生物技術在苧麻研究及育種中的應用

王富強，龔秋林，潘其輝，張 萍，吳艷，陳曉蓉

(江西省麻類科學研究所，江西宜春 336000)

苧麻(Boehmeria nivea L.)別名野麻、白麻、青麻等，又被稱為“中國草”，屬蕁麻科苧麻屬，是原產(chǎn)于我國的特色紡織纖維原料作物。苧麻纖維織物質地輕、透氣性好、吸濕散濕、吸熱散熱快，而且具有防腐防霉變的特點，主要用于制作夏布、汽車座套以及加工成高檔紡織品等，被譽為“天然纖維之王”，是我國僅次于棉花的第2大纖維作物。雖作為我國的特色優(yōu)勢傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，苧麻產(chǎn)業(yè)卻很容易受到國際市場的影響，國際市場的不斷大幅波動直接影響了苧麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

在國內(nèi)，苧麻的研究主要集中在湖南、湖北、江西和四川等地。目前，苧麻生產(chǎn)制造業(yè)正面臨著加工設備落后、脫膠技術工藝落后、污染嚴重、人工成本較高等一系列問題［1］。近年來，整個苧麻產(chǎn)業(yè)的不景氣，直接導致了麻農(nóng)的種麻積極性嚴重下降，苧麻生物技術正逐漸取代苧麻常規(guī)育種而成為苧麻研究的新動力。筆者對苧麻研究中生物技術的應用進行簡要綜述，現(xiàn)報道如下。

1 組織培養(yǎng)

組織培養(yǎng)技術在苧麻中的研究始于1979年［2］。在隨后的十幾年中，研究主要集中在苧麻快繁、花藥培養(yǎng)、莖尖脫毒和原生質體培養(yǎng)、保存野生苧麻品種等方面。隨著近年來苧麻產(chǎn)業(yè)的急劇萎縮，苧麻壓條以及營養(yǎng)缽扦插技術的出現(xiàn)，利用組織培養(yǎng)進行快繁已基本失去了在生產(chǎn)中的實際意義，同時莖尖脫毒和原生質體培等技術養(yǎng)取得的實用成效不明顯，應用也不多。近年來，研究重點主要集中在建立苧麻轉基因高頻轉化體系中，現(xiàn)已經(jīng)建立起了一系列包括愈傷組織和子葉、下胚軸、莖段、莖尖、葉片以及腋芽等外植體再生植株體系，為轉基因在苧麻中的利用發(fā)展解決了最基礎的問題。

苧麻是雜合體，直接利用種子繁育會發(fā)生性狀分離，通常采用無性繁殖的方式進行田間生產(chǎn)擴繁。研究中外植體取材一般直接取用研究苧麻品種(系)的植株組織，苧麻表面絨毛較多，外植體消毒成功率不高，較常用的外植體組織包括莖尖、嫩葉等。苧麻無菌苗的獲得是組織培養(yǎng)研究的基礎，無菌苗相對于直接用外植體消毒有很大的優(yōu)勢［3］，通過反復切取莖段可以獲得大量的苗，同時因為苧麻葉片含有大量的酚類物質，從田間取材的葉片提取DNA的純度不高，而利用苧麻無菌苗葉片提取的DNA則可明顯的改善這一問題，這也是苧麻組織培養(yǎng)的一個利用途經(jīng)。

2 無融合生殖

植物無融合生殖是介于有性生殖與無性生殖之間不經(jīng)過受精卵而直接形成種子的一種特殊的生殖方式。其二倍體子代基因型與母本相同，可用于固定雜種優(yōu)勢及遺傳育種研究，可以很大限度地固定雜種優(yōu)勢而不會出現(xiàn)性狀分離，這不僅可以節(jié)省每年大量的雜交制種的花費，更有利于新奇的、未被充分利用的種質的快繁［4］。同時，苧麻無融合生殖的研究在苧麻的起源及進化研究中也具有很重要意義［5－6］。從事苧麻無融合生殖研究利用的人員較少，主要有中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所的臧鞏固教授、熊和平院士以及華中農(nóng)業(yè)大學的彭定祥教授等。

