轉(zhuǎn)PcRS基因擬南芥的抗炭疽病研究

柳忠玉趙樹進(jìn)

（1.長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，荊州 434025；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，廣州 510010）

轉(zhuǎn)PcRS基因擬南芥的抗炭疽病研究

柳忠玉1趙樹進(jìn)2

（1.長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，荊州 434025；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，廣州 510010）

為確定虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.）白藜蘆醇合酶基因PcRS（Polygonum cuspidatum resveratrol synthase）提高植物抗病性的有效性，以轉(zhuǎn)PcRS 基因擬南芥為材料，對(duì)其進(jìn)行了分子鑒定和抗炭疽?。–olletotrichum higginsianum）研究。利用Southern blot和 Northern blot 驗(yàn)證了外源PcRS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組中的整合和表達(dá)。對(duì)經(jīng)過(guò)選育得到的T3代純合株系進(jìn)行離體的抗病性試驗(yàn)。轉(zhuǎn)基因擬南芥甲醇提取物對(duì)炭疽病菌具有明顯抑制作用。進(jìn)一步采用點(diǎn)滴法接種生長(zhǎng) 4 周的轉(zhuǎn)基因擬南芥離體葉片，與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因植株葉片壞死斑直徑和壞死斑上的孢子數(shù)目都顯著減少，表明轉(zhuǎn)基因擬南芥通過(guò)抑制孢子的繁殖來(lái)限制炭疽病菌的定植，從而提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)炭疽病的抗性。

虎杖 白藜蘆醇合酶 轉(zhuǎn)基因擬南芥 炭疽菌 抗病性

虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.）是蓼科多年生草本植物，根或根莖入藥，是重要的白藜蘆醇藥源植物之一。白藜蘆醇及其糖苷具有抗腫瘤、抗衰老、保護(hù)心血管系統(tǒng)等廣泛的生物學(xué)功能［1-3］。白藜蘆醇合酶（Resveratrol synthase，RS）是白藜蘆醇生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，在花生（Arachis hypogaea L.）、葡萄（Vitis vinifera L.）、大黃（Rheum tataricum L.）、高粱（Sorghum bicolor L.）、川鄂爬山虎（Parthenocissus henryana （Hemsl.）Diels et Gilg）中的白藜蘆醇合酶基因相繼被克?。?-7］?；蚪M測(cè)序顯示，葡萄中的白藜蘆醇合酶基因以基因家族的形式存在，白藜蘆醇合酶基因高達(dá)43個(gè)，其

中20個(gè)已經(jīng)被表達(dá)［8］。

現(xiàn)有的研究表明，白藜蘆醇合酶基因在提高植物抗病性或改良作物品質(zhì)方面有良好的應(yīng)用前景。來(lái)源于花生的白藜蘆醇合酶基因?qū)胲俎＃∕edicago sativa L.），可提高苜蓿對(duì)莖點(diǎn)霉病（Phoma medicaginis）的抗性［9］；該基因轉(zhuǎn)入地黃（Rehmannia glutinosa L.），則增強(qiáng)了地黃對(duì)尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的抗性［4］。將葡萄的白藜蘆醇合酶基因?qū)胄←?，增?qiáng)了轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)葉銹病（Puccinia recondite）和穎枯?。⊿eptoria nodorum）的抗性［10］；該基因?qū)敕竟虾?，轉(zhuǎn)基因的番木瓜增強(qiáng)了對(duì)疫霉菌（Phytophthora palmivora）的抗性［11］。但是，有些植物過(guò)量表達(dá)白藜蘆醇合酶基因后，雖然體內(nèi)積累了白藜蘆醇或白藜蘆醇苷，然而對(duì)病原菌的抗性并沒(méi)有提高。例如，在轉(zhuǎn)基因獼猴桃中白藜蘆醇苷含量達(dá)182 μg/g鮮重，但對(duì)灰霉菌（Botrytis cinerea）的抗性沒(méi)有提高［12］；轉(zhuǎn)基因白楊的白藜蘆醇苷含量高達(dá)615.2 μg/g鮮重，但對(duì)葉銹?。∕elampsora pulcherrima）的抗性沒(méi)有改變［13］。目前，白藜蘆醇合酶基因增強(qiáng)植物抗病性的機(jī)理尚不清楚，白藜蘆醇合酶基因家族成員的多樣性使得其作用機(jī)制更為復(fù)雜。

