兩種植物水浸提液對(duì)水華微囊藻的化感作用

王 捷，王志強(qiáng)，馮 佳，謝樹蓮

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 030006)

近年來(lái)一些池塘、湖泊及海洋富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，進(jìn)而引起浮游藻類過(guò)量繁殖形成水華，其中以藍(lán)藻水華尤為常見［1-4］。因此，有效控制浮游藻類大量繁殖，防止水華發(fā)生極為重要。有學(xué)者報(bào)道水生植物可作為凈化污染水體，吸附重金屬和防治富營(yíng)養(yǎng)化的有效手段［5-7］。水生植物分泌的化感物質(zhì)抑藻由于具有高效、快速、生態(tài)安全性好等特點(diǎn)，也被認(rèn)為是一種頗有前景的控藻方式［8，9］。

化感作用指一種植物與其他植物或微生物之間的化學(xué)相互作用，在自然界中非常普遍。在水生生態(tài)系統(tǒng)中利用植物化感作用控制藻類繁殖的研究也易受到關(guān)注。門玉潔等［10，11］研究了蘆葦(phragmites australis)化感組分對(duì)斜生柵藻(scenedesmus obliquus)、羊角月牙藻(selenastrum capricornutum)和萊茵衣藻(chlamydomonas reinhardtii)生長(zhǎng)特性的影響。還有研究表明蘆葦化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻(microcystis aeruginosa)和蛋白核小球藻chlorella pyrenoidosa)細(xì)胞膜的選擇透性有影響，而對(duì)普通小球藻(C. vulagaris)的細(xì)胞膜選擇透性則沒有顯著影響［12-14］。

水華微囊藻(microcystis flosaquae)是一種常見的水華藻類，適應(yīng)性強(qiáng)、爆發(fā)率高，可產(chǎn)生微囊藻毒素，威脅其他水生生物生態(tài)功能的正常發(fā)揮，甚至影響人類健康［1］。本研究以水華微囊藻為研究對(duì)象，比較了北方地區(qū)兩種常見的水生植物水浸提液對(duì)葉綠素α 和超氧化物歧化酶(SOD)的影響，以期為水華防控研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物水浸提液制備

兩種水生植物——香蒲(typha orientalis)和穗狀狐尾藻(myriophyllum spicatum)，均采自山西太原市。將采集的植物體用自來(lái)水反復(fù)清洗干凈后，再用蒸餾水沖洗;剪碎置于80 ℃烘箱中干燥48 h;粉碎研磨過(guò)200 目篩，得到粉末;向1 L 錐形瓶中加入60 g 粉末和300 mL MA 培養(yǎng)液，置于恒溫(25 ℃)震蕩器中提取48 h;減壓抽濾，經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾除去顆粒性雜質(zhì)及細(xì)菌以消除其他微生物的影響，所得濾液即為植物水浸提液。

1.1.2 水華微囊藻及培養(yǎng)

水華微囊藻分離自江蘇無(wú)錫太湖，在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接至MA 培養(yǎng)液中，于人工氣候箱(SPX-250BG，上海博訊)中培養(yǎng)1 周，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為(25 ± 0. 5)℃、光暗比為12 h∶12 h、光照度為3 000 lx，靜置培養(yǎng)，每天定時(shí)搖動(dòng)2 次。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 化感作用試驗(yàn)

向250 mL 錐形瓶中加入150 mL MA 培養(yǎng)液，高壓蒸汽滅菌后，在無(wú)菌條件下分別接入10 mL 生長(zhǎng)狀況一致的水華微囊藻;培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(15 ～20 d)后分別加入0、5、10、20、30 和40 mL 植物水浸提液;依次加入滅菌MA 營(yíng)養(yǎng)液，使培養(yǎng)液總體積為200 mL。植物水浸提液試驗(yàn)組濃度梯度為0(對(duì)照組)、5、10、20、30 和40 g/L，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)。人工氣候箱培養(yǎng)溫度為(25 ±0.5)℃、光強(qiáng)3 000 lx、光暗比為12 h∶12 h，靜置培養(yǎng)，每天定時(shí)搖動(dòng)2 次，并隨機(jī)調(diào)換三角瓶位置，隔24 h 取樣進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定［15］。

