MMP-3和TIMP-3在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義

馬海青，嵇學(xué)仙

MMP-3和TIMP-3在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義

馬海青，嵇學(xué)仙

目的探討基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)及其抑制物組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-3(TIMP-3)在胃癌中的表達(dá)情況及其臨床意義。方法通過免疫組化的方法檢測(cè)95例胃癌組織原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中MMP-3和TIMP-3的表達(dá)情況，并分析其與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果MMP-3在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的陽(yáng)性率(74.1%)顯著高于原發(fā)灶中的陽(yáng)性率(55.8%，＜0.05)，而TIMP-3在轉(zhuǎn)移灶中的陽(yáng)性率(37.7%)顯著低于原發(fā)灶中的陽(yáng)性率(66.3%，＜0.05)。MMP-3的表達(dá)與臨床分期呈正相關(guān)(=0.45，＜0.05)；TIMP-3的表達(dá)與臨床分期呈負(fù)相關(guān)(=－0.39，＜0.05)。結(jié)論MMP-3和TIMP-3的表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞MMP-3的表達(dá)明顯增強(qiáng)，TIMP-3的表達(dá)明顯下降，可作為臨床判斷胃癌惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要參考指標(biāo)。

胃腫瘤；癌；基質(zhì)金屬蛋白酶-3；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-3；免疫組織化學(xué)

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特性，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物(TIMPs)在腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中的作用已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，MMPs通過對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)周圍組織的浸潤(rùn)，而TIMPs對(duì)MMPs有特異性抑制作用[1]。本文采用免疫組化EnVision法同時(shí)檢測(cè)胃癌原發(fā)灶及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織中MMP-3和其抑制物TIMP-3的表達(dá)，旨在探討它們?cè)谖赴┻M(jìn)展中的作用及其潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集浙江省德清縣人民醫(yī)院2005年1月至2011年12月手術(shù)切除，術(shù)前均未經(jīng)過化療并經(jīng)病理證實(shí)的胃癌原發(fā)灶及相應(yīng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶95份（患者95例）石蠟標(biāo)本，其中男75例，女20例；年齡37～81歲，中位年齡58.9歲。按照世界衛(wèi)生組織（WHO）病理組織學(xué)分類和TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[2]：高分化腺癌14例，中分化腺癌34例，低分化腺癌47例；Ⅰ期17例，Ⅱ期35例，ⅢA期37例，ⅢB～Ⅳ期6例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例。標(biāo)本顯色不清為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分。深褐色為3分。兩項(xiàng)相加：0～ 1分為陰性(－)，2～3分為弱陽(yáng)性(+)，4～5分為陽(yáng)性(2+)，＞5分為強(qiáng)陽(yáng)性(3+)。1.5統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)；相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 MMP-3和TIMP-3的表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系MMP-3和TIMP-3蛋白主要表達(dá)在癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，鏡下癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。95例胃癌原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移組織中，MMP-3轉(zhuǎn)移灶陽(yáng)性率高于原發(fā)灶，無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移組織陽(yáng)性率低于胃癌原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，3者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。TIMP-3轉(zhuǎn)移灶陽(yáng)性率低于原發(fā)灶，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性率為100%，3者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01)。見表1。

2.2 MMP-3和TIMP-3在胃癌組織的表達(dá)及其與胃癌病理分級(jí)及TNM分期的關(guān)系MMP-3在低分化腫瘤的陽(yáng)性表達(dá)率為74.5%，顯著高于高分化腫瘤的33.3%（2=5.86，=0.02）；TIMP-3在低分化腫瘤的陽(yáng)性表達(dá)率為55.3%，顯著低于高分化腫瘤的80.0%（2=4.15，=0.04）。MMP-3的表達(dá)與臨床分期呈正相關(guān)(=0.45，＜0.05)；TIMP-3的表均經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 m厚連續(xù)切片。抗MMP-3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Lab Vision公司，抗TIMP-3單克隆抗體及EnVision試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 組織標(biāo)本的制備將組織標(biāo)本（胃癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組織)蠟塊收齊后制備成5 m厚連續(xù)切片，行HE和免疫組化染色。

1.3 免疫組化檢測(cè)一抗的稀釋度MMP-3為1∶50，TIMP-3為1∶100，步驟按EnVision兩步法進(jìn)行。以TBS代替一抗作陰性對(duì)照，以試劑盒陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照。切片脫蠟入水后，檸檬酸鹽緩沖液(pH值為6.0±0.1)高壓鍋抗原修復(fù)2min，自然冷卻至室溫(約25℃)。擦干切片周圍水分，3%H2O2室溫孵育10 min，TBS沖洗5 min×3次，加入一抗工作液4℃過夜，TBS漂洗5 min×3次，加入過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃下孵育45 min，TBS漂洗5 min×3次，DAB室溫下顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，充分沖洗中止反應(yīng)。蘇木精復(fù)染胞核，染色1min，1%鹽酸乙醇分色3 s，脫水透明、封固。

