納米金比色法在酶活力測(cè)定中的應(yīng)用進(jìn)展

趙靈芝，張小清，苗延青，鄧文婷，胡 顥

（西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西西安710021）

酶是與人體所有生命活動(dòng)相關(guān)的系列生化反應(yīng)的高效催化劑。酶活力受多種因素的調(diào)控，與有害毒素、酶激活劑或酶抑制劑的篩選以及相關(guān)的病理學(xué)研究密切相關(guān)，因此酶可應(yīng)用于靶向性治療方法的開(kāi)發(fā)［1－2］。目前常用的酶活力測(cè)定方法主要有分光光度法、熒光法、同位素法等，存在檢測(cè)靈敏度低、易產(chǎn)生非特異性干擾等問(wèn)題。近年來(lái)，納米金因具有局域表面等離子共振效應(yīng)的光學(xué)特征和良好的生物相容性，已被廣泛應(yīng)用于生理活性物質(zhì)的分析中，包括DNA、氨基酸、蛋白質(zhì)、金屬離子等［3－6］。Mirkin等［7］基于納米金溶液在聚集和解聚集過(guò)程中的顏色變化，以納米金為探針，開(kāi)拓性地完成了肉眼可視化分析寡聚核苷酸的可視化檢測(cè)方法。研究者基于納米金所呈現(xiàn)的顏色與其粒子尺寸或其聚集狀態(tài)之間的依賴(lài)關(guān)系發(fā)展了多種以納米金為探針的比色測(cè)定法，其中納米金比色法在酶活力測(cè)定中的應(yīng)用進(jìn)展較快［8－25］。

作者在此綜述了納米金比色法的應(yīng)用原理及其在酶活力測(cè)定、酶抑制劑篩選等方面的研究進(jìn)展，并對(duì)今后的研究趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

1 納米金比色法的應(yīng)用原理

納米金顆粒呈現(xiàn)的顏色與金顆粒的尺寸、間距、表面電荷和介質(zhì)鹽濃度密切相關(guān)?；诿复呋孜锇l(fā)生生化反應(yīng)前后所引起納米金聚集狀態(tài)的變化，納米金比色法用于酶活力測(cè)定的原理大致有兩種［8］：一是通過(guò)酶的加入或酶催化反應(yīng)引入連接劑，使納米金從分散狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫奂癄顟B(tài)（圖1a）；二是改變納米金表面電荷或酶切納米金表面的連接劑，使納米金從聚集狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚顟B(tài)（圖1b）。

圖1 納米金比色法酶活力檢測(cè)原理示意圖［8］Fig.1 Principles of gold nanoparticles in colorimetric detection of enzyme activity［8］

按引起納米金聚集方式的不同，比色法測(cè)定酶活力可分為交聯(lián)作用引起的聚集變化和非交聯(lián)作用引起的聚集變化。用于比色法檢測(cè)的裸納米金，一般是表面修飾檸檬酸的納米金顆粒，在一定的鹽濃度下，溶液中異種電荷的離子中和納米金顆粒表面的電荷，使相鄰納米金顆粒的間距縮小，發(fā)生不可逆聚集，進(jìn)而促使納米金的顏色由酒紅色向藍(lán)紫色轉(zhuǎn)變。如對(duì)納米金表面進(jìn)行功能化修飾，可改變其表面電荷，從而改變納米金在特定鹽溶液中的聚集狀態(tài)，這是基于非交聯(lián)作用（non－crosslinking aggregation）的鹽效應(yīng)的納米金比色法。而在納米金表面修飾特異性識(shí)別分子［如：生物素（biotin）］，當(dāng)靶物質(zhì)親和素（avidin）加入時(shí)即可識(shí)別，從而促使納米金聚集，這是基于交聯(lián)作用（crosslinking aggregation）的納米金比色法。

