無機鹽用量調整對太行菊不定芽增殖與生長的影響

趙元增 單長卷

（河南科技學院生命科技學院，新鄉(xiāng) 453003）

無機鹽用量調整對太行菊不定芽增殖與生長的影響

趙元增 單長卷

（河南科技學院生命科技學院，新鄉(xiāng) 453003）

以太行菊不定芽為材料，通過調整MS培養(yǎng)基中大量元素、微量元素、鐵鹽、Ca2+、K+的用量與配比，研究MS培養(yǎng)基不同的無機鹽用量水平對太行菊不定芽增殖和生長的影響。結果表明，太行菊不定芽的增殖與生長適應較高含量的MS大量元素，降低培養(yǎng)基中的MS大量元素用量，不定芽分化數(shù)量減少，增殖系數(shù)降低，并且不定芽長勢弱，葉片出現(xiàn)黃枯。單獨加倍MS培養(yǎng)基中的K+（KNO3與KH2PO4）含量，可促進太行菊不定芽的增殖與生長，不定芽增殖系數(shù)明顯高于對照及其他處理。增加或降低MS培養(yǎng)基中的Ca2+含量，對太行菊不定芽的增殖與生長影響不大；去掉培養(yǎng)基中的微量元素，不定芽的增殖與生長明顯受到抑制，不定芽分化數(shù)量減少，且不定芽的葉片枯死嚴重。減半培養(yǎng)基中的鐵鹽含量，對不定芽的生長影響較小；但加倍培養(yǎng)基中的鐵鹽含量，對不定芽的增殖和生長均產(chǎn)生強烈的抑制作用。

太行菊 不定芽 離體培養(yǎng) 增殖系數(shù)

太行菊［Opisthopappus taihangensis（Ling）Shih］是菊科太行菊屬多年生草本植物，為我國太行山區(qū)特有珍稀物種，僅見于豫、晉、冀三省交界的太行山區(qū)［1，2］。由于生境獨特，分布區(qū)域狹窄，繁殖能力弱，加之人為的大量挖掘采摘，太行菊現(xiàn)處于瀕危狀態(tài)，已被列為國家珍稀瀕危保護植物及河南省重點保護植物［1，2］。與傳統(tǒng)藥用野菊相比，太行菊具有更好的保健或藥用功效，其整株的開發(fā)利用潛力巨大［3，4］。近年來，出于對太行菊資源保護與綜合開發(fā)的需要，對太行菊的遺傳多樣性［5，6］、生殖生物學［7-10］、遠緣雜交等［11-16］的研究和報道逐漸增多。但對太行菊離體繁殖方面的研究極少，僅

見姚連芳等［17］、王建博等［18］兩篇報道。這些研究中均以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，側重于太行菊的形態(tài)發(fā)生與植物生長調節(jié)劑的作用，而對于培養(yǎng)基中的基本成分組成（特別是無機鹽）對太行菊離體培養(yǎng)的作用，國內外尚未見報道。由于太行菊多生長于向陽山谷的裸露崖壁或巖石的縫隙中，所處生境土壤稀少，有機質、全氮含量較低，鈣含量較高［19］?；谔芯盏莫毺厣?，其生長發(fā)育對各種無機鹽的需求可能存在特殊性，MS基本培養(yǎng)基的無機鹽含量水平對太行菊的生長發(fā)育并不一定適宜。為此，本試驗探討MS培養(yǎng)基不同無機鹽含量水平對太行菊不定芽增殖與生長的影響，旨在建立高效的太行菊繁育體系，為太行菊種質資源的保護和開發(fā)利用奠定基礎，同時對于太行菊的引種馴化與栽培也有借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

太行菊采自新鄉(xiāng)關山國家地質公園，接種材料為太行菊無菌不定芽。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基 在MS基本培養(yǎng)基的基礎上，保持其他組成成分用量不變，僅對培養(yǎng)基中的無機鹽按照表1所示進行含量水平調整。所有培養(yǎng)基中均加入蔗糖30 g/L，瓊脂粉4.6 g/L，6-BA 0.4 mg/L，NAA 0.1 mg/L，pH調整為5.8。

