植物組織培養(yǎng)在育種中的應(yīng)用

祝劍峰(湖北生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430200)

植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有培養(yǎng)材料經(jīng)濟(jì)、培養(yǎng)條件可以人工控制、生產(chǎn)周期短和繁殖效率高等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，并對傳統(tǒng)的植物育種方式產(chǎn)生了革新。目前國內(nèi)外已將植物組織培養(yǎng)普遍應(yīng)用于作物育種研究，并在單倍體育種、多倍體育種、遠(yuǎn)緣雜交育種、突變育種、轉(zhuǎn)基因育種以及種質(zhì)資源離體保存等方面取得了較大進(jìn)展。筆者分別從單位體育種、多倍體育種、遠(yuǎn)緣雜交育種、人工種子、篩選突變體、轉(zhuǎn)基因育種和種質(zhì)資源保存等方面對植物組織培養(yǎng)在育種中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

1 單倍體育種

單倍體育種是植物育種手段之一，是常規(guī)純和育種手段的革新。即利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對植物的生殖細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體植株，再通過某種手段使染色體組加倍(常用秋水仙素處理)，從而獲得純和的二倍體植株。常規(guī)的純和育種一般需要經(jīng)過8～10個(gè)世代選育，而通過單倍體育種只需要一個(gè)世代基因即可達(dá)到純和，大大縮短了育種周期［1］。

在自然界單倍體一般是通過孤雌生殖的方式產(chǎn)生，出現(xiàn)的頻率極低，只有十萬分之一，并沒有得到廣泛利用。隨著單倍體在植物遺傳育種領(lǐng)域中的重要性逐漸為人們所認(rèn)知，世界各國紛紛開始了單倍體育種研究。目前，單倍體植株的獲得主要是對花粉或花藥和未受精的子房和胚珠進(jìn)行離體培養(yǎng)。

1.1 花藥和花粉培養(yǎng) 花藥是植物雄性生殖器官，由2種不同倍性的細(xì)胞組成，藥壁和藥隔組織為二倍體細(xì)胞，雄性生殖細(xì)胞(花粉粒)為單倍體細(xì)胞?；ㄋ幒突ǚ叟囵B(yǎng)是改變花粉原來的發(fā)育途徑，誘導(dǎo)花粉分裂增殖，形成愈傷組織，經(jīng)過再分化，發(fā)育成單倍體植株［2］。

自1964年Guha和Maheshwari首次用曼陀羅的花藥進(jìn)行培養(yǎng)獲得單倍體植株以來，世界各國都相繼進(jìn)行了花藥單倍體育種研究。我國的花藥培養(yǎng)育種研究始于1972年，在世界上處于領(lǐng)先地位。1974年，我國利用單倍體培育出世界上第一個(gè)作物新品種——煙草單育1號(hào)［1］。近年來，花藥培養(yǎng)的研究十分活躍，進(jìn)展也很顯著。已培育出煙草、水稻、小麥、玉米和辣椒等20多個(gè)新品種，如煙草“單育1號(hào)”、水稻“單豐1號(hào)”、水稻“中花9號(hào)”和小麥“花培1號(hào)”等［3］。我國科學(xué)家朱至清設(shè)計(jì)的花藥培養(yǎng)基N6和改良N6培養(yǎng)基，在國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用。

花藥與花粉培養(yǎng)已與常規(guī)雜交育種、遠(yuǎn)緣雜交育種、誘變育種以及轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展形成了一套育種技術(shù)體系。由于花藥和花粉培養(yǎng)的方法日趨完善，花藥培養(yǎng)育種已成為生物技術(shù)在農(nóng)作物育種中應(yīng)用最廣泛、最有成效的方法之一，逐漸成為作物改良和新品種培育工作的一個(gè)重要手段。

1.2 子房與胚珠培養(yǎng) 胚珠是種子植物的大孢子囊，是雌配子孕育的場所，直接使用子房或者從胚囊中分離出未受精的胚珠，在人工控制的條件下進(jìn)行離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)大孢子或卵細(xì)胞增殖，形成單倍體植株，與花粉單倍體植株相同，可用于單倍體育種。

