谷胱甘肽S?轉(zhuǎn)移酶M1、T1基因多態(tài)性及氧化應激與非小細胞肺癌易感性

張紅艷，吳緒偉，肖誼，陳梅，李志東，李艷麗，唐開發(fā)

（1.昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院呼吸一科，昆明650051；2.貴陽醫(yī)學院醫(yī)學科學研究所，貴陽550004）

谷胱甘肽S?轉(zhuǎn)移酶M1、T1基因多態(tài)性及氧化應激與非小細胞肺癌易感性

張紅艷1，吳緒偉1，肖誼1，陳梅1，李志東1，李艷麗1，唐開發(fā)2

（1.昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院呼吸一科，昆明650051；2.貴陽醫(yī)學院醫(yī)學科學研究所，貴陽550004）

目的探討谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M1、T1（GSTM1、T1）基因多態(tài)性及氧化應激損傷對非小細胞肺癌易感性。方法本病例對照研究包括110名非小細胞肺癌患者（病例組）和100名正常健康對照者（對照組）。所有研究對象外周血基因組DNAGSTM1、T1基因型采用聚合酶鏈反應（PCR）技術(shù)進行檢測；外周血清丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）濃度及總抗氧化能力（TAOC）采用分光光度計檢測方法測定。結(jié)果GSTM1、T1基因缺失型及GSTM1/T1缺失型在病例組明顯高于對照組（OR1= 2.071，P1=0.009；OR2=1.900，P2=0.024；OR3=3.258，P3=0.003）。MDA及NO水平在病例組顯著高于對照組（P＜0.001），而TAOC水平則在病例組明顯低于對照組（P＜0.001）。同時，病例組中GSTM1、T1基因缺失型及GSTM1/T1缺失型亞組MDA及NO濃度水平明顯高于野生型亞組，而T-AOC水平明顯低于野生型亞組（P均＜0.001）。結(jié)論氧化損傷在非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能扮演著重要角色，而GSTM1、T1基因缺失型非小細胞肺癌患者更易受到氧化應激損傷。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶；多態(tài)性；氧化應激；非小細胞肺癌

肺癌已成為美國、歐洲以及亞洲各國的癌癥患者死亡的最主要原因之一，是對人群健康和生命威脅較大的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率有逐年增加的趨勢［1］。肺癌病理類型中非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，N-SCLC）約占80%。然而，由于早期診斷困難，不能及時治療從而導致N-SCLC患者的預后較差［2］。由于肺表面積直接與空氣接觸，加上高氧張力，從而導致大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生［3］。自由基產(chǎn)生主要包括外源性［如環(huán)境中的刺激物和污染物（香煙煙霧、臭氧等）］及內(nèi)源性因素（如炎性細胞的激活），既往研究認為氧化應激及自由基可能對多種癌癥的易感性增加［4］。另外的研究結(jié)果表明，暴露于氧化應激可導致單一或聚集的細胞DNA損傷，從而致基因突變和基因重組，最終導致惡變［4，5］。Ito等［6］研究發(fā)現(xiàn)在從不吸煙者N-SCLC患者總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）明顯降低，可能增加肺組織DNA對氧化應激的損傷。Peddireddy等［7］研究認為在N-SCLC發(fā)生發(fā)展中增加氧化應激導致氧化—抗氧化能力平衡失調(diào)，從而增加脂質(zhì)過氧化對DNA的損傷。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferases，GST）是一個Ⅱ相代謝酶家族，其通過還原型谷胱甘肽共軛還原反應消除氧化應激產(chǎn)生的有毒的親電子和產(chǎn)物［8］。GSTM1能解毒苯并芘二醇環(huán)氧化物，而GSTT1能清除共軛的氧化脂質(zhì)和鹵代化合物，既往有研究認為GSTM1及GSTT1基因缺失型可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展存在易感性，然而也有研究表明兩者之間無明顯的相關(guān)性［9，10］。

然而，到目前未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于GST基因多態(tài)性及氧化應激水平對N-SCLC患者易感性研究。本研究我們主要對云南地區(qū)的N-SCLC患者的GSTM1、T1基因多態(tài)性及氧化應激水平（MDA、NO及T-AOC）進行研究，以探討兩者之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

