野生冬蟲(chóng)夏草伴生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析

李輝劉洋白飛榮姚粟扎西·才吉程池

（1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015；2.玉樹(shù)藏族自治州三江源藥業(yè)有限公司，玉樹(shù) 810003）

野生冬蟲(chóng)夏草伴生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析

李輝1劉洋1白飛榮1姚粟1扎西·才吉2程池1

（1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015；2.玉樹(shù)藏族自治州三江源藥業(yè)有限公司，玉樹(shù) 810003）

采用基于PCR擴(kuò)增的變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術(shù)，研究8種不同地理來(lái)源野生冬夏草中伴生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，通過(guò)優(yōu)勢(shì)條帶切膠測(cè)序分析，確定了不同來(lái)源冬蟲(chóng)夏草伴生優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的種屬信息，分析結(jié)果表明冬蟲(chóng)夏草中細(xì)菌群落多樣性豐富，不同來(lái)源冬蟲(chóng)夏草的細(xì)菌多樣性指數(shù)（H’）、豐度（D）和均勻度（J）均有所不同，且伴生細(xì)菌群落相似性與樣品產(chǎn)地間的距離遠(yuǎn)近呈一定的正相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)了冬蟲(chóng)夏草樣品中的4種共有細(xì)菌Flavihumibacter petaseus、Sphingomonas aestuarii、Geobacillus pallidus和Methylovirgula ligni，為進(jìn)一步研究伴生細(xì)菌在冬蟲(chóng)夏草生長(zhǎng)發(fā)育中所起的作用奠定了基礎(chǔ)。

冬蟲(chóng)夏草 16S rRNA V3區(qū) DGGE 細(xì)菌群落

冬蟲(chóng)夏草（Ophicordyceps sinensis）是冬蟲(chóng)夏草菌寄生在蝙蝠蛾科幼蟲(chóng)上形成的昆蟲(chóng)和子座的復(fù)合體，其形成和成熟過(guò)程中伴隨著多種其它微生物的生長(zhǎng)，這些微生物可產(chǎn)生多種功效性成分，能有效提升冬蟲(chóng)夏草的保健和醫(yī)藥功能，在野生冬蟲(chóng)夏草的形成過(guò)程中起著重要的作用［1，2］。

近年來(lái)，關(guān)于冬蟲(chóng)夏及其微環(huán)境中微生物的研究已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，但主要集中在真菌方面的研究。目前已經(jīng)解決了冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型方面的問(wèn)題，并有10多種功能真菌被開(kāi)發(fā)利用，如中國(guó)金孢霉（Chrysosporium sinense）、蝙蝠蛾被孢霉（Mortierella hepiali）、中國(guó)擬青霉（Paecilomyces sinensis）、蝙蝠蛾柱霉（Scytalidium hepiali）、中國(guó)彎頸霉（Tolypocladium sinense ）和蝙蝠蛾擬青霉Paecilomyces hepiali 等［3，4］。

然而，冬蟲(chóng)夏草存在著很多重要的細(xì)菌資源有待去認(rèn)識(shí)和開(kāi)發(fā)利用?；谀壳皩?duì)野生冬蟲(chóng)夏草中伴生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究比較缺乏的狀況，本研究采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)不同來(lái)源的野生冬蟲(chóng)夏草半生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，旨在確定不同來(lái)源冬蟲(chóng)

夏草中的群落差異和共有細(xì)菌菌群，旨為冬蟲(chóng)夏草伴生細(xì)菌資源的挖掘與保護(hù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品1-7分別采集于我國(guó)冬蟲(chóng)夏草代表性產(chǎn)區(qū)青海玉樹(shù)州、果洛州，四川康定、阿壩和雅拉雪山，以及云南白馬雪山的高原草甸，樣品8購(gòu)買(mǎi)自玉樹(shù)藏族自治州蟲(chóng)草交易市場(chǎng)（產(chǎn)地標(biāo)注尼泊爾），詳見(jiàn)表1。

表1 冬蟲(chóng)夏草樣品來(lái)源表

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 取8種不同來(lái)源的冬蟲(chóng)夏草各一支，用無(wú)菌水沖洗后晾干，依次用70%乙醇，次氯酸鈉溶液（2.5%有效Cl-），70%乙醇分別浸泡3 min，5 min，30 s，最后無(wú)菌水淋洗5-7次，在無(wú)菌條件下晾干［5］。