雖然花粉(花藥)培養(yǎng)是獲得單倍體植株的主要途徑，并廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)，但對于花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)率過低和雄性不育的植物，要想獲得單倍體植株，子房與胚珠培養(yǎng)是唯一可行的途徑。此外，花粉植株的性狀變異率較胚珠培養(yǎng)獲得的單倍體植株高，在禾本科植物中，花粉植株試管苗玻璃化率較高，而子房和胚珠培養(yǎng)獲得的單倍體植株試管苗玻璃化幾率較低［4］。

2 多倍體培育

多倍體在自然界廣泛存在，較之二倍體植株，普遍具有植株巨型化、抗逆性增強(qiáng)、營養(yǎng)成分含量增加等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于育種研究中。被子植物的胚乳是雙受精的產(chǎn)物，屬于三倍體，通過被子植物的胚乳離體培養(yǎng)可以獲得三倍體植株，三倍體品種具有產(chǎn)量高、觀賞性提升及不結(jié)實(shí)等優(yōu)勢而備受育種工作者的關(guān)注。而將三倍體植株通過染色體加倍，可以獲得六倍體植株，以解決三倍體不結(jié)實(shí)的問題，并用于培育多倍體新品種。常規(guī)的三倍體是采用2n×4n有性雜交獲得，但此方法選育時(shí)間長，雜交難度大，而采用胚乳作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得再生植株，可以有效地解決這一難題。胚乳培養(yǎng)研究始于20世紀(jì)30年代，并首次在蘋果上獲得了三倍體，隨后相繼在馬鈴薯、水稻、小麥、蘋果、棗、柑橘、梨、獼猴桃等植物中獲得胚乳植株。目前已有40余種植物的胚乳培養(yǎng)取得突破，有近20種植物成功獲得了胚乳再生植株［5］。

3 培育遠(yuǎn)緣雜交品種

3.1 試管受精 在遠(yuǎn)緣雜交中，由于親本親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，易發(fā)生生殖隔離的障礙，出現(xiàn)花粉與柱頭不親和，花粉在柱頭上不能萌發(fā)，花粉管生長受抑而不能進(jìn)入胚珠，花粉管在花柱中破裂等現(xiàn)象［6］，使受精過程不能正常進(jìn)行，導(dǎo)致不能形成合子，這些均屬于受精前生殖隔離障礙。對于上述發(fā)生在受精前的生殖隔離障礙，可以采用離體授粉技術(shù)予以克服，即通過離體培養(yǎng)使花粉與柱頭親和，或者使花粉不經(jīng)過柱頭直接與胚珠接觸。離體授粉是將未受精的子房或胚珠進(jìn)行離體培養(yǎng)，然后授以無菌的花粉，使之在試管內(nèi)完成受精的技術(shù)，又稱為離體受精或試管受精。試管受精技術(shù)研究始于20世紀(jì)60年代初，Dulieu等分別在煙草和金魚草、玉米上通過離體柱頭授粉獲得成功;Inomata等進(jìn)行了有性雜交不親和的油菜與甘藍(lán)的離體子房受精研究，成功獲得了種間雜種植株。葉樹茂等在小麥中獲得成功，得到了普通小麥×黑麥草和節(jié)節(jié)小麥×普通小麥的雜種植株。

3.2 胚挽救 在遠(yuǎn)緣雜交中，雖然受精成功并形成了合子，但由于胚乳發(fā)育不正?；蛘唠s種胚和胚乳之間生理上的不協(xié)調(diào)，易導(dǎo)致雜種胚在發(fā)育過程中夭折，這屬于受精后的生殖隔離障礙。通過將遠(yuǎn)緣雜交獲得的雜種幼胚進(jìn)行離體培養(yǎng)，可以克服遠(yuǎn)緣雜交受精后的生殖隔離障礙，成功獲得遠(yuǎn)緣雜種植株，這種應(yīng)用在遠(yuǎn)緣雜交中的幼胚離體培養(yǎng)技術(shù)稱為胚挽救，又稱為胚拯救。將胚挽救與試管受精技術(shù)相結(jié)合，大大提高了遠(yuǎn)緣雜交的成功率。目前，已通過該方法獲得了很多種間、甚至屬間的雜種植株，擴(kuò)大了雜種優(yōu)勢的利用范圍。