表1 培養(yǎng)基編號及其無機鹽用量

1.2.2 接種與培養(yǎng) 在超凈工作臺上，選擇長勢且大小一致的太行菊不定芽塊，將其切成1 cm3大小，然后將芽塊分別接種于以上各培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種20瓶，每瓶接種3塊。接種時不定芽塊基部嵌入培養(yǎng)基，不定芽生長點外露。

培養(yǎng)溫度 24-26℃，光照強度 1 500-2 000 lx，光照時間 12 h/d。

1.2.3 調查項目與方法 接種后7 d觀察、記錄不定芽開始增殖的情況，以后定期觀察不定芽的增殖情況及其長勢。接種培養(yǎng)40 d時，記錄每個處理的接種不定芽塊總數(shù)、芽塊大小、不定芽長勢（不定芽的葉色、葉片長度、葉片枯死情況等）等結果。然后將增殖后的不定芽塊切割成與接種時的一致大?。? cm3），統(tǒng)計各處理增殖后芽塊的分割總塊數(shù)，并計算各處理的增殖系數(shù)：不定芽增殖系數(shù)=增殖后芽塊的分割總塊數(shù)/接種芽塊總數(shù)。

2 結果

2.1 培養(yǎng)基中大量元素用量對太行菊不定芽增殖與生長的影響

培養(yǎng)基中MS大量元素的不同使用量，對太行菊不定芽的增殖與生長狀況產(chǎn)生較大影響（表2）。

由表2可見，在MS基本培養(yǎng)基（Ⅰ-1）與大量元素加倍的培養(yǎng)基（Ⅱ-1）中，芽塊均產(chǎn)生大量不定芽，不定芽增殖系數(shù)與芽塊大小相近，均達到較大值；并且不定芽生長正常，芽塊中很少存在枯死的葉片。兩者稍有差異的是，在大量元素加倍的培養(yǎng)基上（Ⅱ-1），不定芽較大且生長更為茁壯，有較多的不定芽的葉片長度達到5-10 mm，有些可達15-17 mm。當降低培養(yǎng)基中的大量元素用量時（Ⅱ-2和Ⅱ-3培養(yǎng)基），芽塊上新分化的不定芽數(shù)量減少，增殖系數(shù)降低，芽塊變小，芽塊表面出現(xiàn)顆粒狀的愈傷組織，不定芽的增殖受到抑制。此外，

隨著培養(yǎng)基中大量元素用量的降低，不定芽的長勢變差，芽體纖小，葉片枯黃，芽塊中變褐枯死的不定芽數(shù)量增多。特別是在1/4 倍MS大量元素的培養(yǎng)基上（Ⅱ-3），不定芽生長幾乎停滯，葉片細小卷曲且多呈水浸狀，淡黃至黃褐色，有些不定芽塊甚至整個枯死。

表2 大量元素不同用量對太行菊不定芽的增殖與生長的影響

2.2 培養(yǎng)基中Ca2+、K+用量對太行菊不定芽增殖

與生長的影響

為了進一步弄清MS大量元素中哪種無機鹽對太行菊不定芽的增殖與生長影響更大，我們調整了培養(yǎng)基中的KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O用量。太行菊不定芽在各培養(yǎng)基上的增殖與生長狀況，見表3。

表3 Ca2+、K+不同用量對太行菊不定芽的增殖與生長的影響

由表3可知，與對照（Ⅰ-1）相比，單獨改變培養(yǎng)基中的CaCl2·2H2O用量，對太行菊不定芽的增殖與生長影響相對較小。在CaCl2·2H2O用量減半（Ⅲ-1）、加倍（Ⅲ-2）與4倍（Ⅲ-3）的培養(yǎng)基上，接種芽塊均分化產(chǎn)生大量不定芽，不定芽增殖系數(shù)、芽塊大小及不定芽長勢都與對照相差不大。這表明太行菊不定芽的增殖與生長可適應較廣范圍的Ca2+濃度變化，MS基本培養(yǎng)基中CaCl2·2H2O的正常用量或減半即可滿足其生長發(fā)育的需要。