1.2.2 總DNA提取 取經(jīng)滅菌處理后的冬蟲(chóng)夏草樣品，按照文獻(xiàn)［6］中的方法提取樣品的總DNA。

1.2.3 16S rRNA基因V3可變區(qū)的PCR擴(kuò)增 用通用引物對(duì)341f-GC和534r進(jìn)行16S rRNA基因V3可變區(qū)片段的擴(kuò)增。341f-GC：5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG-3'（40個(gè)堿基GC夾）；534r：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'。PCR反 應(yīng)50 μL體 系 包括10×PCR buffer（不含Mg2+）5.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，Taq酶（2.5 U/μL）1.2 μL，模板各1 μL，上下游引物10 mmol/L各1 μL，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)齊至25 μL。PCR反應(yīng)程序如下94℃預(yù)變性5 min 后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，72℃再次延伸10 min 。

1.2.4 變性梯度凝膠電泳（DGGE） 樣品的16S rRNA基因V3可變區(qū)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)DGGE分析系統(tǒng)進(jìn)行分離。丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性梯度為40%-60%。60℃恒溫，80 V下電泳16 h，電泳完畢后用SYBR green I（1×TAE，1∶10 000）染色45 min，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)（英國(guó)UVI）分析電泳結(jié)果。

1.2.5 群落多樣性分析 使用Quantity One軟件對(duì)DGGE膠圖進(jìn)行計(jì)算；利用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、豐度（S）和Pielou均勻度指數(shù)比較各個(gè)樣品的細(xì)菌群落多樣性計(jì)算。

Shannon-Wiener指數(shù)（H’）計(jì)算公式：

H=-∑PilogPi

Pielou指數(shù)（J）計(jì)算公式：

J= （1-∑Pi2）/（1-1/S）

其中，S為DGGE條帶數(shù)量，Pi為第i條帶灰度占該泳道總灰度的比率。

1.2.6 DGGE條帶的回收、重新擴(kuò)增、克隆、轉(zhuǎn)化和序列測(cè)定 在波長(zhǎng)為 354 nm 紫外線(xiàn)下，切取DGGE 凝膠上的主要條帶，溶于 50 μL 無(wú)菌去離子水中，4℃過(guò)夜溶解。重?cái)U(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到載體pEASY-T1（TRANS），轉(zhuǎn)入E.coli感受態(tài)細(xì)胞，在LB固體培養(yǎng)基上37℃篩選培養(yǎng)16 h，挑取白色轉(zhuǎn)化子用含有氨芐青霉素抗性的 LB液體培養(yǎng)基37℃震蕩培養(yǎng)8 h。T-載體通用引物進(jìn)行菌液 PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，每個(gè)樣品3個(gè)陽(yáng)性克隆交由生工生物工程（上海）有限公司完成測(cè)序。

1.2.7 16S rRNA基因V3可變區(qū)序列分析 所測(cè)得的16S rRNA基因V3可變區(qū)序列用DNASTAR軟件去除載體序列和GC夾子后，將有效序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，以其中同源性最高的序列為參考序列，相似性≥97%的序列視為同一序列型（Sequence type）。

2 結(jié)果

2.1 16S rRNA基因V3可變區(qū)的PCR擴(kuò)增

8種冬蟲(chóng)夏草樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得16S rRNA基因V3可變區(qū)的序列片段條帶大小約為200 bp，條帶均單一明亮（圖1）。

2.2 不同來(lái)源冬蟲(chóng)夏草的DGGE圖譜分析及細(xì)菌多樣性分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DGGE后獲得8種冬蟲(chóng)夏草的伴

生細(xì)菌DGGE指紋圖譜（圖2），每條泳帶代表一種冬蟲(chóng)夏草的細(xì)菌DGGE指紋圖譜，不同位置的條帶代表不同種屬細(xì)菌，條帶的熒光強(qiáng)度則反應(yīng)了該細(xì)菌的豐富度，條帶信號(hào)越亮，表示該種屬細(xì)菌的相對(duì)數(shù)量越多。如圖2表明，8種不同來(lái)源冬蟲(chóng)夏草的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，并呈現(xiàn)出不盡相同的優(yōu)勢(shì)菌條帶，同時(shí)不同來(lái)源樣品中還存在5種共有的細(xì)菌群落。

圖1 16S rRNA基因V3可變區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中的電泳圖譜

8種冬蟲(chóng)夏草的豐度、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)如表2，圖3-圖5所示。8種樣品的豐度在14-25之間，平均為20，說(shuō)明冬蟲(chóng)夏草樣品含有豐富的伴生細(xì)菌。從物種多樣性上來(lái)看，8種樣品的多樣性指數(shù)在2.36-3.103之間，具有較高的物種多樣性，物種多樣性變化趨勢(shì)與豐度相同，來(lái)自尼泊爾的樣品具有最高的細(xì)菌物種多樣性和豐度。8種樣品的均勻度，從趨勢(shì)上看不同于物種多樣性和豐富度，來(lái)源于玉樹(shù)郭欽的樣品具有最高的均勻度。