20世紀90年代初，臧鞏固等發(fā)現(xiàn)了苧麻屬植物的無融合生殖現(xiàn)象，隨后便進行了野生苧麻屬無融合生殖種質資源的收集與整理工作，經(jīng)過20多年的努力，現(xiàn)已經(jīng)在國內(nèi)收集到6個專性無融合生殖種［7］。苧麻無融合生殖研究工作者的研究主要集中在苧麻無融合生殖的誘導與利用［8－9］、懸鈴葉苧麻染色體行為［6］與無融合生殖基因以及其類型起源的遺傳基礎研究等。臧鞏固等對其收集到的6個苧麻屬植物專性無融合生殖種通過胚胎學鑒定出其屬二倍體孢子生殖類型，并且他們還發(fā)現(xiàn)了在自然界罕見的情況，在同一山坡上苧麻屬同一種內(nèi)專性無融合生殖類型與專性有性生殖二倍體類型并存，它們外部形態(tài)幾乎相同。這意味著臧鞏固等不僅發(fā)現(xiàn)了該苧麻屬植物無融合生殖類型的發(fā)源地以及其有性生殖祖先;這發(fā)現(xiàn)也同時表明控制該苧麻屬植物無融合生殖發(fā)生的可能是由基因點突變所引起的［7］。這個重要發(fā)現(xiàn)為苧麻的無融合生殖研究提供了難得的理想材料，但截至目前，他們利用種間雜交的方式來試圖轉移無融合生殖基因的方法還未成功。

華中農(nóng)業(yè)大學的彭定祥、劉立才等在懸鈴葉苧麻中也發(fā)現(xiàn)了4個與生殖調(diào)控相關基因可能參與苧麻無融合生殖，李延坤等也利用mRNA差異顯示對懸鈴葉苧麻無融合生殖相關基因進行了初步篩選工作［10］，中國農(nóng)科院麻類研究所就苧麻無融合生殖的研究已開展了一系列的分子生物學研究。

3 分子標記輔助育種

苧麻分子標記的研究起步較晚，以建立各分子標記反應體系和篩選各分子標記引物為主，已經(jīng)應用在苧麻中的分子標記主要有 SSR、ISSR、RAPD、SRAP、AFLP和 RSAP等。研究主要集中在苧麻當家栽培品種與野生種質資源的分析利用［11］、苧麻屬內(nèi)親緣關系及遺傳多樣性研究、苧麻系統(tǒng)發(fā)育關系及居群遺傳學研究［12］、苧麻雄性不育［13］、自交后代純度分析［14］以及無融合生殖［15］等。分子標記技術在苧麻中的應用有助于挖掘苧麻特別是野生苧麻品種中的優(yōu)良基因，同時也為研究苧麻屬的親緣關系等方面提供了更加準確的方法。

4 轉基因技術

轉基因技術在苧麻育種中應用相對較晚。從1983年世界上首例轉基因植物—煙草的誕生，到10年后才獲得了世界上第一例轉基因苧麻。目前，在苧麻上應用的轉基因方法有農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化法、基因槍轉化法、超干胚浸漬法和花絮侵入法等。

1993年，Dusi等［16］用農(nóng)桿菌介導法將一個與蛋白質相關聯(lián)的基因導入到飼用苧麻中，獲得經(jīng)GUS標記檢測與Southem雜交檢測呈陽性植株。2005年，陳建榮等［17］優(yōu)化并建立了苧麻根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化體系，獲得了卡那霉素抗性植株。隨后，易自立等［18］用以“湘苧二號”下胚軸為受體，將BT基因成功導入到苧麻中?？兹A等［19］采用葉盤法將含輪狀病毒外殼抗原蛋白VP4基因導入到苧麻圓葉青中，并獲得經(jīng)PCR及Southemblot分析呈陽性植株。汪波等［20］將綠色熒光蛋白(GFP)基因導入到苧麻中，對抗性植株的GFP熒光檢測和Southemblot分析結果顯示，外源基因已經(jīng)成功整合到苧麻基因組中。至2009年，符家平等對苧麻轉PsAG12-IPT基因和BT基因的分子檢測及性狀考察，首次對轉BT基因苧麻盧竹青T0和T1代植株進行室內(nèi)抗蟲鑒定以及大田主要農(nóng)藝性狀和品質性狀考察，結果顯示轉BT基因植株不僅在T0到T1代穩(wěn)定遺傳，而且T1代植株的大田抗蟲性明顯優(yōu)于非轉基因對照植株［21－23］。2010 年馬雄風［24］和宮本賀［25］分別用農(nóng)桿菌介導法和基因槍法將雙價抗蟲基因(CryIA+CpTI)成功導入到苧麻中，宮本賀對轉化植株的T0代植株進行了檢測和篩選以及相關抗蟲性的鑒定，同時還對T1代目的基因的穩(wěn)定性進行了檢測。

