苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的克隆與原核表達(dá)

周夏 郭博智 高艷玲 趙奎軍 樊東

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的克隆與原核表達(dá)

周夏 郭博智 高艷玲 趙奎軍 樊東

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

促前胸腺激素（Prothoracicotropic hormone，PTTH）是一類重要的昆蟲激素，它對昆蟲生長、蛻皮、變態(tài)、滯育具有重要調(diào)控作用。以苜蓿夜蛾5齡幼蟲為材料提取總RNA，利用RT-PCR和RACE技術(shù)，擴(kuò)增得到苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的cDNA序列，該序列含有823個(gè)堿基，包括1個(gè)681個(gè)堿基的開放閱讀框，編碼1個(gè)含226個(gè)氨基酸的蛋白，分子量約為26.3 kD，等電點(diǎn)為8.51。序列分析表明，苜蓿夜蛾P(guān)TTH的氨基酸序列與其他昆蟲，尤其是鱗翅目夜蛾科昆蟲的PTTH高度同源。獲得的基因已登錄GenBank，登錄號為JF731347。利用原核表達(dá)載體pET21b在大腸桿菌中成功表達(dá)了苜蓿夜蛾P(guān)TTH基因，并用Ni-NTA親和層析柱將帶His-tag的目的蛋白進(jìn)行純化。

苜蓿夜蛾 促前胸腺激素 基因序列克隆 原核表達(dá)

促前胸腺激素（Prothoracicotropic hormone，簡稱PTTH）是由大腦神經(jīng)分泌細(xì)胞產(chǎn)生，刺激前胸腺分泌蛻皮酮的神經(jīng)肽類激素，對昆蟲的生長發(fā)育、蛻皮、變態(tài)、滯育［1-3］等起到重要的調(diào)控作用。作為第一個(gè)在無脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的激素，PTTH的研究始于1922年，由波蘭學(xué)者Kopec通過對舞毒蛾Lymantria dispar幼蟲蛻皮前進(jìn)行結(jié)扎、摘除腦的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)昆蟲形態(tài)變化受腦控制，他將其命名為腦激素［4］。1940年Wigglesworth在長紅獵椿Rhodnius prolixus中發(fā)現(xiàn)腦激素是由腦神經(jīng)分泌細(xì)胞產(chǎn)生的［5］。隨后Williams于1947年以惜古比天蠶的滯育蛹為材料，證明這種腦激素具有促進(jìn)前胸腺分泌蛻皮激素誘導(dǎo)變態(tài)的作用，所以把腦激素改稱為PTTH［6］。近年來對PTTH的研究不斷深入，對家蠶神經(jīng)肽促

前胸腺激素研究發(fā)現(xiàn)，家蠶PTTH基因mRNA的發(fā)育表達(dá)變化可能與其調(diào)控蛻皮激素合成的功能有關(guān)［7］。為了明確PTTH受體及其作用機(jī)制，Rewitz等［8］發(fā)現(xiàn)果蠅前胸腺特異性表達(dá)的Torso基因編碼PTTH受體［9］，而非之前人們猜測的G-蛋白偶聯(lián)受體。2012年王秋實(shí)等［10］從柞蠶中克隆得到血清素受體B（5HTRB），利用RNA干擾技術(shù)把5HTRB基因的dsRNA注射進(jìn)入蟲體，導(dǎo)致柞蠶滯育的終止，同時(shí)發(fā)現(xiàn)PTTH表達(dá)量增加，證明5HTRB可以抑制PTTH的合成，從而推測其可能是柞蠶的PTTH受體。為了研究PTTH對滯育蛹的作用，Mizoguchi等［11］于2013年研究發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)夜蛾Mamestra brassicae非滯育蛹化蛹后血淋巴中PTTH滴度維持在較高水平，而滯育蛹化蛹后PTTH滴度降到很低水平；相反化蛹后滯育蛹腦中PTTH表達(dá)量比在非滯育蛹腦中表達(dá)量高。這說明滯育蛹的腦中PTTH的表達(dá)量較高，但不釋放到血淋巴中。在立即注射PTTH后滯育蛹被誘導(dǎo)而化蛹，因此蛹滯育被證實(shí)是由于PTTH的分泌終止造成的。

