人乙醛脫氫酶2的原核表達(dá)及條件的優(yōu)化

黃 娟，張小驥，劉傳青，向玲娟，陳孝平，吳元欣

（武漢工程大學(xué)綠色化工過程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430073）

當(dāng)人過量飲酒時(shí)，酒精的代謝產(chǎn)物乙醛不能及時(shí)被氧化，就會(huì)在體內(nèi)積累，容易誘發(fā)肝癌［1］，同時(shí)會(huì)損傷機(jī)體細(xì)胞，加速人體衰老。因此，乙醛的清除對(duì)于細(xì)胞的保護(hù)意義重大，人體主要依靠乙醛脫氫酶（包括ALDH1和ALDH2）來完成。酒精在體內(nèi)的代謝過程為乙醇→乙醛→乙酸［2］，乙醛脫氫酶參與酒精的代謝過程時(shí)，通過將酒精的代謝產(chǎn)物乙醛轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水［3］，從而減少體內(nèi)乙醛的含量。由于ALDH2對(duì)乙醛的活性是ALDH1活性的50倍［4］，因此肝臟細(xì)胞中的ALDH2對(duì)于乙醛的清除極為重要［5］。

目前，商品化的乙醛脫氫酶主要是從動(dòng)物肝臟的肝細(xì)胞線粒體中提取，資源很有限且價(jià)格昂貴，大規(guī)模生產(chǎn)困難［6］。為此，科研工作者試圖通過微生物發(fā)酵來大量獲取乙醛脫氫酶。研究發(fā)現(xiàn)，畢氏酵母分泌表達(dá)ALDH2時(shí)，由于表達(dá)過程中酵母的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，ALDH2雖然得到表達(dá)，但分泌的蛋白失活現(xiàn)象嚴(yán)重［7］，活性很低甚至無生物活性。趙錦等［8］也嘗試在酵母中表達(dá)乙醛脫氫酶，分離純化后的人乙醛脫氫酶液的酶活為0.994U·mL－1。裘麗珍［9］利用原核表達(dá)系統(tǒng)得到大量的乙醛脫氫酶，但都是沒有活性的包涵體，通過變性復(fù)性得到的蛋白活性也很低。作者所在實(shí)驗(yàn)室在前期工作中利用原核表達(dá)系統(tǒng)得到大量的乙醛脫氫酶，大部分也是以包涵體的形式存在，不利于后序的工藝流程。在此，嘗試?yán)脦诤系鞍讟?biāo)簽GST的載體pGEX－4T－1來提高目的蛋白ALDH2的可溶性表達(dá)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

宿主菌E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3），質(zhì)粒PUC57－ALDH2、質(zhì)粒pGEX－4T－1，自行保存；限制性內(nèi)切酶SalⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、XhoⅠ、T4DNA連接酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，TaKaRa公司；SDS、TEMED，Sigma公司；丙烯酰胺、N，N－亞甲基雙丙烯酰胺，天更生物公司。

細(xì)菌裂解液：0.2mol·L－1NaCl，1mmol·L－1EDTA，25mmol·L－1Tris－HCl，pH值8.0。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g·L－1，酵母浸粉5g ·L－1，氯化鈉10g·L－1。

1.2 原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將質(zhì)粒PUC57－ALDH2和表達(dá)載體pGEX－4T－1分別用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，用低熔點(diǎn)膠回收酶切產(chǎn)物后，再用T4DNA連接酶16℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α，轉(zhuǎn)化的菌種涂布于含氨芐青霉素的平板，培養(yǎng)12h后挑取單菌落，用煮沸法挑選重組質(zhì)粒，再進(jìn)行酶切鑒定及DNA測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化

將純化的重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－ALDH2轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的平板，挑取陽性單菌落接種于3～5mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)12h，然后以1∶100比例接種到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200r·min－1培養(yǎng)至OD600＝0.6時(shí)，分別加入終濃度為0mmol· L－1、0.1mmol·L－1、0.5mmol·L－1、1.0mmol· L－1的IPTG誘導(dǎo)3h，收集菌體離心，用10%SDSPAGE電泳檢測(cè)。

為得到較多的可溶性目的蛋白，采取了降低溫度和降低IPTG濃度的方法：28℃下，分別用0mmol· L－1、0.05mmol·L－1、0.1mmol·L－1、0.5mmol· L－1的IPTG誘導(dǎo)10h后收集菌體。將收集的菌體重懸于預(yù)冷細(xì)菌裂解液中，超聲破碎25min（超聲破碎儀功率300W，開2s，停4s），再于4℃、1 200r· min－1離心30min，分別取上清和沉淀進(jìn)行10%SDSPAGE電泳，分析表達(dá)產(chǎn)物的可溶性。

2 結(jié)果與討論

2.1 原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

圖1 PUC57－ALDH2和pGEX－4T－1酶切鑒定Fig.1 Enzyme identification of PUC57－ALDH2and pGEX－4T－1