圖2 八種不同來(lái)源冬蟲(chóng)夏草樣品伴生細(xì)菌 DGGE 分離圖譜及分析示意圖

2.3 不同來(lái)源冬蟲(chóng)夏草的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性分析

在DGGE圖譜中，不同樣品的共有條帶數(shù)目，可以反應(yīng)不同樣品之間細(xì)菌群落相似性。通過(guò)計(jì)算群落相似性系數(shù)并構(gòu)建聚類(lèi)樹(shù)，可以得到不同來(lái)源冬蟲(chóng)夏草的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的聚類(lèi)關(guān)系。從圖6可以看出來(lái)源于青海治多縣和果洛州樣品，以及來(lái)源于玉樹(shù)哈秀和郭欽的樣品均聚為一個(gè)分支，相似性系數(shù)分別為80.5%和73.1%，其他樣品間的相似性系數(shù)在45%-68%之間，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性與樣品產(chǎn)地的遠(yuǎn)近具有一定的正相關(guān)性。

表2 八種不同來(lái)源冬蟲(chóng)夏草樣品的豐度（s）、Shannon-Wiener指數(shù)和Pielou指數(shù)列表

圖3 8種不同來(lái)源冬蟲(chóng)夏草樣品的Simpson豐富度指數(shù)分析

2.4 不同來(lái)源冬蟲(chóng)夏草的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較分析

為進(jìn)一步研究不同冬蟲(chóng)夏草樣品中細(xì)菌的群落組成，DGGE電泳后對(duì)其中12個(gè)優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行切膠、回收、克隆、測(cè)序（表3）。測(cè)序結(jié)果經(jīng)GenBank數(shù)

據(jù)庫(kù)比對(duì)后，序列相似性均大于97%，比對(duì)結(jié)果顯示8種冬蟲(chóng)夏草樣品中中存在Methylovirgula、拜葉林克氏菌（Beijerinckia）、空氣芽孢桿菌（Aeribacillus）、噬菌弧菌（Bacteriovorax）、假單胞菌（Pseudomonas）、土地桿菌（Pedobacter）、肉食桿菌（Carnobacterium）、Flavihumibacter、Sphingopyxis等9個(gè)屬優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，分屬于變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes）3個(gè)類(lèi)群，其中變形菌門(mén)組成最高為50%，擬桿菌門(mén)次之為33.3%，厚壁菌門(mén)占16.7%。

圖4 八種不同來(lái)源冬蟲(chóng)夏草樣品的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)分析

圖5 八種不同來(lái)源冬蟲(chóng)夏草樣品的Pielou均勻度指數(shù)分析

圖6 不同冬蟲(chóng)夏草樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性的聚類(lèi)結(jié)果

8種不同樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類(lèi)存在明顯的差異（表3），但也存在一些共有的細(xì)菌種類(lèi)。在所有樣品中均檢測(cè)到 Methylovirgula ligni、Aeribacillus pallidus、Flavihumibacter petaseus和 Pedobacter panaciterrae這4個(gè)種。

3 討論

基于PCR擴(kuò)增的變性梯度凝膠電泳（PCRDGGE）技術(shù)無(wú)需對(duì)樣品中微生物進(jìn)行培養(yǎng)，直接研究其基因指紋圖譜，具有檢測(cè)限低、易操作、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于復(fù)雜環(huán)境樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究［7-9］。冬蟲(chóng)夏草是一個(gè)十分復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境，對(duì)其的研究會(huì)受到很多既定因素的影響，而PCR-DGGE技術(shù)能克服傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限性，在分析冬蟲(chóng)夏草伴生細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)中具有十分重要的意義。

本研究首次將PCR-DGGE技術(shù)應(yīng)用于8種不同地理來(lái)源野生冬蟲(chóng)夏草伴生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究，通過(guò)優(yōu)勢(shì)條帶切膠測(cè)序分析，確定了不同來(lái)源冬蟲(chóng)夏草中伴生的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種屬信息，結(jié)果表明冬蟲(chóng)夏草中存在豐富的細(xì)菌群落多樣性，不同來(lái)源冬蟲(chóng)夏草的細(xì)菌多樣性指數(shù)（H’）、豐度（D）和均勻度（J）均有所不同，樣品之間伴生細(xì)菌群落相似性與樣品產(chǎn)地的距離遠(yuǎn)近呈正相關(guān)，不同樣品既存在細(xì)菌種類(lèi)和豐度上的差異，也存在一些共有的細(xì)菌種類(lèi)，其中Flavihumibacter petaseus、Sphingomonas aestuarii、Geobacillus pallidus和 Methylovirgula ligni是不同來(lái)源冬蟲(chóng)夏草中共有的伴生細(xì)菌。本研究證明，PCR-DGGE技術(shù)是一種快速有效地研究冬蟲(chóng)夏草伴生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的技術(shù)。