1990 年Kawakami等［12］用分子克隆的方法第一次得到全長的家蠶PTTH分子，并證實(shí)具有活性的家蠶PTTH是一個(gè)糖基化的同源二聚體，通過一個(gè)分子間和三個(gè)分子內(nèi)的二硫鍵構(gòu)成［13］。目前已經(jīng)在煙芽夜蛾Heliothis virescens AY172671［14］，棉鈴蟲Helicoverpa armigera AY286543［3］，谷實(shí)夜蛾Helicoverpa zea AY172670［15］，煙實(shí)夜蛾Helicoverpa assulta AY780526，甜菜夜蛾Spodoptera exigua AY780527［16］，甘藍(lán)夜蛾AB748456［11］，家蠶Bombyx mori NM_001-043884，煙草天蛾Manduca sexta AY007724［17］，惜古比天蠶AF288695［18］，柞蠶U62535［19］，日本柞蠶Antheraea yamamai AY461435中成功克隆得到PTTH基因，這些基因的獲得為PTTH的深入研究提供了依據(jù)。

苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca屬鱗翅目，夜蛾科，主要危害豆科植物，如大豆、苜蓿等。苜蓿夜蛾以幼蟲直接取食為害，其分布廣泛，已成為大豆田中的重要食葉性害蟲。本研究克隆苜蓿夜蛾P(guān)TTH，獲取基因cDNA全長序列，并對該基因在大腸桿菌中的表達(dá)進(jìn)行研究，旨在為進(jìn)一步利用該基因從分子水平防治苜蓿夜蛾奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源 利用黑光燈在田間誘集苜蓿夜蛾成蟲，室內(nèi)飼以5%蜂蜜水使其產(chǎn)卵，并用未接觸任何農(nóng)藥的新鮮豆葉做飼料喂養(yǎng)到5齡幼蟲備用。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒及主要試劑 受體菌DH5α、BL21、表達(dá)載體pET21b由本研究室保存。RNA提取試劑盒TRIzol?Reagent（購自Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV Reverse Transcriptase、T4 DNA連接酶、低熔點(diǎn)瓊脂糖（購自Fermentas（FBI）公司）；克隆載體pMD18-T、DNA 膠回收試劑盒、DL2000 DNA Marker、TaKaRa 5'-Full RACE Kit（購自TaKa-Ra公司）；蛋白Marker和Ni-NTA親和層析柱購于北京全式金公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 按照TRIzol?Reagent試劑說明提取已進(jìn)行饑餓處理12 h的苜蓿夜蛾5齡幼蟲的總RNA，進(jìn)行純度和完整性鑒定后放入-80℃冰箱中備用。以dt-R0-Ri（表1）為cDNA合成引物，利用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV合成cDNA。最終產(chǎn)物保存于-20℃冰箱中。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 本研究所用引物及用途見表1，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.3 PCR產(chǎn)物克隆、鑒定及序列測定 比較煙蚜夜蛾（AY172671）以及棉鈴蟲（AY286543）兩種昆蟲PTTH基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)1對適用于克隆苜蓿夜蛾P(guān)TTH基因cDNA序列的部分片段的引物：PTTH 和antiPTTH（表1）。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收，與pMD18-T vector連接、轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α培養(yǎng)、雙酶切鑒定。連接正確的重組子由哈爾濱博仕生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測定。

1.2.4 利用RACE技術(shù)克隆cDNA全長序列 根據(jù)得到的基因片段設(shè)計(jì)PTTH 3'端cDNA序列的引物PTTH3' Ro和PTTH3' Ri（表1）。用PTTH3' Ro與3'-Ro進(jìn)行Outer PCR，電泳檢測后，用PTTH3' Ri和3'-Ri對Outer PCR產(chǎn)物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行3'RACE產(chǎn)物電泳分離檢測、克隆和測序，方法