近年來，苧麻再生與苧麻農(nóng)桿菌介導法及基因槍法轉基因體系不斷得到優(yōu)化，為轉基因技術在苧麻中的應用不斷奠定基礎。

5 倍性育種

5.1 單倍體育種 單倍體育種有2大優(yōu)點:縮短育種周期和提高隱性基因的選擇效率。主要方法有花藥培養(yǎng)、用未受粉子房進行離體培育、無融合生殖和雙胚苗等。單倍體育種在苧麻中研究較少，主要有花藥離體培養(yǎng)和無融合生殖培養(yǎng)等。

1990年，顏昌敬等［26］對“蘆竹青”、“湘竺 l號”和“諸暨”三個品種進行了花粉培養(yǎng)，經(jīng)過培養(yǎng)條件的優(yōu)化，首次通過苧麻花藥培養(yǎng)獲得了再生植物。1994年，劉國民等［27］研究了外源激素在苧麻花藥培養(yǎng)中的作用，他指出了苧麻花藥愈傷組織的誘導必需添加外源激素，通過細胞學觀察發(fā)現(xiàn)外源激素能夠促進更多花粉啟動雄核發(fā)育，同時在花粉多細胞團突破花粉壁形成愈傷組織的過程中是必需存在的。2007年，孫珍夏［28］對談家河麻等13個品種材料的花藥愈傷組織培養(yǎng)進行了研究，初步形成了一套從苧麻花藥離體培養(yǎng)愈傷組織到愈傷組織倍性鑒定的完整體系，為以后的研究奠定了一定的基礎。

5.2 多倍體育種 苧麻種植主要以扦插、壓條等無性繁殖方法為主，剛好可以利用多倍體育種中常出現(xiàn)的種子結實率低的問題，同時多倍體植株一般具有植株高大和抗逆性強等特點，這正是作為韌皮纖維作物所需要的。

利用多倍體育種來改良現(xiàn)有苧麻主栽品種，還具有見效快、耗時短和收益大等特點。常用的方法為利用不同濃度的秋水仙素對苧麻不同部位及種子進行誘導。

早在20世紀60年代，我國臺灣省的C.Y.Chi和M.IJ.Lai就報道了利用秋水仙素以苧麻“南方綠皮種”種子為材料進行誘變，同時探討了不同秋水仙素的處理濃度與時間對處理效果的影響。當時，他們還曾以“南華青皮”為親本材料，誘導出四倍體品系Me-60-2和Me-60-11。20世紀80年代初，謝卓榮等［29］研究了以不同濃度的秋水仙素分別對苧麻試管苗、地下莖和種子進行處理來誘導多倍體，在次年以“黃殼早”和“蘆竹青”品種成功誘導出43株多倍體單株，同時也指出了苧麻各不同處理部位的秋水仙素適宜使用濃度以及總結了各處理方法的優(yōu)缺點。1989年，中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所獲得了苧麻多倍體植株。湖南農(nóng)學院也在隨后的3年內(nèi)使用1%濃度的秋水仙素處理苧麻，方法包括誘導苧麻種子浸漬法、滴生長點、定量注射法和組織培養(yǎng)法，最終獲得50多株多倍體植株進行擴大繁殖。1990年，潘昌立等［30］以“湘竺二號”等18個品種(系或組合)為材料，比較了不同濃度的秋水仙素以及不同的處理時間對苧麻不同器官或部位的誘導效果。試驗結果顯示，誘導材料選擇子葉期實生苗莖尖最佳，早期誘導率便達到9.04%，為當時國內(nèi)已報道的5倍。同時，他還提出了鑒定多倍體的簡單方法:首先根據(jù)多倍體苧麻特征特性表型進行大田目測觀察，然后結合花粉鏡檢初選，最后再以染色體技術為準，可提高多倍體苧麻的篩選效率。

