玻璃酸鈉對(duì)骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)液中miR-140表達(dá)的影響

張明，王鐵軍，劉書(shū)茂，黃東明，李輝，高飛，李悅，杜堯

(1.北京市大興區(qū)人民醫(yī)院骨科，北京 102600；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院創(chuàng)傷骨科研究室，湖南 長(zhǎng)沙 410011)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種常見(jiàn)的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病。其主要病變特征是細(xì)胞外基質(zhì)合成不足導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨退變、繼發(fā)的骨贅形成和累及滑膜。女性的發(fā)病率高于男性。其發(fā)生率隨年齡的增長(zhǎng)而升高，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)50 歲以上人口發(fā)病率為5%，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率為9.56%；60 歲以上人口發(fā)病率為20%，其中膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率占49%[1]。其發(fā)病機(jī)制與多種因素相關(guān)，但尚無(wú)確切的機(jī)制。我們前期的研究結(jié)果表明骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)液中微小RNA-140(micro RNA-140，miR-140)的表達(dá)是下調(diào)的，且與骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[2]。本研究旨在檢測(cè)玻璃酸鈉注射液治療骨關(guān)節(jié)炎前后miR-140的表達(dá)、膝關(guān)節(jié)HSS評(píng)分變化，探討miR-140在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 患者 按照美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(American rheumatism association，ARA)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，選取不同Kellgren-Lawrence分級(jí)骨關(guān)節(jié)炎患者，Ⅰ級(jí)組治療前后各10 例、Ⅱ級(jí)組治療前后各10 例、Ⅲ級(jí)組治療前后各10 例、Ⅳ級(jí)組治療前后各10 例，最小年齡38 歲，最大年齡90 歲，平均年齡62.1 歲，男性15 例，女性25 例。所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象均來(lái)自于中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院創(chuàng)傷骨科研究室，行玻璃酸鈉膝關(guān)節(jié)腔注射治療，治療前抽取關(guān)節(jié)液，一次2 mL，1周1次，5周一療程，治療后1周抽取關(guān)節(jié)液，置于15 mL無(wú)菌、無(wú)酶的離心管中備用。同時(shí)對(duì)每個(gè)患者治療前后行HSS評(píng)分。本研究方案得到了中南大學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)認(rèn)可，全部標(biāo)本收集于2010年6月至2010年12月。

1.2 材料 玻璃酸鈉注射液(施沛特)為山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司提供。PCR熱循環(huán)儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司(型號(hào)：2700)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司(型號(hào)：StepOneTM)。TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。TaqMan MicroRNA Assays試劑盒購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。TaqMan 2×Universal PCR Master Mix Ⅱ(no UNG)購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.3 方法 采用HSS膝關(guān)節(jié)功能評(píng)分表對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行評(píng)分。采用Trizol一步法提取Total-RNA(裂解、分層、RNA沉淀、RNA洗滌和RNA溶解)。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系見(jiàn)表1，反應(yīng)條件(16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min)，選擇OD260/280值在1.6～2.1之間的Total-RNA標(biāo)本，每次反應(yīng)Total-RNA量為100 ng。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-140和U6snRNA，反應(yīng)體系見(jiàn)表2，反應(yīng)條件(95℃ 10 min，95℃ 15 s及60℃ 1 min)，后2步共50個(gè)循環(huán)。在相對(duì)定量分析中，熒光定量PCR的結(jié)果以Ct值顯示。用2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。治療前后的樣本PCR檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用獨(dú)立樣本配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，組間比較采用ANOVA方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。OA嚴(yán)重程度與治療前后miR-140表達(dá)水平變化之間的關(guān)系采用Spearman等級(jí)相關(guān)秩檢驗(yàn)。

表1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系成分及體積

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系的成分及體積

2 結(jié) 果

2.1 治療前后HSS評(píng)分、miR-140表達(dá)水平結(jié)果 與治療前相比，HSS評(píng)分升高，miR-140在骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)液中的表達(dá)水平上調(diào)。Ⅰ級(jí)組、Ⅱ級(jí)組、Ⅲ級(jí)組治療前后HSS評(píng)分、miR-140表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Ⅳ級(jí)組治療前后HSS評(píng)分、miR-140表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖1～2)。

圖1 治療前后HSS評(píng)分比較

2.2 組間比較及相關(guān)性分析 Ⅳ級(jí)組HSS評(píng)分、miR-140的表達(dá)改變與Ⅰ級(jí)組、Ⅱ級(jí)組、Ⅲ級(jí)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；骨關(guān)節(jié)炎的不同分級(jí)與miR-140的表達(dá)改變呈負(fù)相關(guān)(r=-0.825，P<0.05)。

3 討 論

骨關(guān)節(jié)炎又稱退行性關(guān)節(jié)炎，可分為原發(fā)性和繼發(fā)性。原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能與高齡、女性、肥胖、職業(yè)性過(guò)度使用等因素有關(guān)；繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎與代謝異常、機(jī)械性或解剖學(xué)異常、內(nèi)分泌異常、炎癥性關(guān)節(jié)疾患、神經(jīng)性缺陷等因素有關(guān)。OA的主要臨床特點(diǎn)是：關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形、功能受限，好發(fā)于膝關(guān)節(jié)，很難逆轉(zhuǎn)，治療困難。病理特征：a)關(guān)節(jié)軟骨軟化，彈性降低，纖維變性，可有碎裂、剝脫、軟骨下骨質(zhì)外露；b)滑膜大量增殖、水腫；c)軟骨下骨增生，骨小梁增粗；d)關(guān)節(jié)囊可發(fā)生纖維變性和增厚，限制關(guān)節(jié)活動(dòng)，周圍肌肉發(fā)生保護(hù)性痙攣，出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形。其發(fā)病機(jī)制迄今為止尚不完全清楚，可能是多種因素共同作用的結(jié)果。OA嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，給社會(huì)及家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)，所以研究其發(fā)病機(jī)制及有效的治療方法具有十分重要的價(jià)值。

