腫瘤過繼性細胞免疫治療增效策略及研究進展

陶累累 黃桂春 陳龍邦

南京大學醫(yī)學院附屬金陵醫(yī)院南京軍區(qū)南京總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，南京 210002

過繼性細胞免疫治療（adoptive cell immunotherapy，ACI）是當前腫瘤免疫治療中最有發(fā)展前景的一種治療手段。該方法首先采集并分離自體或異體淋巴細胞，然后于體外經(jīng)各種細胞因子或腫瘤特異性抗原活化擴增后再回輸至體內(nèi)，起到直接或間接殺傷腫瘤細胞的作用，同時調(diào)動機體的免疫功能以達到消除和控制腫瘤的目的[1]。然而，ACI在臨床實際運用中的療效并不確切，其主要原因為：①免疫細胞的特異性不強；②免疫細胞缺乏活化信號；③免疫效應細胞在腫瘤局部的數(shù)量不足；④腫瘤微環(huán)境抑制了免疫細胞的殺傷效應[2]。探究各種不利因素對ACI的限制并優(yōu)化其增效策略具有重要意義，因此本文對其相關(guān)研究進展進行闡述。

1 基因工程修飾的T T細胞

1.1 抗原特異性T T細胞受體修飾的T T細胞

T細胞受體（T cell receptor，TCR）修飾的T細胞是指通過克隆腫瘤特異性的TCRα鏈和β鏈基因片段，構(gòu)建含TCR的載體（病毒或非病毒）后，

運用不同的基因轉(zhuǎn)導技術(shù)將含基因片段的載體轉(zhuǎn)導至T淋巴細胞中使其表達特異性的TCR，通過改變T細胞內(nèi)源性TCR識別抗原模式來制備特異性識別殺傷靶細胞的細胞毒性T淋巴細胞[3]。在分離TCR后，這種TCR修飾的T細胞通過相關(guān)技術(shù)被整合到基因載體中，進而包裝出相應的載體（如慢病毒感染患者外周血T細胞），然后大量擴增；經(jīng)基因修飾后的T細胞可更好地靶向腫瘤抗原，并分泌相關(guān)細胞因子（如IFN-γ、IL-2、GM-CSF和TNF-α）以增強其抗腫瘤效應[4]。

1.1.1 TCR的臨床應用 Morgan等[5]首次運用Mart-1基因TCR修飾的T細胞進行過繼性免疫治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的患者，2例/15例患者獲得部分緩解。在治療1年后，外周血中仍能檢測出基因修飾的TCR的表達且仍保持其特異性反應。Parkhusrt等[6]利用含識別癌胚抗原（carcinoembryonic antigenca，CEA）的TCR基因轉(zhuǎn)導的T細胞治療3例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，發(fā)現(xiàn)受試者血清CEA水平明顯下降，其中1例患者的病情明顯緩解。但受試者也出現(xiàn)了明顯的脫靶效應（即出現(xiàn)短暫的結(jié)腸炎），或為修飾后的T細胞亦作用于表達CEA的正常腸上皮細胞所致。脫靶效應提示，TCR基因治療的最佳靶抗原應為僅在腫瘤細胞表達的抗原。Robbins等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，NY-ESO-1是基因修飾TCR的T細胞治療的理想靶抗原。研究還發(fā)現(xiàn)，高表達NY-ESO-1抗原的患者接受靶向NY-ESO-1的TCR修飾的T細胞回輸后，5例/11例黑素瘤患者和4例/6例滑膜肉瘤患者的癥狀均得到明顯改善，受試者無明顯的脫靶效應。