本實(shí)驗(yàn)室前期已克隆了虎杖的白藜蘆醇合酶基因PcRS（Polygonum cuspidatum resveratrol synthase），構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA1380-35S-PcRS，通過(guò)轉(zhuǎn)基因獲得了表達(dá)PcRS 的擬南芥T1代，研究證實(shí)過(guò)量表達(dá)PcRS可促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥中白藜蘆醇苷的合成［14］。但PcRS基因過(guò)量表達(dá)能否提高植物抗病性尚不清楚。

本研究以轉(zhuǎn)基因擬南芥T1為材料，連續(xù)多代種植。對(duì)篩選得到的T3代純合株系，通過(guò)體外抑菌活性檢測(cè)和離體抗病性試驗(yàn)進(jìn)行抗炭疽病研究，旨在為進(jìn)一步剖析PcRS基因在防御應(yīng)答炭疽病侵染過(guò)程中的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 以野生型擬南芥為受體，利用重組表達(dá)載體pCAMBIA1380-35S-PcRS 進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所得到的轉(zhuǎn)基因擬南芥 T1代，由本實(shí)驗(yàn)室培育。

1.1.2 菌株 供試病原真菌炭疽病菌（Colletotrichum higginsianum）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交 對(duì)經(jīng)潮霉素抗性篩選為陽(yáng)性的植株進(jìn)行Southern 雜交檢測(cè)。取10 μg基因組DNA，經(jīng)EcoR I 酶切DNA。以引物P1（5'-CCGGTACCATGGCAGCTTCAACTGAAG-3'）和P2（5'-CCGGATCCTTAAATGATGGGCACACTTC-3'）擴(kuò)增PcRS基因作為探針模板，探針標(biāo)記、雜交及檢測(cè)參照作者已經(jīng)建立的方法［14］進(jìn)行。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因植株的Northern 雜交檢測(cè) 提取擬南芥葉片總RNA，用甲醛變性凝膠進(jìn)行電泳，之后將凝膠中的RNA 轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，交聯(lián)5 min固定RNA。以上述引物P1和P2擴(kuò)增的PcRS基因作為探針模板，探針標(biāo)記、雜交及檢測(cè)參照作者已經(jīng)建立的方法［14］進(jìn)行。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株甲醇提取物的體外抑菌試驗(yàn) 生長(zhǎng)速率法測(cè)定植物甲醇提取物的抑菌活性，參照文獻(xiàn)［15］方法進(jìn)行，所有器皿及試劑均無(wú)菌。選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的轉(zhuǎn)基因及野生植株葉片，置于電熱恒溫干燥箱中以50℃烘干并粉碎。稱取一定重量的植物材料干粉，加入10倍體積（V/W）的甲醇，置于避光陰涼處，每次浸提持續(xù)24 h，重復(fù)浸提3次，合并浸提液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至質(zhì)量濃度為1 g/mL。在無(wú)菌條件下，配制提取物干粉濃度為100 mg/mL的水溶液，用移液槍吸取1 mL到裝有9 mL已融化PDA培養(yǎng)基（溫度約60℃）的三角瓶中，充分搖勻，再倒入90 mm的培養(yǎng)皿中制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的含藥培養(yǎng)基平板，接種炭疽菌菌餅（Φ=5.0 mm）。每處理重復(fù)3次。28℃培養(yǎng)7 d，再用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

抑菌率（%）=［（對(duì)照菌落直徑-0.5）-（處理菌落直徑-0.5）］/（對(duì)照菌落直徑-0.5）×100%

1.2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的離體抗病性鑒定 將炭疽菌接種在PDA上于28℃培養(yǎng)7 d，挑取黃色孢子團(tuán)懸浮于無(wú)菌水中，制備105-106個(gè)孢子/ mL的孢子懸浮液。采用點(diǎn)滴法接種鑒定抗病性，將生長(zhǎng)4周的擬南芥葉片剪下，用滅菌水清洗 3 次，分別置于墊