將質(zhì)粒PUC57－ALDH2用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示有1 500 bp的目的條帶（圖1）。將含有目的基因的DNA片段定向插入經(jīng)SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切的含有融合蛋白標(biāo)簽GST的pGEX－4T－1表達(dá)載體（圖1）中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－ALDH2（圖2）。在含有氨芐青霉素的平板上挑取單菌落過夜搖菌，用煮沸法提取質(zhì)粒進(jìn)行凝膠電泳，初步鑒定為陽性的克隆過夜搖菌提取質(zhì)粒，分別用SalⅠ和EcoRⅠ、EcoRⅠ和EcoRⅤ進(jìn)行雙酶切，切出與預(yù)期大小一樣的條帶（圖3）。將驗(yàn)證的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序分析，與NCBI上公布的ALDH2序列一致，表明重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－ALDH2構(gòu)建成功。

圖2 pGEX－4T－1－ALDH2重組質(zhì)粒Fig.2 The recombinant plasmid pGEX－4T－1－ALDH2

圖3 重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－ALDH2酶切鑒定Fig.3 Enzyme identification of pGEX－4T－1－ALDH2

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化結(jié)果

按1.3方法進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，10%SDSPAGE電泳分析結(jié)果見圖4。

圖4 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的SDS－PAGE分析Fig.4 SDS－PAGE Analysis of fusion protein expressed

由圖4可知，沒有誘導(dǎo)的菌體蛋白未出現(xiàn)目的條帶，而經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體蛋白在81kDa均出現(xiàn)目的條帶。這是因?yàn)椋d體上融合蛋白標(biāo)簽GST的分子量約為26kDa，目的蛋白ALDH2的分子量約為55 kDa，因此表達(dá)的蛋白分子量約為81kDa。此外，隨著IPTG濃度的增大，目的蛋白的表達(dá)量也相應(yīng)增加。

按1.3方法進(jìn)行目的蛋白可溶性表達(dá)條件的優(yōu)化，結(jié)果見圖5。

圖5 目的蛋白可溶性表達(dá)條件的優(yōu)化Fig.5 Optimization of soluble expression of the purpose protein

由圖5可知，28℃下，以終濃度0.1mmol·L－1的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)10h，得到可溶性的目的蛋白約占總蛋白的25%，是目的蛋白可溶性表達(dá)的最優(yōu)條件。

2.3 討論

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是生物技術(shù)和生物制藥領(lǐng)域的常用工具，具有培養(yǎng)周期短、成本低、目的蛋白表達(dá)量高的優(yōu)點(diǎn)。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，大部分表達(dá)載體采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制目的基因的表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能控制基因在特定時(shí)期、特定部位表達(dá)，既避免了目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)對(duì)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，又可減少菌體蛋白酶對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的降解。

pGEX－4T－1是一種廣泛采用的原核高效表達(dá)載體，其上帶有融合蛋白標(biāo)簽GST，專為可誘導(dǎo)的、高效表達(dá)外源基因并使其成為融合蛋白而設(shè)計(jì)。融合蛋白谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和外源基因一同表達(dá)，不僅能增加融合表達(dá)蛋白的可溶性，而且在保護(hù)融合蛋白免受蛋白酶降解時(shí)也起著重要作用。誘導(dǎo)表達(dá)出的重組蛋白可以很容易地用谷胱甘肽親和層析介質(zhì)分離純化。但標(biāo)簽蛋白會(huì)在一定程度上影響目的蛋白的生物活性，所以需要將其切下，可用有特異氨基酸識(shí)別位點(diǎn)的蛋白酶Thrombin進(jìn)行切除。

融合蛋白的加入雖然能在一定程度上增加目的蛋白的可溶性，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示可溶性蛋白僅占總蛋白的25%左右。研究發(fā)現(xiàn)，在低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體。低溫和低濃度IPTG的條件可以降低大腸桿菌的代謝量，從而使目的蛋白得以緩慢表達(dá)，形成具有一定空間結(jié)構(gòu)和一定生物活性的蛋白。因此，為了得到可溶性的乙醛脫氫酶，本研究在低溫（28℃）下，利用不同濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，以優(yōu)化目的蛋白可溶性表達(dá)的條件。

3 結(jié)論

目的基因與載體通過雙酶切后連接，再轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α，成功構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX－4T－1－ALDH2。再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，用SDS－PAGE電泳檢測(cè)分析，結(jié)果顯示重組蛋白得到大量表達(dá)。對(duì)可溶性表達(dá)條件進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)在28℃下，以0.1mmol·L－1IPTG誘導(dǎo)表達(dá)10h可得到部分可溶性的重組蛋白。由于大腸桿菌大量表達(dá)融合蛋白，目的蛋白大部分還是以包涵體的形式存在，仍需進(jìn)一步優(yōu)化可溶性表達(dá)的條件。

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