫避光反應(yīng)30min，然后于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A1；空白組以等體積無(wú)水乙醇代替·DPPH溶液，測(cè)定吸光度A2；對(duì)照組以等體積50%乙醇代替樣品溶液，測(cè)定吸光度A0；以VC、蘆丁為陽(yáng)性對(duì)照組。按式（1）計(jì)算拳參黃酮對(duì)·DPPH的清除率：

1.2.4 Isobologram分析法研究拳參黃酮與VC、蘆丁的相互作用［13］

根據(jù)VC、蘆丁、拳參黃酮單獨(dú)作用時(shí)的IC50值，選擇拳參黃酮與VC、蘆丁的比例（質(zhì)量濃度比，下同），將拳參黃酮與VC或蘆丁按上述比例混合后，按1.2.3方法測(cè)定復(fù)合抗氧化劑對(duì)·DPPH的清除能力，計(jì)算清除率和IC50mix值。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析［13］

對(duì)藥物之間相互作用關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。按式（2）計(jì)算IC50add：

式中：IC50add、IC50a分別為理論復(fù)配組、a藥單獨(dú)作用時(shí)的IC50值；Pa、Pb分別為a、b在復(fù)配組中所占的比例；R為a、b兩種抗氧化劑單獨(dú)使用時(shí)的效價(jià)比，即R＝IC50a／IC50b。

由實(shí)驗(yàn)得到復(fù)配組實(shí)際的IC50mix值，對(duì)IC50add和IC50mix進(jìn)行顯著性比較：如果IC50add顯著小于IC50mix，表明藥物之間具有拮抗作用；如果IC50add顯著大于IC50mix，表明藥物之間具有協(xié)同作用；如果IC50add與IC50mix無(wú)顯著差異，表明兩者具有相加作用。無(wú)論是協(xié)同作用還是相加作用，兩者都可以有效指導(dǎo)人們?cè)谟盟帟r(shí)減少藥物的浪費(fèi)，充分利用各自?xún)?yōu)點(diǎn)取長(zhǎng)補(bǔ)短。

進(jìn)一步按式（3）計(jì)算相互作用指數(shù)（γ），以評(píng)價(jià)協(xié)同、相加或拮抗作用的程度：若γ＝1，表示兩者之間為相加作用；γ＞1，表示拮抗作用，且γ值越大拮抗作用越強(qiáng)；γ＜1，表示協(xié)同作用，且γ值越小協(xié)同作用越強(qiáng)（置信度P＝0.95）。

2 結(jié)果與討論

2.1 拳參黃酮的質(zhì)量濃度

進(jìn)行5組平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得提取溶液中拳參黃酮質(zhì)量濃度為4.095mg·mL－1，RSD為1.364%。

2.2 拳參黃酮對(duì)·DPPH的清除能力

·DPPH是一種人工合成的單電子、以氮為中心的化合物，向其中加入抗氧化成分時(shí)，·DPPH接受1個(gè)電子，溶液紫色變淺，且褪色程度與抗氧化劑質(zhì)量濃度呈線(xiàn)性關(guān)系［14－15］。測(cè)定拳參黃酮、VC、蘆丁對(duì)·DPPH的清除能力，結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。

圖1 拳參黃酮、VC和蘆丁清除·DPPH能力Fig.1 The ability of scavenging·DPPH of flavonoids fromPolygonum bistorta L.，VC and rutin

表1 拳參黃酮、VC、蘆丁清除·DPPH的IC50值Tab.1 IC50Values of scavenging·DPPH of flavonoids fromPolygonum bistorta L.，VC and rutin

由圖1可知，隨著樣品質(zhì)量濃度的增大，三種溶液對(duì)·DPPH的清除率均呈上升趨勢(shì)，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，拳參黃酮對(duì)·DPPH的清除作用強(qiáng)于蘆丁、弱于VC。

由表1可知，清除·DPPH能力大小依次為：VC＞拳參黃酮＞蘆丁，說(shuō)明拳參黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