1.1.2 TCR改善策略 TCR可以進行以下幾個方面的改善：①TCR基因載體選擇以MPSV和MSCE載體為主的逆轉(zhuǎn)錄病毒。相較于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)導載體，其優(yōu)點是能夠在轉(zhuǎn)導細胞內(nèi)保持修飾基因長期穩(wěn)定的整合[8]。②減少內(nèi)源性和外源性TCR的錯配。IRES和2A多肽基因載體法通過α鏈和β鏈基因的相連使其共表達，從而降低內(nèi)源性和外源性TCR錯配概率，提高TCR在細胞表面的表達水平，且有更好的抗腫瘤效應[9]。另外，利用WT1-siTC或鋅指核酸酶的方法可抑制或沉默內(nèi)源性TCR的表達，也為降低TCR的錯配和提高外源性TCR表達提供了新途徑[10-11]。③提高轉(zhuǎn)導TCR的功能。聯(lián)合轉(zhuǎn)導TCRαβ與CD3ζ鏈可以克服CD3缺失所致的T細胞活化缺陷，從而增強抗原親和力和抗腫瘤活性[12]。Ahmadi等[13]證實，與僅轉(zhuǎn)導TCRαβ鏈的T細胞相比，聯(lián)合轉(zhuǎn)導TCRαβ和CD3基因的T細胞不僅能夠提高轉(zhuǎn)導TCR的表達，還能增強抗原親和力和抗腫瘤活性。優(yōu)化改造TCR密碼子和恒定區(qū)提高其在T細胞表面的表達水平也在不同的研究中得到證實[14-15]。④增強TCR受體對腫瘤抗原的親和力。許多腫瘤相關(guān)抗原與正常細胞表面抗原的差異較小，這是腫瘤細胞避免自身免疫系統(tǒng)攻擊的重要機制，因此，提高TCR與腫瘤表面MHC-抗原復合物的親和力是提高TCR修飾的T細胞療效的有效策略。

1.2 嵌合抗原受體修飾的T T細胞

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）修飾的T細胞（CAR-T）是指，利用基因工程技術(shù)，將識別腫瘤相關(guān)抗原的單鏈抗體（singlechain antibody fragment，scFv）的可變區(qū)片段、共刺激分子（costimulatory molecule，CM）和T細胞活化信號傳導肽（主要是CD3ζ及FcεIRγ）重組成的嵌合性受體經(jīng)載體轉(zhuǎn)導入的T細胞；CAR具備特異性識別并殺傷腫瘤細胞的能力[16]。CAR的主要優(yōu)勢是既具有抗體結(jié)構(gòu)又保留有T細胞活化信號傳遞系統(tǒng)，使其既能特異性識別腫瘤相關(guān)抗原，又能擺脫TCRαβ鏈抗原識別過程中的MHC限制[17]。

第一代CAR是由胞外抗原識別域與胞膜或胞質(zhì)上的免疫受體氨基酸活化基序（主要是CD3ζ及FcεIRγ相連組成）結(jié)合發(fā)揮作用。盡管在臨床治療中取得一些療效，但免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）發(fā)出的激活信號僅能維持細胞因子較低水平的分泌，T細胞存活時間短，擴增能力有限，從而在一定程度上影響了抗腫瘤效應[18]。第二代CAR在一代基礎(chǔ)上通過優(yōu)化配體結(jié)合部位及增加共刺激分子結(jié)構(gòu)域（如CD28、CD134、CD244、CD137等）的方法提高了T細胞的活性并延長了T細胞存活時間[19-22]。目前，第三代CAR序列性串聯(lián)增加了兩種共刺激分子，其結(jié)構(gòu)與功能的不斷優(yōu)化有望取得更好的細胞活化效應，但其最佳組合方式仍在研究中[23]。

1.2.1 CAR的臨床應用 Porter等[24]構(gòu)建出針對B細胞CD19抗原的特異性CAR，利用CD137作為共刺激信號（scFvCD19-CD137-CD3ζ）修飾 T細胞，通過慢病毒載體將其轉(zhuǎn)導進患者的T細胞后回輸治療慢性淋巴細胞白血病。療效評價結(jié)果顯示，3例患者中，完全緩解（complete response，CR）者2例，疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）者1例。研究人員還發(fā)現(xiàn)，該細胞在體內(nèi)可擴增1000倍以上且能夠維持有效活性長達6個月，甚至部分CART能以記憶細胞的形式存在。Kochenderfer等[25]運用CAR-T治療復發(fā)/難治性B細胞淋巴瘤，第一代CAR（CD19scFv-CD3ζ）修飾的 T 細胞和第二代CAR（CD19scFv-CD28-CD3ζ）修飾的T細胞均顯示出良好的療效。但相較于第一代CAR-T，第二代CAR-T在增殖能力、存活時間及抗腫瘤效應方面更具優(yōu)勢。此外，患者體內(nèi)長達39周的B細胞清除也說明CAR對正常B細胞亦存在影響。