1.2.2 葉綠素α 含量測(cè)定

取一定量的藻液用真空泵(SHB-Ⅲ，鄭州長(zhǎng)城)抽濾，抽干后將藻及濾膜一起放入具塞離心管中;加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液至10 mL，振蕩提取葉綠素，放置于暗處過(guò)夜;在4 500 r/min 轉(zhuǎn)速下離心15 min，取上清液，用紫外分光光度計(jì)(SP-752，上海光譜)測(cè)定葉綠素α 吸光值。

1.2.3 SOD 活力測(cè)定

取一定量藻液于4 500 r/min 下離心15 min;棄上清液，加入1 mL pH 為7.2 的0.05 mmol/L 磷酸緩沖液;用吸管轉(zhuǎn)移至離心管中進(jìn)行破碎，條件為工作1 s、間隙2 s，功率400 W，破碎30 次;破碎(Scientz-ⅡD，寧波新芝)后用冷凍離心機(jī)(HC-2518R，安徽中科中佳)在1 200 r/min 下離心15 min;于4 ℃下保存上清液，次日測(cè)其SOD 活力。SOD 活力的測(cè)定按照南京建成生物工程公司試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，單位為U/mgprot，所用儀器為紫外分光光度計(jì)(SP-752，上海光譜)。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)水華微囊藻葉綠素α 含量的影響

經(jīng)測(cè)定和計(jì)算可得，對(duì)照組和香蒲各處理組的葉綠素α 的初始值為(0. 685 ±0. 132)mg/L。由圖1a 可知對(duì)照組和不同濃度香蒲處理組的葉綠素α 含量總體呈上升趨勢(shì)，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組葉綠素α 含量的增長(zhǎng)率有所下降，高濃度處理組(40 g/L)下降也不明顯，說(shuō)明香蒲水浸提液對(duì)水華微囊藻的葉綠素α 雖有一定的破壞但作用不強(qiáng)。

經(jīng)測(cè)定和計(jì)算可得，對(duì)照組和穗狀狐尾藻各處理組的葉綠素α 的初始值為(1. 328 ±0.015)mg/L。由圖1b 可知與對(duì)照組相比，穗狀狐尾藻較低濃度處理組(5、10 和20 g/L)葉綠素α含量沒有太大變化，而較高濃度處理組(30 和40 g/L)葉綠素α 含量則明顯下降，說(shuō)明較高濃度的穗狀狐尾藻水浸提液對(duì)水華微囊藻的葉綠素α 產(chǎn)生了破壞作用。

葉綠素α 在光合作用中承擔(dān)著吸收和轉(zhuǎn)化光能的作用，其含量常與藻細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和光合作用密切相關(guān)［16-18］。當(dāng)藻體受到環(huán)境脅迫時(shí)，反映其生長(zhǎng)狀態(tài)和光合作用的葉綠素α 含量就會(huì)發(fā)生變化。由試驗(yàn)結(jié)果可知，在一定程度上兩種植物水浸提液對(duì)水華微囊藻葉綠素α 含量存在著低濃度促進(jìn)和高濃度抑制的作用。研究表明大多數(shù)植物化感物質(zhì)會(huì)對(duì)光系統(tǒng)Ⅱ產(chǎn)生影響，低濃度的化感物質(zhì)可能有利于藻類葉綠素生化合成進(jìn)而促進(jìn)光合作用和藻類生長(zhǎng)，而高濃度化感物質(zhì)通過(guò)破壞藻類的葉綠素，減少其同化產(chǎn)物從而抑制藻類生長(zhǎng)［19，20］。有報(bào)道鳳眼蓮(eichhornia crassipes)根系附著的藻細(xì)胞中葉綠素α 的含量明顯下降，而其降解產(chǎn)物脫鎂葉綠素α 酸酯的含量升高［21］，這表明化感物質(zhì)可能促進(jìn)了葉綠素α 的降解。從試驗(yàn)結(jié)果看，兩種植物水浸提液對(duì)水華微囊藻葉綠素α 的破壞程度有差異，香蒲的作用不及穗狀狐尾藻，這也提示我們?cè)趯?shí)際應(yīng)用中可有所選擇。