該研究包括110例N-SCLC患者及100例匹配的正常健康對照。其性別、年齡、吸煙史及臨床特征需詳細記錄。所有N-SCLC患者均為首次到醫(yī)院就診通過臨床特征、體格檢查、血清生化檢查、X線、CT及經(jīng)皮穿刺活檢或手術(shù)標本病理證實為NSCLC，其中鱗癌62例，腺癌48例。臨床根據(jù)TNM分期，Ⅰ期19例，Ⅱ期26例，Ⅲ期31例，Ⅳ期34例。所有患者之前未進行過任何治療。對照組選自同時期、同地區(qū)的正常健康志愿者。對所有患者及對照者一般情況及既往史等均進行詳細問卷調(diào)查。該研究得到昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準。

1.2 引物設(shè)計和合成

根據(jù)基因序列，采用prime5軟件設(shè)計PCR擴增引物GSTM1：Forward 5′-GAACTCCCTGAAAAGCTA AAGC-3′，Reverse 5′-GTTGGGCTCAAATATACGGT GG-3′；GSTT1：Forward 5′-TTCCTTACTGGTCCT CA CATCTC-3′，Reverse 5′-TCACCGGATCATGGC CAGCA-3′；并β-actin為內(nèi)參照，引物序列為：Forward 5′-ACTCCCCATCCCAAGACC-3′，Reverse 5′-CCTTAATGTCACGCACGA T-3′。

1.3 外周血標本采集和基因組DNA提取

采取所有研究對象外周靜脈血6 mL，其中3 mL以乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）作為抗凝劑混勻為抗凝血液，放置于-80℃低溫冰箱備用。基因組DNA提取按照外周血微量基因組DNA提取試劑盒說明書操作；另外3 mL經(jīng)1 000 r/min離心后對血清進行分離備用。

1.4GSTM1基因型PCR擴增

采用Biomltra梯度PCR儀對所有DNA標本進行GSTM1、T1基因型檢測。反應體系為25 μL，反應條件為95℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃（63℃）退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72℃延伸7 min［11］。

1.5 電泳檢測

PCR擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)進行檢測。GSTM1基因擴增產(chǎn)物為219 bp，GSTM1基因擴展產(chǎn)物為480 bp，β-actin擴增產(chǎn)物為400 bp，所有樣本均重復3次PCR擴增及電泳檢測。

1.6 氧化應激水平檢測

主要檢測血清中MDA、NO及T-AOC。檢測方法按照試劑盒說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

我們發(fā)現(xiàn)病例組和對照組在性別、年齡及吸煙史方面無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表1。

病例組GSTM1（-）比例顯著高于對照組（OR= 2.071；95%CI 1.194～3.593；P=0.009）；病例組GSTT1（-）比例顯著高于對照組（P=0.024）；病例組GSTM1/T1（-/-）比例顯著高于對照組（P=0.003），見圖1、表2。

在該研究中，病例組血清中MDA及NO水平顯著高于對照組（P＜0.001），而T-AOC水平顯著低于對照組（P＜0.001）。同時我們發(fā)現(xiàn)在病例組中，MDA和NO水平在GSTM1（-）、GSTT1（-）及GSTM1/ T1（-/-）亞組中分別顯著高于GSTM1（+）、GSTT1（+）及GSTM1/T1（+/+）亞組（P均＜0.001）；而T-AOC水平則是GSTM1（-）、GSTT1（-）及GSTM1/T1（-/-）亞組分別顯著低于GSTM1（+）、GSTT1（+）及GSTM1/T1（+/+）亞組（P均＜0.001）。見表3。

表1 所有研究對象人口數(shù)據(jù)及臨床特征Tab.1 Demographic and clinical characteristics data of all subjects

表2 GSTM1、T1基因在病例組及對照各組頻率分布Tab.2 The distribution of glutathione S?transferase M1and T1genotypes in study groups

表3 GSTM1、T1基因多態(tài)性與血清MDA、NO及T?AOC相關(guān)性Tab.3 Genetic polymorphisms of glutathione S?transferase M1and T1in relation to plasma MDA，NO and T?AOC

3 討論

氧化應激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，導致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，其產(chǎn)生的物質(zhì)叫活性氧（reactive oxygen species，ROS）。同時，機體也存在著消除氧化應激的保護物質(zhì)被稱為抗氧化劑，兩者之間的不平衡導致重要的分子和細胞損傷，從而對整個機體造成影響［12］。此外，腫瘤的發(fā)生和進展過程中也伴隨著氧化應激導致增加DNA突變，誘導DNA損傷，相關(guān)基因組重組以及細胞增殖［13］。既往研究認為機體氧化應激水平增加在N-SCLC發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色［6，7］。在該研究中，我們發(fā)現(xiàn)病例組血清中MDA及NO水平顯著高于對照組，同時在病例組中，MDA及NO在GSTM1及T1基因缺失型組顯著高于野生型組，T-AOC則低于野生型組。因此，我們認為血清中高水平的MDA及NO，低水平T-AOC是N-SCLC的危險因素。