2.3 Isobologram分析法評(píng)價(jià)拳參黃酮與VC、蘆丁協(xié)同抗氧化能力

2.3.1 拳參黃酮與VC、蘆丁復(fù)配清除·DPPH能力

基于拳參黃酮與VC、蘆丁的IC50比值分別為1∶1.54、1∶0.77，選擇拳參黃酮與VC或蘆丁的比例為3∶1、1∶1、1∶3，每組的質(zhì)量濃度范圍為0.005000～0.035000mg·mL－1。按照上述比例混合后，按1.2.3方法測(cè)定復(fù)合抗氧化劑對(duì)·DPPH的清除率并計(jì)算其IC50mix，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表2 拳參黃酮與VC、蘆丁復(fù)配清除·DPPH的能力Tab.2 The ability of scavenging·DPPH of flavonoids fromPolygonum bistorta L.combined with VC or rutin

由表2可知，隨著復(fù)合抗氧化劑濃度的增大，清除·DPPH的能力逐漸增強(qiáng)，復(fù)合抗氧化劑達(dá)到一定濃度后清除率基本保持不變。

由表3可知，拳參黃酮分別與VC、蘆丁復(fù)配后的IC50mix值大小均為3∶1＜1∶1＜1∶3，表明拳參黃酮與VC、蘆丁的質(zhì)量濃度比為3∶1時(shí)復(fù)配抗氧化效果最佳。

2.3.2 拳參黃酮與VC、蘆丁復(fù)配后的Isobologram分析

表3 拳參黃酮與VC、蘆丁復(fù)配清除·DPPH的IC50mix值和γ值Tab.3 IC50mixandγValues of flavonoids fromPolygonum bistorta L.combined with VC or rutin against·DPPH

將實(shí)驗(yàn)所得VC、蘆丁的IC50值及95%可信線(xiàn)標(biāo)繪于橫坐標(biāo)，拳參黃酮的IC50值及95%可信線(xiàn)標(biāo)繪于縱坐標(biāo)，將IC50值連接成相加線(xiàn)，繪制95%置信區(qū)，并繪入復(fù)配體系的IC50值，結(jié)果見(jiàn)圖2。若復(fù)配體系的效應(yīng)點(diǎn)落在相加線(xiàn)及95%置信區(qū)內(nèi)，表示兩藥為相加作用；若落在相加線(xiàn)左側(cè)，表示兩藥為協(xié)同作用；若落在右側(cè)，則表示兩藥為拮抗作用。

由圖2可知，拳參黃酮與VC、蘆丁復(fù)配后的效應(yīng)點(diǎn)均在相加線(xiàn)及置信區(qū)左側(cè)，說(shuō)明兩藥之間均存在協(xié)同抗氧化作用。

2.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

拳參黃酮與VC、蘆丁復(fù)配體系的IC50add值、IC50mix值和相互作用指數(shù)γ見(jiàn)表3。

由表3可知，兩組復(fù)配體系的IC50mix都顯著小于IC50add，兩者之間存在著差異，γ值都小于1，進(jìn)一步說(shuō)明拳參黃酮與VC、蘆丁以不同比例復(fù)配之后，其抗氧化能力均比它們單獨(dú)作用時(shí)強(qiáng)，相互間存在良好的協(xié)同抗氧化作用，尤其是拳參黃酮與VC、蘆丁質(zhì)量濃度比為3∶1時(shí)，協(xié)同抗氧化作用最好。由于拳參黃酮與VC復(fù)配體系的IC50mix均小于拳參黃酮與蘆丁復(fù)配體系的IC50mix，因此，拳參黃酮與VC復(fù)配體系的協(xié)同抗氧化作用強(qiáng)于拳參黃酮與蘆丁復(fù)配體系。

3 結(jié)論

拳參黃酮與VC、蘆丁以不同比例復(fù)配后有明顯的協(xié)同抗氧化作用，比任一單獨(dú)使用效果更好。當(dāng)拳參黃酮與VC、蘆丁的質(zhì)量濃度比為3∶1時(shí)，協(xié)同抗氧化能力最強(qiáng)，且拳參黃酮與VC的協(xié)同抗氧化作用要強(qiáng)于拳參黃酮與蘆丁的協(xié)同抗氧化作用。

圖2 拳參黃酮與VC（a）、蘆?。╞）復(fù)配后的Isobologram分析圖Fig.2 Isobolographic plot of flavonoids fromPolygonum bistorta L.combined with VC（a）or rutin（b）

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