慢性腎臟病與非肌性肌球蛋白重鏈9基因多態(tài)性的相關(guān)性

王彩麗　劉麗萍　李增艷

我國慢性腎臟病(CKD)患病率橫斷面調(diào)查結(jié)果顯示>18歲人群中有1.2億CKD患者，但知曉率僅為12.5％[1]，CKD起病隱匿，58.7％～89.7％的患者是通過篩查發(fā)現(xiàn)的[2]，在臨床上若能找到一種基因與CKD的發(fā)病、進(jìn)展相關(guān)，又與高血壓、蛋白尿、腎功能損害等臨床表現(xiàn)相關(guān)，為早期診斷CKD提供理論基礎(chǔ)，以便早期診斷、早期治療CKD。

近年來用分子生物學(xué)的方法探討慢性腎臟病的發(fā)病機(jī)制，特別是利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)，已經(jīng)取得了令人振奮的進(jìn)展，其中一個(gè)最顯著和最有前途的基因是非肌性肌球蛋白重鏈9基因(MYH9)。國外研究初步證實(shí)MYH9基因多態(tài)性與非裔美國人非糖尿病腎病具有相關(guān)性，也影響歐裔美國人的腎功能[3-6]，但研究很少涉及其他種族和地區(qū)，本研究初步探討我國CKD患者與MYH9基因多態(tài)性的相關(guān)性。

對(duì)象和方法

對(duì)象選取在包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科住院的CKD患者301例作為CKD組，診斷符合NFK-K/DOQI標(biāo)準(zhǔn)，按照MDRD[7]及EPI-CKD[8]公式估算腎小球?yàn)V過率(eGFR)并進(jìn)行CKD分期。非CKD組294例，為體檢健康者。用EDTA-K+管采集所有研究對(duì)象晨起空腹外周靜脈血2 ml，-40℃冰箱保存。記錄CKD患者發(fā)病年齡、性別、血壓、24h尿蛋白定量、血清肌酐(SCr)、eGFR、原發(fā)病，晨起空腹靜息未服藥狀態(tài)下測量血壓。

所有研究對(duì)象均自愿參加，并簽知情同意書，該項(xiàng)目經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

采用鹽析法從外周血中提取DNAMYH9基因總序列(chromosome:NCBI36:22:35006673:35114558:-1)primer 3在線設(shè)計(jì)引物由大連寶生物工程公司合成，DNAMAN設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)以基因組DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表1)。PCR反應(yīng)體系：DNA模板2 μl，10×buffer 1.25 μl，上下游引物各0.25 μl，dNTP 0.25 μl，Taq酶0.5 μl，雙蒸水8 μl。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性180s，94℃變性35s，55℃退火45s，72℃延伸55s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃終末延伸10 min。酶切體系：PCR產(chǎn)物10 μl，內(nèi)切酶0.5 μl、緩沖液2 μl，雙蒸水7.5 μl。用2％瓊脂糖4.0 g/dl溴乙錠凝膠方法電泳，在紫外透射自動(dòng)成像分析儀上成像。

表1　目的基因引物序列及內(nèi)切酶、酶切位點(diǎn)

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，基因頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗(yàn)。計(jì)量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，符合正態(tài)分布、方差齊性的數(shù)據(jù)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析(One-Way ANOVA)比較組間差異，不符合的采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料結(jié)果用頻數(shù)和率來描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)(Chi-Square檢驗(yàn))，計(jì)量資料兩兩比較采用LSD法。危險(xiǎn)因素分析采用Logistic回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

結(jié)　　果

基本資料CKD組患者男性148 例，女性153例，平均年齡(54.5±16.2)歲；非CKD組男性180例，女性114例，平均年齡(45.5±15.2)歲。兩組研究對(duì)象在年齡、性別構(gòu)成上均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。應(yīng)用Hardy-Weinberg定律進(jìn)行檢驗(yàn)rs3752462、rs4821480位點(diǎn)均符合群體遺傳平衡(P>0.05)。兩位點(diǎn)CKD組與非CKD組基因型分布頻率及等位基因分布頻率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2CKD組和非CKD組rs3752462、rs4821480位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率比較