同上。

表1 本試驗(yàn)中所用引物

5' RACE反應(yīng)按照TaKaRa 5' Full RACE Kit說明書，合成cDNA第一鏈，用PTTH 5' Ro和試劑盒提供的5'-RACE Outer Primer進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，然后以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用PTTH 5' Ri和5'-RACE Inner Primer（表1）進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，最后5' RACE產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離檢測、克隆和測序，方法同上。

進(jìn)入21世紀(jì)以來，通過“數(shù)字黃河”工程建設(shè)、水質(zhì)自動(dòng)監(jiān)測體系建設(shè)、黃河水資源保護(hù)重大問題研究等，水資源保護(hù)現(xiàn)代化水平和科技支撐能力不斷提高。

對以上幾個(gè)反應(yīng)獲得的序列片段進(jìn)行拼接，獲得PTTH的全長序列，根據(jù)全長序列設(shè)計(jì)克隆基因全長序列的引物PTTHF和PTTHR（表1），一次性克隆全長序列。

1.2.5 序列分析 用BioXM2.6軟件對獲得的cDNA序列進(jìn)行翻譯；利用ExPASy 網(wǎng)站（http：//us. expasy.org/tools/dna.html）蛋白分析軟件推導(dǎo)氨基酸序列的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和結(jié)構(gòu)域；SignalP 4.1 Server進(jìn)行信號肽的預(yù)測；CFSSP軟件進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測；SWISS-MODEL服務(wù)器進(jìn)行自動(dòng)建模（Automate Mode），預(yù)測該蛋白的三維結(jié)構(gòu)；同源性比較采用NCBI中的BLAST工具；進(jìn)化樹構(gòu)建采用ClustalX、MEGA4.1軟件。

1.2.6 苜蓿夜蛾P(guān)TTH基因原核表達(dá)及純化 用引物PTTH EcoR I（含EcoR I酶切位點(diǎn)）和PTTH Xho I（含Xho I酶切位點(diǎn)）（引物序列見表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物電泳檢測并回收。對回收產(chǎn)物和表達(dá)載體pET21b分別進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)物回收后使用T4連接酶16℃過夜連接，構(gòu)建表達(dá)載體pET21b-PTTH，并轉(zhuǎn)至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。藍(lán)白斑篩選出陽性克隆，搖菌、測序、提取質(zhì)粒，用EcoR I和Xho I雙酶切鑒定并測序驗(yàn)證，鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至BL21中。使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE凝膠電泳檢測，表達(dá)之后使用Ni-NTA親和層析柱純化帶His-tag的目的蛋白。

2 結(jié)果

2.1 苜蓿夜蛾P(guān)TTH的cDNA序列

利用RT-PCR和RACE獲得了苜蓿夜蛾P(guān)TTH的cDNA全長序列（圖1）。序列大小為823個(gè)堿基，開放讀碼框編碼226個(gè)氨基酸的多肽（圖2），分子量為26.3 kD，等電點(diǎn)為8.51。核苷酸序列在GenBank登錄，登錄號為JF731347。

圖1 苜蓿夜蛾P(guān)TTH全長cDNA序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 PTTH基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列特征分析

利用Expasy molecular biology server的Scanprosite facility對推導(dǎo)的苜蓿夜蛾促前胸腺激素氨基酸

的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。推導(dǎo)得到的苜蓿夜蛾促前胸腺激素氨基酸序列含有一個(gè)N-位糖基化位點(diǎn)和一個(gè)O-位糖基化位點(diǎn)。SignalP4.0進(jìn)行信號肽分析時(shí)發(fā)現(xiàn)PTTH推導(dǎo)的氨基酸在28和29位之間存在一個(gè)信號肽切割位點(diǎn)。含有PTTH特有的7個(gè)半胱氨酸殘基。通過CFSSP軟件預(yù)測PTTH蛋白的二級結(jié)構(gòu)，預(yù)測結(jié)果（圖3）顯示，β-折疊和α-螺旋是其最主要的二級結(jié)構(gòu)元件，其次是無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角。預(yù)測得到PTTH蛋白的三維結(jié)構(gòu)（圖4）。

