PFOS對(duì)東亞三角渦蟲HSP70蛋白及基因表達(dá)的影響

宮曉寧 袁佐清 白蕓

（山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，淄博 255049）

PFOS對(duì)東亞三角渦蟲HSP70蛋白及基因表達(dá)的影響

宮曉寧 袁佐清 白蕓

（山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，淄博 255049）

全氟辛烷磺酸（Perfluorooctane sulfonate，PFOS）是一種持續(xù)的有機(jī)污染物，是全氟化合物（Perfluorinated chemicals，PFCs）在環(huán)境中的代表性物質(zhì)。以低等三胚層動(dòng)物渦蟲作為試驗(yàn)材料，使用Western blot及RT-PCR技術(shù)探究PFOS對(duì)渦蟲HSP70蛋白及基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，PFOS短時(shí)間處理能誘導(dǎo)渦蟲hsp70 mRNA表達(dá)量升高，渦蟲再生10 d mRNA表達(dá)受到抑制，HSP70蛋白表達(dá)量在渦蟲再生4 d和7 d時(shí)隨PFOS濃度顯著上升，其它組變化不明顯，PFOS對(duì)mRNA和蛋白表達(dá)量趨勢(shì)影響不一致，可能少量PFOS能抑制HSP70蛋白翻譯，藥物在渦蟲體內(nèi)積累量增加，蛋白高表達(dá)抵御毒性傷害。

PFOS 三角渦蟲 HSP70 RT-PCR Western blot

以全氟辛烷磺酸鹽（Perflourooctane，PFOS）為代表的全氟化合物（PFcs），曾被作為無(wú)毒化合物使用了50多年，使用范圍涉及生產(chǎn)生活的諸多方面［1-3］。PFOS具有穩(wěn)定的C-F結(jié)構(gòu)，不易降解，具有生物積累作用，能夠通過(guò)食物鏈富集，從陸地到海洋，從低等藻類到高等哺乳類和鳥類都能檢測(cè)到PFOS的存在［4］。已知PFOS 集中分布于肝臟、腎臟、肺臟、血液等部位［5，6］，損害生物體的內(nèi)臟器官［5，7-9］，并對(duì)發(fā)育生殖過(guò)程具有毒害作用。毒性機(jī)理和藥代動(dòng)力學(xué)研究顯示，PFOS能夠?qū)w外培養(yǎng)的細(xì)胞造成氧化壓力，破壞細(xì)胞膜，改變基因表達(dá)，損傷基因結(jié)構(gòu)等［9-12］，但對(duì)其毒性作用原理仍不明確。

目前，對(duì)PFcs的研究多集中于小白鼠、魚類等脊椎動(dòng)物，在無(wú)脊椎動(dòng)物方面的研究仍很匱乏。本試驗(yàn)以渦蟲為對(duì)象，其作為低等扁形動(dòng)物，對(duì)環(huán)境變化十分敏感，并且具有強(qiáng)大的再生能力，是研究再生與凋亡平衡的良好材料。渦蟲暴露于高濃度PFOS中，產(chǎn)生一種外界環(huán)境壓力，而hsp70正是一種生物體應(yīng)對(duì)外界壓力的標(biāo)志基因［13］。本研究通過(guò)使用Western blot及RT-PCR技術(shù)檢測(cè)PFOS誘導(dǎo)完整渦蟲和再生渦蟲HSP70蛋白及基因表達(dá)的變化，旨在初步探究PFOS對(duì)渦蟲的毒性作用。

1 材料與方法

1.1 材料

東亞三角渦蟲采自博山泉河頭的泉水中，22℃涼開水培養(yǎng)，試驗(yàn)前饑餓7 d處理。PFOS產(chǎn)自ALORICH公司，DMSO（Dimethyl Sulfoxide）產(chǎn)自Klontech公司。RNA抽提液Trizol購(gòu)自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄酶、RNase抑制劑、dNTP、Taq酶等均購(gòu)自Thermo公司，一抗和二抗分別為Santa Cruz生物技術(shù)公司生產(chǎn)的HSP70/HSC70（sc-33575）和bovinerabbit IgG-HRP（sc-2370），Bioss生 產(chǎn) 的Anti-beta-Actin（Loading Control）（bs-0061R）。DAB顯色液購(gòu)自天根公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR用渦蟲的處理 PFOS以0.005%的DMSO溶液溶解，配置為0、0.5、1、5、15和30 mg/L 6個(gè)濃度，每個(gè)濃度3個(gè)處理，每個(gè)處理10條渦蟲，每天更換1次培養(yǎng)溶液。處理1、4和10 d后取渦蟲提總RNA。再生渦蟲自耳突下緣切去頭部，PFOS處理方式與完整渦蟲的相同。