圖2 治療前后miR-140相對(duì)表達(dá)量的比較

玻璃酸是一種線形酸性粘多糖，由N-乙酰葡糖胺和葡糖醛酸二糖單位反復(fù)聯(lián)接組成，在關(guān)節(jié)內(nèi)由滑膜B細(xì)胞分泌，是關(guān)節(jié)滑液和軟骨基質(zhì)內(nèi)的重要成分[5]。玻璃酸鈉的主要生理功能有：a)參與細(xì)胞外液中電解質(zhì)和水分的調(diào)節(jié)；b)關(guān)節(jié)和細(xì)胞間潤(rùn)滑作用；c)與蛋白糖亞單位結(jié)合構(gòu)成蛋白多糖聚合物，組成軟骨基質(zhì)；d)透明質(zhì)酸鈉還可通過(guò)修復(fù)生理屏障、分子篩作用、促進(jìn)自身玻璃酸鈉合成、穩(wěn)定痛覺(jué)感受等作用治療OA。玻璃酸鈉能增強(qiáng)關(guān)節(jié)液粘稠性和潤(rùn)滑功能，進(jìn)入軟骨基質(zhì)與糖蛋白結(jié)合，促進(jìn)軟骨愈合和再生；改善滑液組織的炎癥反應(yīng)，降低血清與滑膜液中IL-1、IL-6水平，抑制免疫損害進(jìn)程并緩解疼痛[6]。1974年，Peyron和Balazs首次用玻璃酸鈉治療26 例OA患者，取得了良好的效果[7]。進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，國(guó)內(nèi)、外大量研究證實(shí)玻璃酸鈉對(duì)膝OA的近期及遠(yuǎn)期療效是肯定的，2000年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)把玻璃酸鈉寫(xiě)入髖、膝OA治療指南[8]。玻璃酸鈉治療OA，能夠向患者補(bǔ)充外源性的玻璃酸鈉，提高關(guān)節(jié)液內(nèi)玻璃酸鈉的含量，使軟骨表面形成自然屏障，減輕或消除了關(guān)節(jié)的摩擦，改善了滑膜的生物學(xué)功能，恢復(fù)和穩(wěn)定關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境，重建膝OA關(guān)節(jié)內(nèi)已被打亂的平衡系統(tǒng)[9]。本研究表明玻璃酸鈉治療輕、中度膝OA療效明顯，而對(duì)重度膝OA療效不明顯。

miRNA是一類內(nèi)生的小RNA，長(zhǎng)度約19～25個(gè)核苷酸組成，是發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA，大約有70～90個(gè)堿基對(duì)，由前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成。它們不參與蛋白質(zhì)的編碼，但是可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，幾個(gè)miRNAs也可以共同精細(xì)調(diào)控一個(gè)基因的表達(dá)。MiR-140是micRNAs家族中的成員之一。2006年Tuddenham等[10]通過(guò)小鼠胚胎研究miRNA-140在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中的作用，實(shí)驗(yàn)方法包括DNA的構(gòu)建、原位雜交、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、熒光素酶分析，結(jié)果顯示小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中miR-140在很多軟骨組織(如顱骨、四肢骨、肋骨、胸骨的軟骨部分)當(dāng)中特異性表達(dá)，并且證明miR-140潛在的靶基因是組蛋白去乙?；?4。2007年Johann等[11]研究發(fā)現(xiàn)在斑馬魚(yú)腭的發(fā)育過(guò)程中，miR-140基因可以負(fù)性調(diào)節(jié)血小板衍生生長(zhǎng)因子(Platelet Derived Growth Factor，簡(jiǎn)稱Pdgf)信號(hào)途徑，在Pdgf受體蛋白水平，Pdgf受體當(dāng)中包含負(fù)性調(diào)節(jié)作用的miR-140結(jié)合位點(diǎn)，表明miR-140與軟骨的發(fā)育有關(guān)。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-140具有軟骨細(xì)胞分化相關(guān)的表達(dá)模型，miR-140在軟骨發(fā)育和體內(nèi)平衡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。2010年Miyaki等[12]通過(guò)敲除miR-140目標(biāo)基因，建立老鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停芯拷Y(jié)果顯示miR-140可以調(diào)節(jié)軟骨的發(fā)育，miR-140缺失導(dǎo)致了蛋白多糖的丟失和關(guān)節(jié)軟骨的纖維化，符合年齡相關(guān)的OA樣改變。我們研究小組在2011年采用實(shí)時(shí)熒光定量的PCR檢測(cè)miR-140，研究表明人膝關(guān)節(jié)液中有miR-140表達(dá)，在OA患者表達(dá)是下調(diào)的，且與OA嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[2]。

本研究證實(shí)玻璃酸鈉治療OA是有效的，同時(shí)miR-140表達(dá)與治療前相比是上調(diào)的，且與OA嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。說(shuō)明miR-140可能在OA的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。為進(jìn)一步研究miR-140在OA發(fā)病機(jī)制中的作用奠定理論基礎(chǔ)。通過(guò)本研究尚未確定OA與miR-140之間的因果關(guān)系，在我們后續(xù)研究中需要通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、下游靶基因調(diào)控進(jìn)一步證實(shí)。

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