單獨加倍培養(yǎng)基中的K+（KNO3與KH2PO4）用量，對太行菊不定芽的增殖與生長有明顯的促進作用。當培養(yǎng)基中K+（KNO3與KH2PO4）用量加倍時（Ⅲ-4培養(yǎng)基），不定芽的增殖系數(shù)達到最大（7.82），明顯高于對照（Ⅰ-1），也高于Ⅲ-5培養(yǎng)基中Ca2+與K+同時加倍時的增殖系數(shù)（6.58）。并且在該培養(yǎng)基中，分化產(chǎn)生大量不定芽，不定芽大小均一，生長旺盛，葉色濃綠，芽塊中幾乎無黃化枯死的葉片。多數(shù)芽塊直徑在30 mm左右，有些芽塊甚至達到35 mm。當培養(yǎng)基中Ca2+、K+用量同時加倍時（Ⅲ-5培養(yǎng)基），不定芽的增殖與生長狀況稍差，不定芽分化數(shù)量減少，芽塊中出現(xiàn)少量黃褐色或褐色枯死的葉片。

2.3 培養(yǎng)基中微量元素用量對太行菊不定芽增殖與生長的影響

與對照（Ⅰ-1）相比，將培養(yǎng)基中的MS微量元素全部去除或將其用量加倍，對太行菊不定芽的增殖與生長都不利（表4）。兩者都將導致不定芽增殖系數(shù)大幅降低，芽塊變小，不定芽長勢變差。特別是在MS微量元素全部去除的培養(yǎng)基中（Ⅳ-1），不僅不定芽分化數(shù)量減少，并且不定芽生長停滯，小的不定芽葉片卷曲，水浸透明，較大的不定芽多數(shù)葉片黃化，芽塊中出現(xiàn)大量黃褐色至褐色的枯死的葉片。相比而言，加倍培養(yǎng)基中的微量元素用量（Ⅳ-2），對太行菊不定芽的生長影響相對較小。在Ⅳ-2培養(yǎng)基上，雖然分化產(chǎn)生的不定芽數(shù)量也大幅減少，但不定芽葉色淡綠，生長正常，芽塊中僅夾

雜少量黃化枯死的葉片，不定芽生長狀況好于去除MS微量元素的處理。

表4 微量元素用量對太行菊不定芽的增殖與生長的影響

2.4 培養(yǎng)基中鐵鹽用量對太行菊不定芽增殖與生長的影響

在MS鐵鹽用量不同的培養(yǎng)基上，太行菊不定芽的增殖與生長狀況（表5）顯示，減半或加倍培養(yǎng)基中的鐵鹽用量，對太行菊的不定芽增殖與生長均產(chǎn)生不利影響。與對照（Ⅰ-1）相比，當鐵鹽用量減半（Ⅴ-1）時，致使不定芽分化數(shù)量減少，芽塊變小，增殖系數(shù)降低。但不定芽生長基本正常，芽體大小、芽塊中枯葉多少等狀況與對照相似。當培養(yǎng)基中的鐵鹽用量加倍（Ⅴ-2）時，不僅不利于芽的分化，不定芽的生長也明顯受到抑制，絕大多數(shù)的不定芽纖小，葉片長度只有3-5 mm，并且葉片卷曲，水浸狀透明，葉尖、葉緣尤為嚴重。此外，在鐵鹽加倍的培養(yǎng)基中，芽塊中出現(xiàn)大量黃褐色至褐色的枯葉，致使整個芽塊顏色暗淡，毫無生機。