3.3 原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交 原生質(zhì)體是指植物細(xì)胞經(jīng)質(zhì)壁分離后，除去細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞組織，與完整的單細(xì)胞相比，除沒有細(xì)胞壁外，其他功能與活細(xì)胞相同，并具有植物細(xì)胞的全能性。1892年Klercker最早利用機(jī)械切割的方法分離得到原生質(zhì)體，1960年英國植物生理學(xué)家Cocking首次利用纖維素酶從番茄根細(xì)胞分離得到原生質(zhì)體［7］。原生質(zhì)體經(jīng)過分離、純化后，進(jìn)行離體培養(yǎng)，可以再生細(xì)胞壁，然后通過愈傷組織或胚狀體途徑，發(fā)育成完整植株。

原生質(zhì)體最大的研究價(jià)值在于這些除去細(xì)胞壁的裸細(xì)胞沒有細(xì)胞壁的束縛，無論親緣關(guān)系如何，都具有彼此融合的能力。采用物理或者化學(xué)的方法誘導(dǎo)，使不同物種之間由體細(xì)胞獲得的原生質(zhì)體發(fā)生融合，經(jīng)組織培養(yǎng)體系再生成完整植株，稱為體細(xì)胞雜交。通過體細(xì)胞雜交，不需要進(jìn)行受精過程即可獲得雜種植株，因此可以有效克服遠(yuǎn)緣雜交的不親和性，培育出更多的新品種和創(chuàng)造新的物種。目前已經(jīng)獲得40余個(gè)種間、屬間和科間的體細(xì)胞雜種植株。

4 體細(xì)胞胚胎發(fā)生與人工種子

體細(xì)胞胚胎發(fā)生是指植物的體細(xì)胞經(jīng)特定條件誘導(dǎo)，未經(jīng)精卵融合，而形成與合子胚類似的結(jié)構(gòu)，并通過與合子胚胎類似的發(fā)育途徑形成植株的過程。這種與合子胚類似的結(jié)構(gòu)稱為體細(xì)胞胚胎或胚狀體。自Reinert和Steward等于1985年從胡蘿卜根培養(yǎng)中獲得體細(xì)胞胚胎起，國內(nèi)外不少學(xué)者開始從事該研究，體細(xì)胞胚胎發(fā)生已經(jīng)被公認(rèn)為是植物界的普遍現(xiàn)象，是離體培養(yǎng)植株再生的一個(gè)基本發(fā)育途徑，并使人工種子的制作成為可能。

人工種子又稱為合成種子或無性種子，是將通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生產(chǎn)生的胚狀體包裹在有養(yǎng)分和具有保護(hù)功能的介質(zhì)中形成類似于植物天然種子的結(jié)構(gòu)，由體細(xì)胞胚、人工胚乳和人工種皮3部分構(gòu)成。人工種子不僅能像天然種子一樣可以播種和發(fā)育成植株，而且還具有許多優(yōu)點(diǎn):①不受季節(jié)和環(huán)境的影響，繁殖快，有利于工廠化生產(chǎn);②在制作人工種子時(shí)加入生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗生素等可以人為地賦予種子各種優(yōu)良品質(zhì);③人工種子在本質(zhì)上屬于無性繁殖，可以固定雜種優(yōu)勢;④人工種子體積小，無內(nèi)源菌，不易霉變，便于保存與運(yùn)輸［2］。

5 篩選突變體

在植物組織培養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)各種變異，其中通過愈傷組織途徑獲得的再生植株出現(xiàn)突變的頻率較不定芽途徑高，細(xì)胞培養(yǎng)獲得的再生植株出現(xiàn)的突變頻率較器官和組織培養(yǎng)的突變頻率高。原因在于愈傷組織和懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，處于旺盛的分裂狀態(tài)，加之缺乏有組織的結(jié)構(gòu)，易受培養(yǎng)條件和誘變因素的影響而產(chǎn)生變異。從中可以篩選出對人類有用的突變體，從而育成新品種。對于誘發(fā)突變較為困難、突變率較低的一些性狀，在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)期進(jìn)行誘發(fā)和篩選，由于細(xì)胞數(shù)目十分巨大，因此一些突變率極低的性狀也可以從中選擇出來，為進(jìn)一步選育提供了豐富的變異類型。目前，在組織培養(yǎng)過程中已篩選出抗病蟲害、耐鹽、耐旱、高賴氨酸、高蛋白的突變體，有些已應(yīng)用于生產(chǎn)。