1.2.2 渦蟲總RNA的提取及cDNA的合成 將10條渦蟲置于1.5 mL離心管中，吸干水，液氮中迅速冷凍，使用塑料杵子研磨成粉末，加入0.2 mL Trizol，繼續(xù)研磨成糊狀，4℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清液加入1/5體積三氯甲烷，4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清加入等體積異丙醇，4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄掉上清，加入1 mL 70%乙醇洗滌沉淀，4℃ 12 000 r/min離心5 min，棄乙醇，干燥皿中干燥1 h，加入適量無(wú)RNase水溶解。使用Reverse Transcriptase M-MLV進(jìn)行渦蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA。

1.2.3 PCR及電泳 自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)取得Djhsp70 mRNA全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物如下：hsp70 sense：5'-GGAGATACGCATTTAGGC-3'，hsp70 anti-sense：5'-TCAACTGGTTCCAAGGTC-3'，內(nèi)參β-actin sense［14］：5'-GGATGATGAGATGCGATGTTG-3'，β-actin antise-nse：5'-ATGCCAGGTCCAGATTCGTCA-3'。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 50 s，52℃ 50 s，72℃60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。保存電泳圖片并使用軟件進(jìn)行亮度分析。

1.2.4 Western blot用渦蟲的處理及蛋白提取 以0、0.5、1、5和10 mg/L 5個(gè)濃度的PFOS溶液處理渦蟲，每個(gè)濃度3個(gè)處理，每個(gè)處理30條渦蟲，每天更換一次培養(yǎng)液，在1、4和7 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)取渦蟲提蛋白樣品，試驗(yàn)分再生組與非再生組。提取蛋白過(guò)程為：渦蟲放入1.5 mL EP管，洗凈，將水吸干，液氮中瞬時(shí)冷凍，加適量PBS（M/V=1∶100，PBS 0.01 mol/L，pH7.4），用塑料杵子研磨至糊狀，4℃10 000 r/min離心30 min，取上清，4℃ 10 000 r/min離心15 min，取上清分裝保存。

1.2.5 Western blot檢測(cè) 渦蟲體內(nèi)HSP70蛋白變化趨勢(shì)以Western blot法進(jìn)行檢測(cè)，β-Actin作內(nèi)參。蛋白樣品以10% SDS-PAGE膠電泳（Bio-Rad100-120型電泳儀，Bio-Rad miniprotea垂直電泳槽），半干法轉(zhuǎn) 膜（15 V，18 min，Bio-Rad Trans-Blot SD Cell），PBST漂洗一遍，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，4℃一抗孵育12 h，PBST漂洗3遍，4℃二抗孵育10 h，PBST漂洗數(shù)遍，DAB顯色。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果

PFOS誘導(dǎo)完整渦蟲hsp70 mRNA相對(duì)表達(dá)量變化見圖1和圖2。完整渦蟲的RT-PCR結(jié)果（圖1）顯示，在1 d時(shí)，1-30 mg/L組呈現(xiàn)高表達(dá)，表達(dá)量超過(guò)對(duì)照組的1.5倍，到4 d和10 d時(shí)這種高表達(dá)不明顯。濃度為30 mg/L的PFOS超出渦蟲的承受能力，在處理10 d時(shí)，渦蟲大量死亡，無(wú)法完成RNA提取，此組渦蟲hsp70表達(dá)量沒(méi)有數(shù)據(jù)。再生渦蟲的RT-PCR結(jié)果（圖2）表明，再生渦蟲對(duì)PFOS更加敏感，30 mg/L PFOS處理1 d造成渦蟲大量死亡，10 mg/L PFOS處理10 d造成渦蟲大量死亡，所以將PFOS最高濃度調(diào)為8 mg/L。誘導(dǎo)再生渦蟲1 d時(shí)，與對(duì)照組相比除5 mg/L組以外，hsp70 mRNA表達(dá)量均下降，4 d時(shí)，各濃度PFOS對(duì)hsp70基因表達(dá)量無(wú)顯著影響，10 d時(shí)，PFOS抑制hsp70的表達(dá)，并有一定濃度相關(guān)性。