作為機體抗氧化最重要的成員之一，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶屬機體Ⅱ相代謝酶家族，包含α（A），μ（M），π（P），σ（σ），ζ（ζ），ω（ω）和θ（T）。其通過共軛反應催化多種內(nèi)源和外源性化合物包括ROS、致癌物質(zhì)以及其代謝產(chǎn)物。人胞漿GST基因具有遺傳多態(tài)性，從而導致GST活性改變，這增加了機體對氧化損傷的易感性。既往研究表明，GSTM1和GSTT1基因缺失型可增加肺癌易感性［9，14］。但也有研究認為GSTM1和GSTT1基因缺失型與肺癌發(fā)生發(fā)展沒有相關(guān)性［10］。本研究我們發(fā)現(xiàn)病例組GSTM1（-）、GSTT1（-）及GSTM1/T1（-/-）比例顯著高于對照組。因此，GSTM1、GSTT1及GSTM1/T1缺失型可能為N-SCLC的危險因素。

同時，我們對N-SCLC患者GSTM1、T1基因多態(tài)性及血清氧化應激水平進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)GSTM1、GSTT1及GSTM1/T1基因缺失型患者血清中MDA及NO水平高于野生型組，而T-AOC水平則低于野生型組。因此，GSTM1及T1基因缺失型可能增加氧化應激對機體的易感性，增加N-SCLC的風險。

綜上所述，氧化應激在N-SCLC發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色，而GSTM1、GSTT1基因缺失型增加了機體對氧化應激的損傷。然而，本研究單中心及樣本量較小，具有一定的局限性，需大樣本及多中心研究進一步證實。

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（編輯 武玉欣）

Genetic Polymorphisms of Glutathione S-transferase M1and T1and Evaluation of Oxidative Stress in Patientswith Non-smallCellLung Cancer

ZHANGHong-yan1，WUXu-wei1，XIAOYi1，CHENMei1，LIZhi-dong1，LIYan-li1，TANGKai-fa2
（1.The First Department of Respiration，The Affiliated Yan’an Hospital，Kunming Medical University，Kunming 650051，China，2.Institute of Medical Science of Guiyang MedicalCollege，Guiyang 550004，China）

ObjectiveTo investigate the genetic polymorphisms ofthe glutathione S-transferase M1 and T1 genes（GSTM1andGSTT1），and evaluate the oxidative damage in patients with non-smalllung cancer（N-SCLC）.MethodsA totalof110 patients with N-SCLC and 100 healthy individuals were recruited in this case-control study.Multiplex polymerase chain reaction（PCR）analysis was used to identify the genotypes.The activity of malondialdehyde（MDA），nitric oxide（NO），and the total antioxidant capacity（T-AOC）were detected by spectroscopic analysis using assay kits.ResultsThe frequencies of theGSTM1，T1，and GSTM1/T1 null genotypes in the patient group were significantly higher than those in control group（OR1=2.071，P1=0.009；OR2=1.900，P2=0.024；OR3=3.258，P3=0.003）.The activity of MDA and NO were obviously higher in the patient group compared with the control group（P＜0.001），and T-AOC was obviously lower in patient group than those in control group（P＜0.001）. The activity of MDA，and NO were higher but the T-AOC were lower in patients withGSTM1，T1andGSTM1/T1null genotypes than those in patients withGSTM1，T1andGSTM1/T1present genotypes（P＜0.001）.ConclusionOur results suggest that oxidative damage may play a importantrole in patients with N-SCLC，and the N-SCLC patientswithGSTM1andGSTT1deletion genotypesare more susceptible to oxidative damage.

glutathione S-transferases；polymorphism；oxidative stress；non-small lung cancer

R563

A

0258-4646（2014）05-0432-05

云南省應用基礎(chǔ)研究基金（2010ZC198）

張紅艷（1982-），女，主治醫(yī)師，碩士.

唐開發(fā)，E-mail：doc.tangkf@hotmail.com

2013-12-15

網(wǎng)絡(luò)出版時間：