圖2 苜蓿夜蛾P(guān)TTH基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

圖3 苜蓿夜蛾P(guān)TTH蛋白的二級結(jié)構(gòu)

圖4 PTTH蛋白的三級結(jié)構(gòu)

氨基酸序列比對結(jié)果表明，苜蓿夜蛾P(guān)TTH與其他登錄GenBank的昆蟲PTTH序列一致性達(dá)60%以上，其中與煙芽夜蛾（AY172671）、棉鈴蟲（AY286543）一致性最高，達(dá)92%，與谷實(shí)夜蛾（AY172670）、煙實(shí)夜蛾（AY780526）、甜菜夜蛾（AY780527）、甘藍(lán)夜蛾（AB748456）的一致性分別為91%、91%、75%和73%（圖5）；聚類分析表明苜蓿夜蛾P(guān)TTH與夜蛾科昆蟲PTTH親緣性相對較近，與非夜蛾科的鱗翅目昆蟲的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。苜蓿夜蛾與煙蚜夜蛾同源性最高，其在分類學(xué)上屬

于同一個(gè)屬Heliothis；而谷實(shí)夜蛾、棉鈴蟲和煙實(shí)夜蛾所在屬Helicoverpa與苜蓿夜蛾所在屬Heliothis是近緣屬，所以苜蓿夜蛾P(guān)TTH與這3個(gè)昆蟲PTTH的同源性相對較高（圖6）。

圖5 不同昆蟲PTTH氨基酸序列的多重比對

2.4 PTTH基因的原核表達(dá)分析

原核表達(dá)結(jié)果（圖7）表明，含非重組載體pET21b的BL21經(jīng)誘導(dǎo)后未檢測到目的條帶，而含目的基因的重組載體pET21b-PTTH的BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在26.3 kD左右出現(xiàn)特異性蛋白表達(dá)條帶，與預(yù)測的蛋白質(zhì)分子量接近。利用Ni-NTA親和層析柱純化蛋白，從圖7中5、6泳道可以看出，用咪唑緩沖液可以把目的蛋白洗脫出來，證明獲得較高純度的重組蛋白。

3 討論

本試驗(yàn)克隆得到一條苜蓿夜蛾促前胸腺激素的cDNA序列，通過與其他昆蟲PTTH基因進(jìn)行同源性

比較，可以明顯看出苜蓿夜蛾P(guān)TTH基因與鱗翅目4個(gè)夜蛾科昆蟲煙蚜夜蛾、棉鈴蟲、煙實(shí)夜蛾和谷實(shí)夜蛾的同源性較高，而與家蠶、柞蠶、惜古比天蛾和日本柞蠶同源性較低。事實(shí)上，苜蓿夜蛾與煙芽夜蛾在分類學(xué)上屬于同一個(gè)屬Heliothis，所以同源性最高；而苜蓿夜蛾所在屬Heliothis與谷實(shí)夜蛾、棉鈴蟲和煙實(shí)夜蛾所在屬Helicoverpa是近緣屬，所以苜蓿夜蛾P(guān)TTH與這3個(gè)昆蟲PTTH的同源性相對較高；苜蓿夜蛾與甜菜夜蛾、甘藍(lán)夜蛾雖然同屬夜蛾科，但所在屬是非近緣屬，所以同源性相對較低；同理苜蓿夜蛾與其他鱗翅目非夜蛾科昆蟲PTTH同源性更低。

圖 6 利用鄰接法構(gòu)建的鱗翅目不同種類昆蟲的PTTH基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖7 苜蓿夜蛾P(guān)TTH SDS-PAGE 電泳結(jié)果