Morgan等[5]發(fā)現(xiàn)，1例結(jié)腸癌患者在經(jīng)第三代CAR（CD28、4-1BB和CD3ζ）修飾的T細胞治療5天后發(fā)生死亡，其主要原因是CAR-T在肺組織浸潤導致肺組織損傷引起急性呼吸衰竭。此外，Kochenderfer等[25]發(fā)現(xiàn)，機體內(nèi)大量炎癥細胞因子（如IFN-γ、TNF-α）的釋放會造成“細胞因子風暴（cytokine storm）”，也會引起多器官功能衰竭（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。再者，回輸CAR-T可能會引起類似于異基因造血干細胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）出現(xiàn)移植物抗宿主病的反應[26]。如何保證發(fā)揮CAR-T的療效、避免其危害是惡性腫瘤臨床治療中目前亟須解決的重要問題。

1.2.2 CAR-T的臨床改善策略 ①效應細胞群的選擇：研究表明，中央型記憶T淋巴細胞（central memory T cell，TCM）在體內(nèi)更具持久性且具有更高的抗腫瘤活性，同時具備建立免疫記憶的潛能。另外有研究發(fā)現(xiàn)，在引入CD62L表面分子后，初始T細胞（naive T cell，TN）表現(xiàn)出更強的體內(nèi)擴增和分化能力，其抗腫瘤效應也更持久[27-28]。②共刺激分子的選擇：Hombach等[29]的研究表明，與CD28和CD3嵌合的第二代CAR-T相比，CD134和CD28、CD3ζ鏈嵌合的第三代CAR-T具有更強、更持久的抗腫瘤作用。此外，CD137也是一個重要的共刺激分子，能提高T細胞存活率和抵抗激活誘導性的細胞凋亡[22]。③降低非人源化抗體的免疫原性：CAR靶向腫瘤抗原與scFv親和力有關(guān)。早期CAR的scFv來自鼠單克隆抗體（mAbs）。在利用鼠源的scFv或mAbs的CAR-T進行臨床試驗中，研究者發(fā)現(xiàn)機體可大量產(chǎn)生人抗鼠抗體（human anti-mouse antibody，HAMA），從而限制研究的順利進行[30]?？贵w工程技術(shù)可以微調(diào)scFv的親和力以增強其與腫瘤的特異性結(jié)合，通過人源化或全人抗體scFv結(jié)合抗原，可降低鼠源scFv的免疫原性[31]。例如，神經(jīng)生長因子（Her-3和Her-4的受體）、白介素13、NKG2D等受體經(jīng)過抗體工程改裝后，已被成功運用于CAR-T治療，并有效避免HAMA的產(chǎn)生[32-34]。

2 調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境改善免疫治療

2.1 T T細胞活化和解除抑制

2.1.1 T細胞程序性死亡受體-1靶向阻斷程序性死亡受體-1（programmed death receptor-1，PD-1）/程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）通路可有效激活T細胞的抗腫瘤免疫能力。Duraiswamy等[35]在卵巢癌動物模型中發(fā)現(xiàn)，阻斷PD-L1能促進腫瘤特異性CD8+T細胞的增殖，增強其殺傷活性，并有效抑制調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）和骨髓來源的抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）的功能；腫瘤局部的Treg和MDSC數(shù)量也明顯下降。在與其他藥物聯(lián)合抗腫瘤方面，PD-1/PD-L1也展示出良好的療效。John等[36]構(gòu)建靶向人表皮因子受體2（Her-2）抗原的 CAR-T，并將其聯(lián)合抗 PD-1抗體，該治療方案能明顯增強CAR-T的抗腫瘤效應，同時腫瘤局部MDSC的數(shù)量也得到明顯下降。該結(jié)果提示，靶向PD-1/PD-L1信號可以解除腫瘤免疫抑制、增強T細胞的活化能力、提高ACI治療療效，為聯(lián)合兩種手段的抗腫瘤治療提供了理論依據(jù)。

2.1.2 細胞毒性相關(guān)的T細胞抗原 細胞毒性相關(guān)的T細胞抗原（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4；又名CD152）是一種白細胞分化抗原，是T細胞上的一種跨膜受體，與CD28共享B7分子配體。CTLA-4可阻斷CD28與B7的信號傳導通路，并抑制T細胞對抗原識別第二信號的產(chǎn)生，導致T細胞的免疫失能，誘導對特異性抗原的免疫耐受，從而發(fā)揮負性調(diào)控作用。Quezada等[37]的研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合CTLA-4抗體和回輸CD4+Trp1+T細胞可明顯抑制黑色素瘤生長，同時促使TNF、IFN-γ表達升高，而腫瘤局部Treg細胞的數(shù)量則明顯下降；研究結(jié)果證實，CTLA-4抗體能明顯提高ACI的抗腫瘤作用，為臨床腫瘤治療提供了可行的聯(lián)合治療策略。