CKD：慢性腎臟病

CKD組按Rs3752462位點(diǎn)基因型CC、TT、CT分為三個(gè)亞組比較相關(guān)性CT基因型的患者收縮壓水平高于CC基因型的患者(P<0.05)； CC基因型的患者eGFR高于CT、TT基因型的患者(P<0.05)； CC基因型的患者年齡小于CT基因型的患者(P<0.05)。舒張壓及24h尿蛋白定量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3　Rs3752462位點(diǎn)三種基因型臨床資料比較

由于CKD 5期患者無尿或少尿，尿蛋白定量測定無法真實(shí)地反應(yīng)腎臟病變進(jìn)展的程度，將CKD 1～4期的患者按尿蛋白定量值分為大量尿蛋白(≥3.5 g/24h)和非大量蛋白尿(<3.5 g/24h)亞組，TT、CC、CT基因型分布及等位基因分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但非大量蛋白尿亞組CC基因型分布頻率高于大量蛋白尿亞組(表4)。

CKD不同原發(fā)病的比較按CKD原發(fā)病的不同將其分為高血壓腎損害組(HPN)、糖尿病腎病組(DN)、間質(zhì)性腎炎組(CIN)、慢性腎小球腎炎組(CGN)。各組間基因型及等位基因分布頻率的比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

降壓藥使用CC基因型患者使用各種降壓藥的頻率(7.4％)與TT(43.9％)、CT(48.7％)基因型患者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表5)。

表4　rs3752462位點(diǎn)基因型及等位基因與蛋白尿及原發(fā)病比較

表5　不同基因型患者降壓藥治療頻率的比較[例(％)]

多因素分析將收縮壓水平是否>140 mm Hg作為因變量，將性別、年齡、基因型、腎小球?yàn)V過率、發(fā)病時(shí)的24h尿蛋白定量作為自變量，進(jìn)行二分類多因素的Logistic回歸。結(jié)果顯示，CC基因型患者的收縮壓顯著低于TT+CT基因型的患者，CC基因型是CKD收縮壓增高的保護(hù)因素。女性收縮壓顯著低于男性，提示女性是CKD收縮壓增高的保護(hù)因素。

將患者是否達(dá)到終末期腎病(ESRD)作為因變量，將年齡、發(fā)病時(shí)的24h尿蛋白定量、基因型分別賦值作為自變量，進(jìn)行二分類Logistic回歸。結(jié)果顯示,CC基因型是CKD病情發(fā)展至ESRD的獨(dú)立保護(hù)因素。

討　　論

MYH9位于22號(hào)染色體，編碼非肌性肌球蛋白重鏈ⅡA(NMMHCA，MYHⅡA)，該蛋白是非肌細(xì)胞骨架的重要組成部分[9]，MYH9基因可表達(dá)在腎小球足細(xì)胞、毛細(xì)血管和腎小管[10]；MYH9異常表達(dá)、定位或改變MYH9的功能都會(huì)導(dǎo)致異常的肌球蛋白，使足細(xì)胞和腎小管的細(xì)胞骨架受損，進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白尿、血尿、甚至腎臟損害[11]。國外研究證實(shí)NMMHC2ⅡA氨基末端突變發(fā)生腎小球疾病的風(fēng)險(xiǎn)高[10]，特別是在702位精氨酸的突變(R702C)與最嚴(yán)重的表型有關(guān)，突變發(fā)生在羧基末端則不會(huì)導(dǎo)致腎臟損害。

MYH9基因在腎臟病領(lǐng)域研究較晚，國外對(duì)其研究已取得初步成果，MYH9與局灶節(jié)段性腎小球硬化、人類免疫缺陷病毒相關(guān)性腎病、HPN、DN、IgA腎病等CKD的相關(guān)性均有報(bào)道，已初步證實(shí)MYH9基因與CKD具有一定的相關(guān)性。然而，國內(nèi)此類報(bào)道罕見，我們?cè)趪鴥?nèi)首先研究CKD與MYH9基因多態(tài)性的相關(guān)性，為基因檢測提供理論基礎(chǔ)。