與傳統(tǒng)方法相比，PCR-DGGE技術(shù)可對(duì)未培養(yǎng)微生物進(jìn)行檢測(cè)，極大地拓展了對(duì)冬蟲(chóng)夏草伴生細(xì)菌多樣性的研究。本研究中共檢測(cè)到Methylovirgula、拜葉林克氏菌（Beijerinckia）、空氣芽孢桿菌（Aeribacillus）、噬菌弧菌（Bacteriovorax）、假單胞菌（Pseudomonas）、土地桿菌（Pedobacter）、肉食桿菌（Carnobacterium）、Flavihumibacter、Sphingopyxis9個(gè)屬內(nèi)的12種細(xì)菌，其中除肉食桿菌（Carnobacterium）、假單胞菌（Pseudomonas）已有報(bào)道［10，11］從冬蟲(chóng)夏草寄主腸道中分離到外，其他屬均為首次檢測(cè)到。

值得注意的是，本研究從8種不同來(lái)源的冬

蟲(chóng)夏草樣品中均檢測(cè)到Flavihumibacter petaseus、Sphingomonas aestuarii、Geobacillus pallidus和Methylovirgula ligni四種伴生細(xì)菌，這些細(xì)菌資源是否普遍存在于冬蟲(chóng)夏草中，在其形成過(guò)程中是否起著某種特定的促生作用，還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

表3 優(yōu)勢(shì)條帶切膠測(cè)序比對(duì)分析結(jié)果

另外，本研究基于PCR-DGGE建立了冬蟲(chóng)夏草伴生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析方法，但還需要進(jìn)一步廣泛收集不同的冬蟲(chóng)夏草測(cè)試樣品，以獲得更豐富的研究數(shù)據(jù)，并結(jié)合傳統(tǒng)的分離純化方法獲得伴生細(xì)菌資源，為合理的開(kāi)發(fā)和利用冬蟲(chóng)夏草伴生細(xì)菌資源打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

野生冬蟲(chóng)夏草伴生細(xì)菌群落多樣性豐富，其樣品產(chǎn)地間的距離遠(yuǎn)近與伴生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性呈一定的正相關(guān)，不同冬蟲(chóng)夏草樣品中包含4種共有的伴生細(xì)菌類(lèi)群，這是國(guó)內(nèi)外首次利用非培養(yǎng)方法針對(duì)野生冬蟲(chóng)夏草伴生細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行的研究，具有重要的理論研究與實(shí)踐指導(dǎo)價(jià)值。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Analysis of Bacterial Community Structure and Diversity in Wild Ophicordyceps sinensis

Li Hui1Liu Yang1Bai Feirong1Yao Su1，2Zahi Nagi2Cheng Chi1

（1. Chinese Research Institute of Food and Fermentation Industries Chinese industrial culture collection center，Beijing 100015；2. Yushu Tibetan Autonomous Prefecture of Sanjiang Source Pharmaceutical Co Ltd，Yushu 810003）

The bacterial community structure of eight wild Ophicordyceps sinensis were investigated using PCR-DGGE.DNA sequencing was proceeded to obtain dominant bacterial population information in different samples. The result of DGGE profile showed that all the samlples contained abundant bacterial community, different samples have some differences among the Shannon-winner index, Richess and evenness, significant differences were observed between samples from distinct locations. Flavihumibacter petaseus, Sphingomonas aestuarii, Geobacillus pallidus and Methylovirgula ligni were commonly detected in all samples, which laid a foundation for further studying on the roles of bacteria during the formation process of Ophicordyceps sinensis.

Ophicordyceps sinensis 16S rRNA V3 DGGE Bacterial community

2014-03-05

國(guó)家微生物資源平臺(tái)專(zhuān)項(xiàng)（NIMR2014-4），青海省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012-N-142，2012-N-153），中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院科技發(fā)展基金（博士基金）項(xiàng)目（2012KJFZ-BS-01）

李輝，碩士，工程師，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：lihui@china-cicc.org

程池，男，教授級(jí)高級(jí)工程師，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品工業(yè)微生物菌種資源管理與鑒定評(píng)估；E-mail：cheng100027@163.com