2 納米金比色法在酶活力測(cè)定中的應(yīng)用

2.1 基于交聯(lián)作用的納米金比色法

基于交聯(lián)作用的納米金比色法一般使用功能化的納米金作探針，將分子識(shí)別元件連接在納米金表面，通過(guò)酶的加入或酶催化反應(yīng)引入連接劑，從而使納米金從分散狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫奂癄顟B(tài)。

Wang等［9］發(fā)展了cAMP依賴(lài)型蛋白激酶A（the cAMP－dependent protein kinase A，PKA）和鈣調(diào)素依賴(lài)型蛋白激酶Ⅱ（the calmodulin－dependent kinaseⅡ，CaM KⅡ）2種酶活力測(cè)定和3種抑制劑篩選的方法，檢測(cè)原理（圖2）是基于酶催化底物磷酸化，將生物素嫁接到納米金表面，以表面修飾生物素的納米金作為探針1、修飾親和素的納米金作為探針2，通過(guò)生物素與親和素的特異性識(shí)別，納米金粒子發(fā)生交聯(lián)聚集而呈現(xiàn)藍(lán)色。當(dāng)酶抑制劑存在時(shí)，生物素就不能嫁接至納米金表面從而造成交聯(lián)作用無(wú)法發(fā)生，納米金最終呈現(xiàn)分散狀態(tài)。

圖2 cAMP依賴(lài)型蛋白激酶A和鈣調(diào)素依賴(lài)型蛋白激酶Ⅱ的酶活力測(cè)定和抑制劑篩選原理示意圖［9］Fig.2 Schematic representation of phosphorylation／biotinylation of substrate nanoparticles followed by addition of avidin－gold nanoparticles in the presence and absence of a kinase inhibitor［9］

通過(guò)酶將識(shí)別分子修飾至納米金表面，進(jìn)一步通過(guò)特異性抗原與抗體識(shí)別促使納米金交聯(lián)的方法也見(jiàn)于組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活力測(cè)定和相關(guān)抑制劑篩選中［12］。這些研究基于酶抑制劑破壞交聯(lián)作用使納米金聚集狀態(tài)改變來(lái)反映酶抑制劑抑制能力強(qiáng)弱，并且僅靠肉眼觀(guān)察即可進(jìn)行判斷，有望發(fā)展并應(yīng)用于可視化高通量藥物篩選研究中。

此外，還有基于DNA互補(bǔ)鏈識(shí)別、抗原抗體識(shí)別、肽鏈交聯(lián)的納米金探針。當(dāng)某種酶加入后，其選擇性切斷連接鏈活性位點(diǎn)，從而使聚集的納米金顆粒重新分散呈現(xiàn)酒紅色。

Guarise等［10］基于交聯(lián)作用發(fā)展了蛋白酶（protease）活力檢測(cè)方法：首先設(shè)計(jì)交聯(lián)劑多肽鏈的結(jié)構(gòu)，以含有硫醇基的半胱氨酸為多肽鏈的頭尾，將其作為蛋白酶的多肽底物，在無(wú)酶狀態(tài)下，多肽鏈頭尾的雙巰基可將分散態(tài)的納米金連接起來(lái)，使納米金發(fā)生交聯(lián)作用而聚集；當(dāng)?shù)鞍酌复嬖跁r(shí)，由于它對(duì)多肽鏈選擇性切割，造成多肽鏈僅存1個(gè)巰基，交聯(lián)作用被破壞，導(dǎo)致納米金呈現(xiàn)分散的狀態(tài)。此方法是基于蛋白酶催化肽水解前后交聯(lián)作用被破壞導(dǎo)致納米金聚集狀態(tài)的改變來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Xu等［11］基于相似的原理發(fā)展了DNA內(nèi)切酶活力檢測(cè)和酶抑制劑篩選方法。