有濾紙保濕的容器中，再滴加10 μL孢子懸浮液于離體葉片上，28℃、相對(duì)濕度95%以上的培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后，測(cè)定壞死斑直徑。以野生型擬南芥為對(duì)照，重復(fù)3次。參照文獻(xiàn)［16］方法測(cè)定壞死斑內(nèi)孢子的數(shù)目。結(jié)果數(shù)據(jù)用SPSS19 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 PcRS基因的整合與表達(dá)

經(jīng)過(guò)潮霉素抗性篩選得到轉(zhuǎn)基因擬南芥T1代株系L3、L4、L5、L6、L7、L8和L15。提取葉片的基因組DNA，經(jīng)過(guò)EcoR I完全酶切，以PcRS基因特異片段為探針，并通過(guò) Southern blot方法檢測(cè)PcRS在植物基因組中的整合情況。雜交結(jié)果表明，所檢測(cè)的7個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，全部都有明顯的雜交信號(hào)，而野生型擬南芥無(wú)任何雜交信號(hào)，表明外源T-DNA（圖1-A）已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)基因擬南芥的基因組中。外源PcRS基因拷貝數(shù)介于1-7之間，其中轉(zhuǎn)基因擬南芥株系L4、L6和L15為單拷貝整合，株系L3、L5、L7和L8為多拷貝整合，其中株系L8 的拷貝數(shù)最高（圖1-B）。

為了分析外源基因PcRS在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況，分別提取擬南芥植株葉片的總RNA，進(jìn)行Northern blot分析。結(jié)果（圖1-C）顯示，野生型擬南芥植株無(wú)任何雜交信號(hào)；外源基因PcRS在轉(zhuǎn)基因擬南芥株系L4、L5、L6、L7和L15中均有表達(dá)，但是高拷貝整合株系L3、L8無(wú)任何雜交信號(hào)，說(shuō)明外源基因PcRS在株系L3和L8中發(fā)生基因沉默。

選取單拷貝轉(zhuǎn)基因株系L4和L6連續(xù)2代種植，篩選得到穩(wěn)定遺傳的T3代純合子株系，以T3代純合子株系為材料進(jìn)行后續(xù)的抗病性試驗(yàn)。

2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥甲醇提取物抑菌活性測(cè)定

為了驗(yàn)證PcRS基因的過(guò)量表達(dá)是否能提高擬南芥對(duì)炭疽病的抗性，將炭疽病菌接種在含不同株系甲醇提取物的 PDA 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d后發(fā)現(xiàn)，在含野生植株甲醇提取物的PDA培養(yǎng)基上，菌落直徑較大，而在含轉(zhuǎn)基因植株甲醇提取物的PDA培養(yǎng)基上菌落直徑明顯減?。▓D 2-A）。從抑制率來(lái)看（圖2-B），在10 mg/mL的濃度下，兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系甲醇提取物對(duì)炭疽病菌均有抑制作用，平均抑菌率分別達(dá)到55.2%和50.3%，二者的抑菌率無(wú)顯著差異。結(jié)果初步證明，在體外抑菌試驗(yàn)中過(guò)量表達(dá)PcRS基因的擬南芥可以較好地抑制炭疽病菌的生長(zhǎng)。

圖 2 轉(zhuǎn)基因植株體外抑菌試驗(yàn)

2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥離體葉片對(duì)炭疽病的抗性

在抗病性鑒定試驗(yàn)中，采用點(diǎn)滴法接種轉(zhuǎn)基因擬南芥的離體葉片，以野生型擬南芥為對(duì)照。野生型擬南芥離體葉片接種炭疽病菌孢子懸浮液后，第3天葉片開(kāi)始失綠并出現(xiàn)壞死點(diǎn)，7 d后葉片發(fā)黃并且形成大的壞死斑。而轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片失綠不明顯，7 d后出現(xiàn)較小的壞死斑。分析接種后7 d的葉片壞死斑直徑。結(jié)果（圖3-A，圖3-B）顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥株系L4和L6在接種7 d后，壞死斑直徑的平均值顯著小于野生型擬南芥，L4和L6之間的差異不顯著。