6 轉(zhuǎn)基因育種

植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是把從動(dòng)植物或微生物中分離獲得的目的基因片段，通過各種方法整合到植物基因組中，使之穩(wěn)定遺傳，并賦予植物抗病、抗蟲、抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等新的性狀。目前，植物基因轉(zhuǎn)化方法主要是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因槍法［8］，使用的轉(zhuǎn)化受體均為離體培養(yǎng)的植物細(xì)胞，經(jīng)轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞，需要借助植物組織培養(yǎng)試驗(yàn)體系進(jìn)行植株再生。因此，植物組織培養(yǎng)技術(shù)為轉(zhuǎn)基因植物提供了重要的技術(shù)平臺(tái)，建立高效穩(wěn)定的組織培養(yǎng)再生體系是轉(zhuǎn)基因育種的重要前提。研究認(rèn)為用于基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)，應(yīng)具有80%以上的再生頻率［1］。

自1983年獲得第一株轉(zhuǎn)基因植物以來，目前已有100余種植物成功獲得轉(zhuǎn)基因植株。利用植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)創(chuàng)建的很多品種，如玉米、大豆油菜、馬鈴薯等已推廣利用，并產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

7 種質(zhì)資源離體保存

種質(zhì)資源是植物育種的基礎(chǔ)，自然災(zāi)害和人類活動(dòng)造成相當(dāng)數(shù)量的植物物種正逐年消失，搜集和保存種質(zhì)資源已受到世界各國的重視。但常規(guī)的種質(zhì)資源保存方法是采用原生境保存，需要建立植物園或種質(zhì)圃，不僅需要耗費(fèi)大量的人力、物力和土地，且易遭受災(zāi)害和病蟲害的侵襲，造成種質(zhì)資源流失。1975年，Henshaw和Morel首次提出了離體保存的方法［9］。種質(zhì)資源離體保存是將離體培養(yǎng)的小植株、器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體等材料，采用限制、延緩或者停止其生長的方法使之保存，在需要時(shí)可重新恢復(fù)其生長，并再生植株的方法。種質(zhì)資源離體保存有以下優(yōu)點(diǎn):所占空間少，節(jié)省大量的人力和財(cái)力;便于種質(zhì)資源的交流與利用;需要時(shí)，可以用離體培養(yǎng)方法很快大量繁殖;避免自然災(zāi)害引起的種質(zhì)丟失。目前，已有許多種植物在離體條件下，通過抑制生長的方法，使組織培養(yǎng)物能長期保存，并保持其生活力。但種質(zhì)資源離體保存時(shí)需要定期進(jìn)行繼代培養(yǎng)，多次繼代培養(yǎng)可能造成遺傳性變異及培養(yǎng)物的分化和再生能力的逐漸降低，研究人員建立了離體種質(zhì)資源冷凍保存技術(shù)，有效地降低了繼代周期，隨著種質(zhì)資源離體保存技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，使將來建立離體種質(zhì)資源庫成為可能。

［1］張東旭，周增產(chǎn)，卜云龍，等.植物組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.北方園藝，2011(6):209－213.

［2］沈海龍.植物組織培養(yǎng)［M］.北京:中國林業(yè)出版社，2005:125 －128，200－203.

［3］王學(xué)利，孫世海，王震星，等.植物組織培養(yǎng)及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用［J］.天津農(nóng)林科技，2005(4):25－27.

［4］楊江義，李旭鋒.植物雌性單倍體的離體誘導(dǎo)［J］.植物學(xué)通報(bào)，2002，19(5):522 －559.

［5］KRANZ E，KUMHHN J.Angiosperm fertilization.Embryo and Endosperm Devdopment in vitro［J］.Plant Science，1998，142:183 －197.

［6］王蒂.植物組織培養(yǎng)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2004:79－81.

［7］李永欣，王義強(qiáng).植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用研究概述［J］.江蘇林技，2005，32(3):44 －46.

［8］張東旭.大豆胚尖再生體系的建立及E－2基因遺傳轉(zhuǎn)化［D］.石家莊:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［9］馬慧，張立軍，阮燕燁，等.植物組織培養(yǎng)技術(shù)的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(6):1602 －1604.