基于交聯(lián)作用的比色法用于其它酶活力測(cè)定和相關(guān)抑制劑的篩選也被多次報(bào)道［12－15］，但有一些局限性：其一，受交聯(lián)劑結(jié)構(gòu)的限制，需要其頭尾兩端均具有可與納米金表面結(jié)合的官能團(tuán)（如巰基），為了得到這種特殊結(jié)構(gòu)的官能團(tuán)需要經(jīng)過(guò)繁瑣的分子設(shè)計(jì)、修飾和合成過(guò)程，使方法變得復(fù)雜；其二，在功能化納米金探針準(zhǔn)備過(guò)程中，需要將多余的配體分子與納米金探針進(jìn)一步分離；其三，交聯(lián)過(guò)程是緩慢的動(dòng)態(tài)過(guò)程，這使原本快捷的比色法失去優(yōu)勢(shì)。

2.2 基于非交聯(lián)作用的納米金比色法

為了克服交聯(lián)作用的局限，研究者發(fā)展了多種基于非交聯(lián)作用的納米金比色法，如通過(guò)交聯(lián)劑調(diào)節(jié)顆粒間距而改變納米金顏色，或通過(guò)設(shè)計(jì)納米金表面電荷來(lái)調(diào)節(jié)納米金的聚集狀態(tài)。在酶加入前，對(duì)納米金顆粒表面進(jìn)行分子設(shè)計(jì)使其帶有一定電荷而呈現(xiàn)某種聚集狀態(tài)；當(dāng)加入酶后，酶催化反應(yīng)改變納米金表面電荷，使納米金聚集狀態(tài)發(fā)生改變而變色。Choi等［16］通過(guò)設(shè)計(jì)納米金表面的電荷（圖3），發(fā)展了可視化檢測(cè)堿性磷酸酯酶活力和酶抑制劑篩選的方法：首先設(shè)計(jì)酶的底物結(jié)構(gòu)，以半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸三肽為底物。這樣設(shè)計(jì)的目的在于：利用半胱氨酸上的巰基可將三肽修飾于納米金表面上，天冬氨酸上的胍基與納米金之間的靜電作用以及電子給體與受體的作用可將分散的納米金交聯(lián)在一起而發(fā)生聚集，酪氨酸上的磷酸基所帶的負(fù)電荷可阻礙相鄰帶正電荷的胍基與納米金結(jié)合而破壞胍基誘導(dǎo)的納米金聚集。當(dāng)堿性磷酸酯酶加入到體系中時(shí)，由于酶催化作用使磷酸根離子脫離多肽鏈從而使磷酸基的阻礙作用消失，導(dǎo)致納米金聚集。此研究通過(guò)設(shè)計(jì)底物結(jié)構(gòu)和納米金表面電荷來(lái)達(dá)到酶活力檢測(cè)和抑制劑篩選的目的，為酶活力檢測(cè)研究提供了新的思路。

基于設(shè)計(jì)納米金表面電荷的比色法也被應(yīng)用于糖苷酶、腺苷、高半胱氨酸水解酶、蛋白激酶、透明質(zhì)酸酶、端粒酶等活性的測(cè)定［17－21］。

圖3 基于設(shè)計(jì)納米金表面電荷的堿性磷酸酯酶活力檢測(cè)原理示意圖［16］Fig.3 Alkaline phosphatase（ALP）assay based on color change during peptide－induced Au－NP aggregation［16］

2.3 以裸納米金為探針的比色法

不論納米金比色法基于交聯(lián)作用還是基于設(shè)計(jì)納米金表面電荷，以金硫鍵（Au－S）將抗原、DNA、多肽等小分子連接在納米金表面，均需要對(duì)納米金表面進(jìn)行設(shè)計(jì)和修飾。近年來(lái)，以裸納米金為探針的比色法被多次報(bào)道［22－25］。其原理也是基于納米金所呈現(xiàn)的顏色與其粒子尺寸或其聚集狀態(tài)之間的依賴(lài)關(guān)系。與交聯(lián)作用不同的是，此法利用直接化學(xué)還原得到不需要進(jìn)一步功能化的納米金膠體作為檢測(cè)探針。