進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)壞死斑內(nèi)炭疽病菌的孢子數(shù)目，與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因植株葉片壞死斑上的孢子數(shù)目顯著減少（圖3-C）。這表明轉(zhuǎn)基因擬南芥通過(guò)抑制孢子的繁殖來(lái)限制炭疽病菌的定植，從而提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)炭疽病的抗性。說(shuō)明PcRS基因的超表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)炭疽病菌的抗性。

圖 3 轉(zhuǎn)基因植株離體葉片對(duì)炭疽病的抗性測(cè)定

3 討論

JA）等的關(guān)鍵信號(hào)分子的調(diào)控。例如，乙烯是植物與病原物互作中的一個(gè)重要的信號(hào)分子，是植物基礎(chǔ)抗性所必需的，同時(shí)它也能誘導(dǎo)植物的抗病反應(yīng)。雖然植物細(xì)胞中白藜蘆醇生物合成的信號(hào)調(diào)控機(jī)制還不清楚，但相關(guān)研究表明脅迫激素，如乙稀、水楊酸、茉莉酮酸等確實(shí)能誘導(dǎo)RS mRNA在葡萄［20，21］或花生［22］葉片中累積。在擬南芥中防衛(wèi)反應(yīng)中，受SA信號(hào)調(diào)控的抗性相關(guān)基因有PR1（Pathogenesis-related protein）、PR2（b-1.3-glucanase）和 PR5（Thaumatin-like）等［23］。受ET、JA信號(hào)調(diào)控的抗性相關(guān)基因有PDF1.2（Plant defensin 1.2）、PR3（basic chitinase）和PR4（chitinase type I and II）［24］。我們推測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥增強(qiáng)了炭疽病抗性：一方面可能是由于外源PcRS 基因的組成型表達(dá)直接導(dǎo)致抗病性增強(qiáng)；另一方面可能是外源PcRS 基因與擬南芥自身防御基因發(fā)生了直接或間接的互作，激發(fā)了更強(qiáng)的抗病反應(yīng)。所以后續(xù)試驗(yàn)可開(kāi)展對(duì)PR1、PR2、PR5、PDF1.2、PR3和PR4等相關(guān)基因表達(dá)分析，探討其協(xié)同抗病機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究以轉(zhuǎn)PcRS 基因擬南芥為材料，對(duì)其進(jìn)行了分子鑒定和抗炭疽病研究。體外抑菌試驗(yàn)和離體抗病性檢測(cè)結(jié)果表明，PcRS基因過(guò)量表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)炭疽病的抗性。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Studies on the Resistance of Transgenic Arabidopsis Overexpressing PcRS to Colletotrichum higginsianum

Liu Zhongyu1Zhao Shujin2
（1. College of Life Sciences，Yangtze University，Jingzhou 434025；2. General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou 510010）

In order to reveal the effectiveness of Polygonum cuspidatum resveratrol synthase（PcRS）gene in increasing tolerance to pathogenic microorganisms in foreign species, the PcRS transgenic Arabidopsis was used as material to identify its molecular characterization and study its resistance to Colletotrichum higginsianum. Integration and expression of transgene in the genome of Arabidopsis was confirmed by Southern blot and Northern blot analyses. Independent homozygous transgenic Arabidopsis lines with genetical stability were obtained after the selection of T3progenies and tested in vitro for disease resistance to C. higginsianum. Agar-plate bioassays were used to test the extracts of transgenic Arabidopsis for antifungal activity against C. higginsianum. Results showed that the mycelial growth of C. higginsianum was greatly inhibited. Then the detached leaves of 4-week-old Arabidopsis plants were used to inoculate. The lesion diameter and spore production significantly reduced on transgenic Arabidopsis. Overexpression of PcRS in transgenic Arabidopsis could restrict colonization of C. higginsianum by inhibition of spore production, resulting in enhanced resistance against C. higginsianum.

Polygonum cuspidatum Resveratrol synthase Transgenic Arabidopsis Colletotrichum higginsianum Disease resistance

2014-01-03

長(zhǎng)江大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（801100010122），廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（10151001002000012）

柳忠玉，女，博士，講師，研究方向：生物制藥；E-mail：zyliu2004@126.com

趙樹進(jìn)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：生物制藥；E-mail：gzzsjzhs@163.com