2.2 抗腫瘤血管生成

Shi等[38]通過建立A549肺腺癌、SPC-A1肺腺癌及Lewis肺癌等非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）模型，發(fā)現(xiàn)腫瘤異常微血管和腫瘤乏氧的微環(huán)境是抑制細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine-induced killer，CIK）增殖與活性的重要因素。重組人血管內(nèi)皮抑制素（rh-endostatin）聯(lián)合過繼性CIK細胞免疫治療的結(jié)果顯示，rh-endostatin可以通過降低腫瘤微血管密度、促進腫瘤血管正?；⒏纳颇[瘤的乏氧狀態(tài)、改善腫瘤組織內(nèi)免疫抑制性微環(huán)境和促進CIK細胞在腫瘤組織中的浸潤程度來增強CIK細胞的抗腫瘤作用。

3 聯(lián)合其他治療方案

3.1 預處理化療

化療藥物的免疫調(diào)節(jié)作用可以特異性地清除宿主和腫瘤局部的免疫抑制因素，以增強ACI的療效[39]。Huang等[40]在前期研究中用TP方案（紫杉醇+順鉑）預處理化療小鼠Lewis肺癌的動物模型。結(jié)果顯示，TP預處理化療聯(lián)合過繼性CIK細胞可明顯抑制Lewis肺癌的生長，而單獨過繼性CIK細胞免疫治療或TP化療均不能抑制Lewis腫瘤的生長。TP預處理化療可增加CD3+T淋巴細胞至腫瘤組織的浸潤，下調(diào)腫瘤組織中Treg細胞比例，促進過繼性CIK細胞至腫瘤及脾臟組織的歸巢。而在BALB/c裸鼠CT-26結(jié)腸癌模型中，順鉑預處理化療聯(lián)合過繼性CIK細胞免疫治療、單獨過繼性CIK治療及單獨順鉑化療均不能抑制CT-26結(jié)腸癌的生長[41]。

3.2 放射治療

既往研究認為，放療對機體可產(chǎn)生免疫抑制效應進而影響免疫治療的療效。近來的一些研究卻發(fā)現(xiàn)，放療聯(lián)合細胞免疫治療往往能產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤療效[42]。朱月華等[43]將68例宮頸癌患者隨機分為單純放療組和放療聯(lián)合過繼性CIK組，發(fā)現(xiàn)放療聯(lián)合自身免疫細胞治療宮頸癌能提高患者免疫功能，并延長生存期。另一項對多發(fā)性骨髓瘤的基礎(chǔ)研究也提示，放射治療是有效地增強過繼性CIK細胞療效的手段[44]。然而，目前放療聯(lián)合細胞免疫治療的證據(jù)有限，仍然需要大量的基礎(chǔ)和臨床研究為其成為臨床合理治療的策略提供依據(jù)。

3.3 分子靶向治療

厄洛替尼是目前臨床上針對NSCLC使用較廣泛的分子靶向藥物，是一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）[45]。厄洛替尼聯(lián)合過繼性CIK細胞治療肺腺癌（EGFR基因突變型）具有明顯的協(xié)同治療效應，且不良反應較輕。具體機制可能是，厄洛替尼可通過與肺癌細胞表面的EGFR受體結(jié)合，使肺癌細胞NKG2D配體的表達上調(diào)，從而增強免疫細胞的殺傷活性[46]。因此，EGFR單抗聯(lián)合過繼性CIK細胞治療具有進一步擴大樣本量深入研究的價值，也可能為肺腺癌的臨床靶向治療提供依據(jù)。

4 小結(jié)

大量的研究證據(jù)表明，ACI具有其他治療手段無法替代的優(yōu)勢，是極具前景的惡性腫瘤治療手段。隨著腫瘤分子生物學、腫瘤免疫學、基因工程的深入研究，ACI取得了長足的進步，但如何增強過繼性免疫細胞的靶向性、有效性及持久性，如何發(fā)揮其療效并避免風險均需進一步的研究和解決。

目前，ACI的方案大部分仍處于臨床試驗階段，缺乏大規(guī)模的臨床循證依據(jù)。在臨床運用時，還應根據(jù)患者的具體情況來決定治療手段，同時也應該考慮和其他療法（如化、放療和分子靶向藥物等）相結(jié)合，以增強療效。隨著關(guān)鍵技術(shù)和問題的逐步解決，ACI必將成為腫瘤治療的重要方法。

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