Zhao等［22］發(fā)展了一種以裸納米金為探針?lè)肿拥目梢暬瘷z測(cè)牛腸堿性磷酸酶活性的方法。其檢測(cè)原理是：酶的底物ATP、ADP、AMP、腺苷等均可通過(guò)堿基上的氨基與納米金發(fā)生電子給體與受體作用而快速連接在納米金表面置換其表面原有的檸檬酸分子，ATP、ADP、AMP的磷酸骨架均帶有負(fù)電荷，可增強(qiáng)納米金的抗鹽能力，但是由于所保護(hù)的納米金表面所帶電荷不同，使得它們?cè)谝欢舛鹊柠}溶液中具有不同的穩(wěn)定性，在酶催化ATP轉(zhuǎn)化為腺苷過(guò)程中納米金表面電荷發(fā)生變化，從而改變納米金的聚集狀態(tài)，達(dá)到酶活力檢測(cè)的目的。

Shen等［23］基于相似的原理發(fā)展了可視化檢測(cè)核酸酶活性的方法。該法也是以裸納米金為探針?lè)肿?，是根?jù)不同鏈長(zhǎng)的單鏈DNA保護(hù)的納米金表面所帶負(fù)電荷不同，使納米金探針在一定濃度鹽溶液中具有不同聚集狀態(tài)而發(fā)展起來(lái)的。

通過(guò)選擇納米金表面的保護(hù)劑、設(shè)計(jì)納米金表面電荷，可以發(fā)展更多可視化檢測(cè)方法用于檢測(cè)可引起納米金表面電荷和抗鹽能力變化的靶物質(zhì)。但以裸納米金為探針發(fā)展的比色法也存在一些局限性，如：裸納米金顆粒對(duì)所存在的介質(zhì)非常敏感，當(dāng)待測(cè)生物樣品成分復(fù)雜、鹽濃度較高或含有大分子（如蛋白質(zhì)）時(shí)，可使裸納米金發(fā)生聚沉。針對(duì)這些問(wèn)題，研究者將芯片技術(shù)與基于裸納米金的比色法結(jié)合起來(lái)用于生物樣品的現(xiàn)場(chǎng)分析。一方面，一體化的分析芯片可提供生物樣品的前處理來(lái)減少?gòu)?fù)雜成分對(duì)裸納米金探針比色法的干擾；另一方面，芯片具有高通量?jī)?yōu)勢(shì)，可用于對(duì)酶抑制劑和分子庫(kù)大批量、快速的篩選。

3 展望

酶活力測(cè)定與體內(nèi)生理活動(dòng)、病理學(xué)以及開(kāi)發(fā)靶向性治療方法研究密切相關(guān)。納米金顆粒表面等離子共振效應(yīng)所產(chǎn)生的特征光吸收、表面易于修飾、易合成等特征，使其作為極好的分析平臺(tái)被應(yīng)用于酶活力測(cè)定和酶抑制劑分子篩選研究工作中。近年來(lái)，研究者利用不同的分子識(shí)別配體構(gòu)建了多種納米金探針，納米金比色法因具有高靈敏度和選擇性已成為酶活力測(cè)定的主要手段。但是，此法仍需要進(jìn)一步改進(jìn)，如通過(guò)輔助其它技術(shù)手段（如熒光技術(shù)、拉曼散射技術(shù)等）來(lái)提高方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性和選擇性，并結(jié)合微流控芯片技術(shù)使其發(fā)展為高通量、一體化的分析平臺(tái)等。另一方面，已有報(bào)道均是基于球形納米金粒子發(fā)展的分析方法，其它形狀獨(dú)特的三角形或六邊形金顆粒、納米棒等的光學(xué)性能仍未得到開(kāi)發(fā)利用，不同尺寸、不同形狀的納米金顆粒所具有的多光子發(fā)光、等離子共振能量轉(zhuǎn)移以及催化等優(yōu)異性能有待于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，并應(yīng)用于酶活力測(cè)定和生物醫(yī)學(xué)分析和診斷中。

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