表5 鐵鹽用量對太行菊不定芽的增殖與生長的影響

3 討論

在植物的離體繁殖中，培養(yǎng)基中無機鹽含量是影響培養(yǎng)物增殖與分化的重要因素之一。針對不同植物對無機鹽需求的差異，研究者開發(fā)出了不同的高鹽培養(yǎng)基（如MS、B5、N6等培養(yǎng)基）、中鹽培養(yǎng)基（如Nitsch培養(yǎng)基）和低鹽培養(yǎng)基（如White培養(yǎng)基），分別用于不同植物類型、不同形態(tài)發(fā)生方式、不同培養(yǎng)階段的無機鹽需求［20］。對太行菊離體培養(yǎng)的研究很少，在已有研究中，研究者均采用MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基［17，18］。從理論上講，MS培養(yǎng)基的大量元素濃度較高，微量元素及有機成分齊全而豐富，適用于許多植物的增殖培養(yǎng)。因此，在對某種植物無機鹽需求未知的情況下，研究者常常采用MS培養(yǎng)基作為離體培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基。該法雖簡便可行，但未必對所培養(yǎng)植物是最適宜的。MS培養(yǎng)基中的無機鹽含量是否最適宜于太行菊的離體培養(yǎng)，還未見報道。

由于太行菊多生長于裸露崖壁或巖石的縫隙，所處生境土壤稀少，多為風化的石灰?guī)r與枝葉腐殖質構成的混合物［19］。在這樣的生境中，供太行菊生長發(fā)育所需要的無機鹽種類和含量相對貧乏，據(jù)此推測，MS培養(yǎng)基的高無機鹽水平也許并不適宜太行菊的生長發(fā)育。為此，本研究首先對培養(yǎng)基中的MS大量元素用量進行了加倍、減半及1/4倍處理。試驗結果表明，降低培養(yǎng)基中的大量元素用量，對太行菊不定芽的增殖與生長均不利，特別是在1/4倍大量元素用量的條件下，不定芽生長幾乎停滯，且枯死嚴重。相反，加倍培養(yǎng)基中的大量元素含量更有利于不定芽的生長與增殖。在自然界中，處于石縫中的太行菊能夠正常生長，并未出現(xiàn)枯萎死亡，太行菊是如何從有限且貧瘠的生境中獲取生長所需的N、P、K等大量元素的，也許測定太行菊的生境基質成分有助于解決這一問題。在太行菊的人工栽培與馴化中，提供豐富的N、P、K等大量元素供給，也許更有利于太行菊的生長。

太行菊生長的巖石縫穴主要由石灰?guī)r構成，有機質和全氮的含量較低，而全鈣的含量較高［19］。通過調整MS培養(yǎng)基中Ca2+（CaCl2·2H2O）用量，發(fā)現(xiàn)降低或提高Ca2+用量對太行菊不定芽的增殖與生

長影響較小，即使在4倍CaCl2·2H2O用量的條件下，太行菊不定芽也能基本正常生長。這表明，在較高鈣含量的生境條件下，太行菊已適應較廣范圍的Ca2+濃度變化，在高Ca2+濃度下也能正常生長發(fā)育。除石灰?guī)r風化產(chǎn)物外，太行菊生境中還有較多的腐化枝葉，這必將增加土壤中的K+含量，太行菊應當喜好K+豐富的基質條件，試驗結果印證了這一點。加倍培養(yǎng)基中的K+（KNO3與KH2PO4）用量，對太行菊不定芽的增殖與生長具有十分明顯的促進作用，在本試驗所有的處理中，該培養(yǎng)基上的太行菊不定芽的增殖與生長狀況表現(xiàn)最好。這表明K+在太行菊的生長發(fā)育中起重要作用，在其引種馴化時，適當加大鉀肥的供給，應當有利于太行菊的生長。