非裔美國人腎臟病與高血壓的研究(AASK)證實(shí)MYH9基因rs4821481位點(diǎn)與HPN相關(guān)，對(duì)于腎功能進(jìn)行性惡化和SCr≥265.2 μmol/L的AASK受試者有更高的相關(guān)性，其中161例SCr≥265.2 μmol/L的受試者M(jìn)YH9基因rs11912763和rs1005570與HPN有高度相關(guān)性[12]。國內(nèi)研究證實(shí)收縮壓每升高20 mmHg,蛋白尿及CKD的構(gòu)成比就明顯增加[13]。我們?cè)趯?duì)MYH9基因rs3752462位點(diǎn)的研究中發(fā)現(xiàn)，攜帶CC基因型患者的收縮壓顯著低于TT+CT基因型的患者，可推測CC基因型是CKD患者收縮壓增高的保護(hù)因素，等位基因C突變?yōu)門可導(dǎo)致收縮壓升高，因此我們?cè)谂R床工作中做MYH9基因檢測可早期發(fā)現(xiàn)CKD合并高血壓的患者。本研究還顯示CC基因型患者服用降壓藥的頻率小于其他兩種基因型，患者服用對(duì)腎功能有保護(hù)作用的ACEI、ARB類藥物比例較高,可推測攜帶CC基因型的CKD患者只要服用很少的降壓藥，血壓即可控制良好，而攜帶T等位基因的CKD患者即使是服多種降壓藥，血壓仍難以控制在正常范圍，使可解釋臨床工作中頑固性高血壓的問題。從CKD原發(fā)病的角度來說，攜帶CC基因型的CKD患者原發(fā)病幾乎沒有高血壓病，這也進(jìn)一步證實(shí)了CC基因型是高血壓的保護(hù)因素。本組資料多因素分析結(jié)果提示，基因型并不是CKD收縮壓增高的獨(dú)立保護(hù)因素，性別、eGFR對(duì)其也有一定的影響，具體該基因是直接影響血壓進(jìn)而影響CKD的進(jìn)展，還是通過影響CKD的進(jìn)展進(jìn)而影響血壓，還有待進(jìn)一步研究。

基因型不但影響血壓，而且還影響eGFR，我們研究發(fā)現(xiàn)：MYH9基因Rs3752462位點(diǎn)CC基因型的eGFR高，是CKD病情發(fā)展至ESRD的獨(dú)立保護(hù)因素，等位基因C突變?yōu)門可能導(dǎo)致ESRD的發(fā)生，從而加速CKD的進(jìn)展。非大量蛋白尿亞組CC基因型分布頻率高于大量蛋白尿亞組，攜帶CC基因型的患者尿蛋白少、eGFR下降慢、對(duì)腎功能有保護(hù)作用；可推測攜帶CC基因型的患者通過對(duì)血壓及蛋白尿的保護(hù)，延緩CKD的進(jìn)展。

本研究發(fā)現(xiàn)rs4821480位點(diǎn)TT基因型比例(99％)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于TG基因型(1％)，GG基因型缺如，與國內(nèi)學(xué)者的研究結(jié)果一致[11]，故未對(duì)此位點(diǎn)進(jìn)一步分析與CKD的相關(guān)性。這可能是中國人MYH9基因的特點(diǎn)，與種族差異有關(guān)。

用免疫熒光定量的方法分析血涂片中的NMMHC-ⅡA是一種有效的診斷MYH9相關(guān)疾病的方法，其敏感度100％、特異度95％[14]。組織學(xué)特征可幫助制定基因突變篩查的項(xiàng)目，早期基因診斷可幫助我們預(yù)測患者今后可能出現(xiàn)的并發(fā)癥及疾病的發(fā)展。Gupta等[15]推薦在臨床工作中至少每年做一次腎臟病普查和MYH9基因檢測，以盡早發(fā)現(xiàn)CKD。對(duì)于MYH9相關(guān)的CKD，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素Ⅱ-Ⅰ型受體拮抗劑可有效減少尿蛋白和延緩腎功能的進(jìn)展[16]

小結(jié)：本研究基于中國人這一隊(duì)列，在國內(nèi)首先提出CKD與MYH9的相關(guān)性，一方面是MYH9與CKD高血壓的相關(guān)性，另一方面是MYH9與CKD疾病進(jìn)展的相關(guān)性。在分子生物學(xué)水平上探討CKD病情進(jìn)展的新機(jī)制，為早期基因診斷奠定基礎(chǔ)，早期基因檢測可預(yù)測CKD合并高血壓的發(fā)生率、預(yù)測腎功能進(jìn)展的程度、并提供個(gè)體化的治療方案。

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