2.2 Western blot結(jié)果

對(duì)于完整渦蟲，HSP70蛋白表達(dá)量變化與PFOS處理濃度存在一定相關(guān)性（圖3），多數(shù)處理?xiàng)l件下，PFOS誘導(dǎo)使渦蟲HSP70蛋白表達(dá)量略有增加，僅0.5

mg/L處理1 d組以及10 mg/L處理1 d和4 d組表達(dá)量下降，最多下降50%?？傮w來(lái)說(shuō)，PFOS誘導(dǎo)沒(méi)有使渦蟲HSP70蛋白表達(dá)明顯變化。再生渦蟲暴露于10 mg/L PFOS 7 d時(shí)毒害作用最大，死亡率達(dá)到50%。并且再生渦蟲HSP70蛋白變化十分顯著（圖4），誘導(dǎo)1 d時(shí)各誘導(dǎo)濃度的渦蟲HSP70蛋白表達(dá)變化不顯著；誘導(dǎo)再生渦蟲4 d時(shí)，各組HSP70的量隨PFOS的濃度增加而升高，5 mg/L組達(dá)到最高，為對(duì)照組的8倍，再生7 d HSP70呈先下降后上升的趨勢(shì)，1 mg/L PFOS處理組表達(dá)量極低，到5 mg/L PFOS處理組表達(dá)量最高，為對(duì)照組的5倍。

圖1 完整渦蟲hsp70 mRNA相對(duì)表達(dá)量變化

圖2 渦蟲再生過(guò)程中hsp70 mRNA相對(duì)表達(dá)量變

圖3 完整渦蟲暴露于各濃度PFOS中HSP70蛋白相對(duì)表達(dá)量變化

圖4 再生渦蟲暴露于各濃度PFOS中HSP70蛋白相對(duì)表達(dá)量變化

3 討論

PFOS能引起眾多基因表達(dá)量變化，Hu等［15］將小鼠癌細(xì)胞暴露于高濃度PFOS中，約400個(gè)基因表達(dá)受到顯著影響，這些基因涉及脂肪酸同化酶、細(xì)胞色素450以及激素調(diào)節(jié)等。有試驗(yàn)表明PFOS能直接破壞DNA結(jié)構(gòu)［16］，但也有試驗(yàn)顯示PFOS不造成基因的損傷［16］，而是具有細(xì)胞毒性［10］。PFOS的毒性機(jī)制雖然還沒(méi)有完全清楚，但

大量試驗(yàn)表明，其主要作用是造成細(xì)胞的氧化壓力，體外培養(yǎng)的細(xì)胞和動(dòng)植物個(gè)體試驗(yàn)均顯示，PFOS誘導(dǎo)能造成活性氧（ROS）含量升高［17］，過(guò)氧化氫酶，超氧化物歧化酶等抗氧化酶類表達(dá)量均顯著增加［12，17-20］。hsp70是生物體應(yīng)對(duì)外界壓力的標(biāo)志性基因，具有抗氧化的作用。本試驗(yàn)顯示，完整渦蟲短時(shí)間暴露于PFOS中，誘導(dǎo)hsp70表達(dá)，但暴露時(shí)間延長(zhǎng)，逐步呈抑制表達(dá)狀態(tài)，可能是PFOS在渦蟲體內(nèi)積累量少時(shí)，能誘導(dǎo)hsp70表達(dá)，隨積累量增加，又存在抑制表達(dá)的作用。Anne等［21］的試驗(yàn)中大西洋鮭暴露于15.1 mg/L和25.0 mg/L PFOS中1 d，hsp70 mRNA表達(dá)量顯著增加，暴露于PFOS中2 d時(shí)，25.0 mg/L組hsp70表達(dá)量較15.1 mg/L組下降，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