在植物的離體培養(yǎng)中，微量元素對形態(tài)發(fā)生的影響較大，而對已分化器官的生長影響相對較小，在一些簡化的培養(yǎng)基中，微量元素可以部分或全部省略掉，有時并無顯著的影響［21］。在本研究中，全部去除培養(yǎng)基中的MS微量元素，不僅使太行菊不定芽分化數(shù)量減少，不定芽的生長也受到嚴重抑制，不定芽生長停滯甚至枯死。這表明對于太行菊的離體培養(yǎng)，微量元素不僅為不定芽的分化所必需，對不定芽的正常生長也是必不可少的。

4 結論

在太行菊不定芽的增殖培養(yǎng)中，太行菊更喜好較高濃度的大量元素環(huán)境，降低培養(yǎng)基的大量元素用量，對太行菊不定芽的增殖與生長十分不利，而在基本MS與加倍MS大量元素用量的培養(yǎng)基上，太行菊不定芽的增殖與生長相對較好，并且兩處理間的差異不大。提高或降低培養(yǎng)基中的Ca2+（CaCl2·2H2O）用量，對太行菊不定芽的增殖與生長影響較小。單獨加倍培養(yǎng)基中的K+（KNO3與KH2PO4）用量，對太行菊不定芽的增殖與生長有明顯的促進作用，在太行菊不定芽的增殖培養(yǎng)中，可以選擇K+（KNO3與KH2PO4）用量加倍的改良MS培養(yǎng)基作為其增殖與生長的基本培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中的MS微量元素對于太行菊不定芽的增殖與生長是必不可少的，去除培養(yǎng)基中的微量元素將使不定芽分化數(shù)量減少，生長停滯，甚至枯萎死亡。相對而言，將培養(yǎng)基中的微量元素用量加倍，雖然不利于不定芽的分化，但對芽的生長影響較小。以MS基本培養(yǎng)基的鐵鹽用量為基準，降低培養(yǎng)基中鐵鹽用量，不利于不定芽的分化增殖，但對其生長影響不大。加倍培養(yǎng)基中的鐵鹽用量，對太行菊不定芽的增殖與生長均產(chǎn)生強烈的毒害作用，致使不定芽分化數(shù)量減少，生長受阻，甚至引起大量不定芽枯萎死亡。

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（責任編輯 馬鑫）

Effect of Adjustment for Inorganic Salt Contents on Adventitious Buds Proliferation and Growth of Opisthopappus taihangensis in vitro

Zhao Yuanzeng Shan Changjuan
（School of Life Science and Technology，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003）

The effect of different content of MS medium inorganic salts, including macro-element, micro-element, ferric salts, Ca2+and K+, on Opisthopappus taihangensis adventitious buds proliferation and growth were investigated using adventitious buds of Opisthopappus taihangensis as test materials. The results showed that the medium containing a relatively higher content of MS macro-element was more suitable for adventitious buds proliferation and growth of Opisthopappus taihangensis. The proliferation and growth of Opisthopappus taihangensis adventitious buds, which were tiny and weak, and many of adventitious buds leaves became yellow or brown, were inhibited on the medium with reduced content of MS macro-element. The adjusted medium with doubled content of KNO3and KH2PO4could facilitate the growth and prolif eration of Opisthopappus taihangensis adventitious buds；it showed the best performance on the proliferation and growth of adventitious buds among all treatments in the study. The adjustment, whether the Ca2+content increased or decreased in media, had little effect on the proliferation and growth of Opisthopappus taihangensis adventitious buds. The proliferation and growth of Opisthopappus taihangensis adventitious buds was inhibited on the proliferation medium without any micro-element. The proliferation and growth of adventitious buds was strongly inhibited on the proliferation medium containing a twofold content of ferric salts, but slightly affected on the medium with a half content of ferric salts.

Opisthopappus taihangensis Adventitious buds Culture in vitro Propagation coefficient

2014-04-21

河南科技學院博士科研啟動基金項目（201010612002），河南教育廳科學技術研究重點項目（14B210005）

趙元增，男，博士，副教授，研究方向：細胞工程與遺傳育種；E-mail：yuanzengzh@126.com