6 誘變育種

誘變育種，是利用理化因素誘導變異，再通過選擇而培育新品種的育種方法。輻射誘變的研究始于20世紀20年代，我國從60年代中期開始在水稻、小麥、大豆等作物上利用輻射誘變育成新品種。據(jù)國際原子能機構(IAEA)統(tǒng)計，截止到2008年全世界通過輻射已育成2 775個植物品種。目前，筆者僅查閱到Co60-γ射線照射和航天育種2種物理誘變方法在苧麻育種中的研究報道。

6.1 核輻射 20世紀70年代初，中國農(nóng)科院麻類研究所率先進行了苧麻核輻射誘變育種研究。以Co60-γ射線為輻射源，利用湘苧一號自交種子為材料，1974年從0.5萬倫琴輻照后代群體中選出編號為“74－69”的優(yōu)良變異單株，隨后由于綜合性狀優(yōu)良并且穩(wěn)定，經(jīng)過篼系、品系比較試驗以及全國區(qū)域試驗。另外一個品種“圓葉青”也在1984年通過技術審定。1990年，2個品種通過全國農(nóng)作物品種委員會審定［31］。湖南大學從1981年開始也進行了輻射誘變育種工作，選育出了一些品系但最終未獲得新品種［32］。

6.2 航天育種 航天育種作為作物育種的新型領域，具有比地面核輻射誘變育種變異大、突變多以及穩(wěn)定快等特點，正在受到越來越多的親睞，并且已經(jīng)有太空辣椒、茄子、番茄等作物獲得成功并推廣。

2002年12月，江西省麻類研究所將苧麻“贛苧三號”種子搭載“神舟四號”飛船送上太空，并在接下來的2年中對其出苗率、成苗率以及植物學形狀進行觀察以及篩選。結果顯示，航天種子的發(fā)芽率降低，植物學性狀有明顯變異，最后經(jīng)篩選得到23株植物學性狀較優(yōu)良的單株［33］。經(jīng)過長期篩選，留下一個相對較為優(yōu)良的品系，并且利用其進行了雜交育種，獲得了一個較為穩(wěn)定的雜交后代，個別性狀仍在改良中［34］。

2008年，湖南農(nóng)業(yè)大學苧麻研究所將具有孤雌生殖和高細度纖維性狀的苧麻后代種子搭載“神舟七號”太空飛船送入太空誘變，隨后對誘變材料農(nóng)藝性狀及纖維細度、纖維產(chǎn)量等進行了評估，結果顯示供試的12份材料纖維細度高于對照“湘苧三號”，但纖維產(chǎn)量卻有所降低。其中，品系XR02綜合品質最好，纖維產(chǎn)量可達3 915 kg/hm2，纖維細度達2 679 m/g;品系XR12纖維細度最高，達到2 720 m/g，這些材料可作為今后育種材料利用［35］。

我國的航天育種仍處在探索階段，在苧麻育種上應用目前尚未取得成功，還沒有選育出優(yōu)良的新品種，需要我們苧麻育種研究工作者投入更大的努力。

7 小結與展望

目前苧麻產(chǎn)業(yè)整體低迷，苧麻育種工作也因此缺乏研究動力，同時基層研究經(jīng)費少，研究工作重心從苧麻育種逐漸轉移到苧麻細胞、分子水平上的基礎研究以及利用生物技術開發(fā)苧麻新用途，諸如將超量表達金屬硫蛋白或植物絡合素基因轉化到苧麻中，提高苧麻吸收重金屬鎘的能力，將苧麻培育成治理重金屬污染的目標植物，同時也能收獲苧麻纖維獲得一定的經(jīng)濟效益。

生物技術的應用，為苧麻研究帶來了新的方法和方向，同時也帶來了新的機遇和挑戰(zhàn)。生物技術在苧麻研究中應用很多，帶來的直接經(jīng)濟效益卻不理想，因此培育出更多好品種，同時不斷大力提高苧麻制造工藝水平，解決苧麻脫膠污染問題，加緊開發(fā)苧麻多用途利用等是目前面臨的緊迫問題。

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