構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET21b-PTTH在37℃誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分離，在大腸桿菌中高效表達(dá)出融合蛋白，但為包涵體蛋白。該表達(dá)系統(tǒng)能否表達(dá)出可溶性蛋白可通過進(jìn)一步的條件優(yōu)化進(jìn)行探討或者利用其他真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行研究。表達(dá)蛋白的獲得為下一步制備單克隆抗體及其生理功能研究奠定基礎(chǔ)。

Xu等［16］在分析甜菜夜蛾P(guān)TTH mRNA不同時(shí)期表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，mRNA在幼蟲期有一定的表達(dá)，并且在齡末升高；在化蛹初期有高表達(dá)，蛹中期維持在一定的表達(dá)水平，蛹末期則不斷增加，羽化前達(dá)到較高的表達(dá)水平；甜菜夜蛾幼蟲期和蛹期的PTTH含量變化和蛻皮變態(tài)的周期是完全一致的，顯示出PTTH在甜菜夜蛾行使其生物學(xué)功能很可能也是通過刺激前胸腺合成和分泌蛻皮激素來完成的。本研究后續(xù)工作將圍繞PTTH調(diào)節(jié)機(jī)制展開，明確不同發(fā)育階段、不同時(shí)間、不同光周期對苜蓿夜蛾P(guān)TTH及蛻皮激素表達(dá)量的變化，進(jìn)而研究兩者之間的關(guān)系。同時(shí)可通過RNAi技術(shù)手段研究苜蓿夜蛾P(guān)TTH的合成與釋放，設(shè)計(jì)相應(yīng)的藥物分子控制害蟲的生長發(fā)育，通過分子生物學(xué)手段以達(dá)到高效、綠色控制苜蓿夜蛾的目的。

4 結(jié)論

獲得苜蓿夜蛾P(guān)TTH cDNA全長，序列含有823個(gè)堿基，包括一個(gè)681個(gè)堿基的開放閱讀框，編碼一個(gè)含226個(gè)氨基酸的蛋白，分子量約為26.3 kD，等電點(diǎn)為8.51。GenBank登錄號JF731347。同源序列比對發(fā)現(xiàn)，苜蓿夜蛾P(guān)TTH氨基酸序列與其他昆蟲高度同源。構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET21b-PTTH，在大腸桿菌（BL21）中成功表達(dá)并獲得了純化的目的蛋白。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Molecular Cloning and Prokaryotic Expression of Prothoracicotropic Hormone cDNA Sequence from Heliothis viriplaca

Zhou Xia Guo Bozhi Gao Yanling Zhao Kuijun Fan Dong
（College of Agriculture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030）

Prothoracicotropic hormone（PTTH）is a group of important insect hormones. They have vital effect on regulation of growth, ecdysis, metamorphosis and diapause of insects. Total RNA was isolated from the fifth instar larvae of Heliothis viriplaca. The cDNA sequence was cloned by RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends（RACE）. The cDNA sequence was 823 base pairs in length and contained an open reading frame of 681 base pairs, encoding for a polypeptide of 226 amino acid residues, with a predicted molecular weight of 26.3 kD and pI 8.51. Sequence analysis showed that the predicted amino acid shared extensive similarities with those from other insects, especially the lepidopteran noctuid insects. The cDNA sequence has been deposited in GenBank with accession No. JF731347. The cDNA sequence was successfully expressed by the recombinant prokaryotic expression vector pET21b in E. coli. The recombinant protein with His-tag was purified by Ni-NTA affinity chromatography.

Heliothis viriplaca Prothoracicotropic hormone cDNA cloning Prokaryotic expression

2014-03-27

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)基金項(xiàng)目（CARS-04）

周夏，女，碩士研究生，研究方向：昆蟲生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：dnzhouxia@163.com

樊東，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：昆蟲生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：dnfd@163.com