本試驗(yàn)分別檢測(cè)了hsp70 mRNA和蛋白表達(dá)量變化，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)hsp70 mRNA和蛋白表達(dá)量變化趨勢(shì)不一致，完整渦蟲暴露于PFOS中1 d時(shí)，hsp70 mRNA表達(dá)量上升，但對(duì)應(yīng)HSP70蛋白不存在顯著增加，再生渦蟲長(zhǎng)時(shí)間暴露于高濃度的PFOS中hsp70 mRNA表達(dá)量受到抑制，但對(duì)應(yīng)的蛋白表達(dá)量增加數(shù)倍?？赡艽嬖赑FOS對(duì)蛋白表達(dá)的抑制作用，低濃度的PFOS能通過(guò)某種作用，在mRNA高表達(dá)的情況下降低蛋白表達(dá)量，而高濃度的PFOS不存在這種抑制作用。

本試驗(yàn)中觀察到，高濃度長(zhǎng)時(shí)間PFOS處理完整渦蟲，會(huì)造成渦蟲軀體出現(xiàn)孔洞、殘缺以至完全解體，再生渦蟲比完整渦蟲更敏感，推測(cè)試驗(yàn)過(guò)程PFOS對(duì)渦蟲的氧化壓力是存在的，并且能引起渦蟲的凋亡，hsp70基因受到少量PFOS誘導(dǎo)作用而激活轉(zhuǎn)錄，但在蛋白表達(dá)過(guò)程中被PFOS抑制，蛋白量沒(méi)有顯著變化，大量PFOS 抑制基因的轉(zhuǎn)錄，但對(duì)蛋白表達(dá)沒(méi)有影響，所以HSP70蛋白表達(dá)量上升。另外，渦蟲在再生過(guò)程中，hsp70的表達(dá)量會(huì)有顯著升高，并且可能與再生早期干細(xì)胞的遷移聚集有關(guān)，而與細(xì)胞分裂分化無(wú)關(guān)，因此hsp70的表達(dá)在再生48 h時(shí)開始下降［22］，可能是本試驗(yàn)中造成完整渦蟲和再生渦蟲基因表達(dá)不同的原因。

4 結(jié)論

PFOS刺激渦蟲能夠引起渦蟲的應(yīng)激反應(yīng)，影響hsp70基因的轉(zhuǎn)錄，但mRNA量和蛋白量不成線性關(guān)系，可能存在PFOS對(duì)蛋白表達(dá)的抑制作用；低劑量PFOS對(duì)hsp70的影響大于高劑量，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制蛋白量，而高劑量PFOS作用正好相反。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Effects of PFOS on Expression of HSP70 in Planarian Dugesia japonica

Gong Xiaoning Yuan Zuoqing Bai Yun
（School of Life Science，Shandong University of Technogy，Zibo 255049）

Perfluorooctane sulfonate（PFOS）is a persistent organic pollutant and has been found to be the predominant perfluorinated chemicals（PFCs）in the environment. In this study, we used planarians Dugesia japonica, which belong to the phylum Platyhelminthes, class Turbellaria, as an animal assay to evaluate the toxicological effects of PFOS on protein and mRNA expression of HSP70. The results indicated that the expression of hsp70 mRNA of planarians increased exposed to PFOS in short time and decreased when planarians regenerated of 10-days. However, protein expression of HSP70 increased significantly after regenerating planarians exposed to PFOS for 4- and 7-days, and other groups were not influenced significantly. The trend of mRNA expression were inconsistent with protern. It may be that little PFOS would inhibit the translation of HSP70, and the number of HSP70 increased to protect from toxicity of PFOS as that was accumulated in planarians.

PFOS Planatian HSP70 RT-PCR Western blot

2014-02-12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31100377），山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（ZR2011CQ018）

宮曉寧，男，碩士研究生，研究方向；毒理學(xué)；E-mail：gongxiaoning321@163. com

袁佐清，女，博士，副教授，研究方向：毒理學(xué)；E-mail：yuanzuoqing2008@126.com