2.2 對(duì)水華微囊藻SOD 活性的影響

經(jīng)測(cè)定和計(jì)算可得，對(duì)照組和香蒲各處理組的初始SOD 為(18.183 ±0.122)U/mgprot。由圖2a可知與對(duì)照組相比，香蒲各濃度處理組SOD 活性都有升高的趨勢(shì)，到第4 d 時(shí)，SOD 活性又回落。說(shuō)明香蒲水浸提液對(duì)水華微囊藻起到了一定的脅迫作用，使其產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，SOD 活性隨之升高，以保護(hù)藻細(xì)胞。

圖1 不同濃度香蒲和穗狀狐尾藻水浸提液對(duì)水華微囊藻葉綠素α 含量的影響Fig.1 Effects of Different Concentrations of Typha Orientalis and Myriophyllum Spicatum Extracts on Chlorophyll α Content of Microcystis Flosaquae

經(jīng)測(cè)定和計(jì)算可得，對(duì)照組和穗狀狐尾藻各處理組的SOD 初始值為(0. 331 ±0. 020)U/mgprot。由圖2b 可知與對(duì)照組相比，穗狀狐尾藻各濃度處理組SOD 活性也都出現(xiàn)升高的趨勢(shì)，不同濃度處理組SOD 活性都有上升趨勢(shì)，且具有劑量效應(yīng)，濃度越高SOD 活性升高的趨勢(shì)越大，至第8 d 時(shí)，SOD 活性才開始下降，但均低于對(duì)照水平。說(shuō)明穗狀狐尾藻水浸提液對(duì)水華微囊藻起到了脅迫作用，而且其作用強(qiáng)于香蒲水浸提液。

SOD 能及時(shí)清除細(xì)胞在受脅迫過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)量超氧陰離子(O2-)，抑制膜脂的過(guò)氧化反應(yīng)，使機(jī)體免受活性氧的損害，是機(jī)體內(nèi)重要的保護(hù)酶。藻細(xì)胞在受到環(huán)境脅迫時(shí)，其細(xì)胞活性氧的產(chǎn)量會(huì)增加，抗氧化體系不及時(shí)清除這些活性氧，就會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，尤其是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本試驗(yàn)結(jié)果表明將植物水浸提液加入藻液時(shí)，處理組SOD 活性上升，表明細(xì)胞內(nèi)氧自由基濃度上升，為了清除這些過(guò)量的氧自由基，SOD 活性也隨之上升，當(dāng)清除完過(guò)多的超氧陰離子后，其活性也隨之下降。然而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧自由基濃度超過(guò)一定范圍后，機(jī)體自身的抗氧化體系不能完成清除，則機(jī)體功能不能恢復(fù)，從而抑制了藻細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖［22］。

圖2 不同濃度香蒲和穗狀狐尾藻水浸提液對(duì)水華微囊藻SOD 活性的影響Fig.2 Effects of Different Concentrations of Typha Orientalis and Myriophyllum Spicatum Extracts on SOD Activity of Microcystis Flosaquae

3 結(jié)論

(1)香蒲和穗狀狐尾藻水浸提液低濃度處理(5、10 和20 g/L)對(duì)水華微囊藻的葉綠素α 影響不明顯或略有促進(jìn)作用，高濃度處理(30 和40 g/L)則有明顯的抑制作用。

(2)香蒲和穗狀狐尾藻水浸提液處理對(duì)水華微囊藻的SOD 活性有明顯影響，且存在劑量效應(yīng)，濃度越高影響越大。

(3)從本試驗(yàn)對(duì)葉綠素α 和SOD 活性的研究結(jié)果可知穗狀狐尾藻水浸提液對(duì)水華微囊藻的化感抑制作用要強(qiáng)于香蒲。

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