1.4 結(jié)果判斷MMP-3和TIMP-3主要表達(dá)在癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色或褐色顆粒狀。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率及顯色深淺采用半定量積分法分級(jí)[3]。（1）陽(yáng)性細(xì)胞百分率：未見陽(yáng)性細(xì)胞者為0分，＜25%為1分，25%～75%為2分，＞75%為3分；（2）顯色深淺：不顯色或

達(dá)與臨床分期呈負(fù)相關(guān)( =－ 0.39，P＜0.05)。見表2。

3 討論

3.1 MMP-3的表達(dá)與胃癌的關(guān)系

MMP-3是MMPs家族成員，能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分。它主要通過直接降解細(xì)胞外基質(zhì)和基膜成分，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)的黏附，激活具有潛在活性的蛋白質(zhì)等作用來(lái)促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。已有文獻(xiàn)報(bào)道MMP-3在宮頸癌中表達(dá)的陽(yáng)性率明顯高于非癌組織，MMP-3可作為宮頸癌浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的評(píng)介指標(biāo)[4]。吳晶晶等[5]檢測(cè)MMP-3在胃癌組織中異常表達(dá)，與胃癌的發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本文胃癌原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移組織中，MMP-3陽(yáng)性率分別為55.8%、74.1%和35.7%；轉(zhuǎn)移灶陽(yáng)性率高于原發(fā)灶，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織陽(yáng)性率低于胃癌原發(fā)灶組織及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織，表明胃癌轉(zhuǎn)移后MMP-3表達(dá)能力增加。MMP-3在胃癌晚期高表達(dá)（88.6%），而在胃癌早期低表達(dá)（47.2%）。隨著晚期癌細(xì)胞的增多，MMP-3表達(dá)量隨之增多，因此癌細(xì)胞產(chǎn)生MMP-3的能力與其侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。MMP-3在低分化腫瘤的陽(yáng)性表達(dá)率為74.5%，顯著高于高分化腫瘤的33.3%（＜0.05）；也提示對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)屏障的破壞增強(qiáng)，為癌的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了條件。由此可見MMP-3的表達(dá)與胃癌的分期正相關(guān)，可以作為判定胃癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的臨床指標(biāo)之一。

3.2 TIMP-3的表達(dá)與胃癌的關(guān)系

TIMPs是MMPs的特異性的抑制劑，能與MMPs形成復(fù)合物抑制MMPs降解ECM的活性，阻止腫瘤的局部生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，限制腫瘤新生血管的形成[6]。Mylona等[7]通過檢測(cè)TIMP-3在乳腺癌組織中的表達(dá)得出，TIMP-3與腫瘤分型和臨床預(yù)后有關(guān)，在預(yù)后差、惡性度高的組織中，它們表達(dá)減少。本文結(jié)果表明，TIMP-3在胃癌原發(fā)灶高表達(dá)(66.3%)，而在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶低表達(dá)(37.7%)，與胃癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞表達(dá)能力進(jìn)一步下降，提示TIMP-3有抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和延長(zhǎng)患者術(shù)后生存期的作用。

表1 MMP-3及TIMP-3的表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

表2 MMP-3、TIMP-3的表達(dá)與胃癌生物學(xué)行為的關(guān)系例（%）

3.3 MMP-3和TIMP-3與胃癌的關(guān)系

TIMP-3作為MMP-3的天然抑制物可下調(diào)MMP-3的活性。當(dāng)TIMP-3表達(dá)減少，則對(duì)MMP-3的抑制作用減弱，MMP-3的活性增強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力增大，屏障破壞增多，有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本文觀察到在胃癌晚期MMP-3的表達(dá)比早期增高,而TIMP-3則相反，致使MMP-3/TIMP-3的比值增高，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，因此提示MMP-3/TIMP-3比例失衡與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移及進(jìn)程和預(yù)后有著密切的關(guān)系。這就意味著通過改變MMP-3/TIMP-3的平衡可以達(dá)到改變腫瘤的侵襲性,從而達(dá)到抗腫瘤轉(zhuǎn)移的目的?？傊谖赴┙M織中進(jìn)行MMP-3、TIMP-3的聯(lián)合檢測(cè)，對(duì)判斷腫瘤的預(yù)后可能有重要價(jià)值。參考文獻(xiàn)：

[1]Jinga DC,Blidaru A,Condrea I,et al. MMP-9 and MMP-2 gelatinases and TIMP-1 and TIMP-2 inhibitors in breast cancer: correlations with Prognostic factors[J].J Cell Mol Med,2006,10(2):499-510.

[2]虞積耀,崔全才.世界衛(wèi)生組織腫瘤分類及診斷標(biāo)準(zhǔn)系列:消化系統(tǒng)腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社, 2006:41-50.

[3]陳秋強(qiáng),石麒麟,嵇學(xué)仙,等.MMP-3和TIMP-3在非小細(xì)胞肺癌及其轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)研究[J].浙江醫(yī)學(xué),2008,30(12): 1304-1306.

[4]劉鑫,拉萊,蘇祖克,等.宮頸癌中CD147、MMP-3的表達(dá)及其臨床意義[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,22(5):540-541.

[5]吳晶晶,王貴吉,張明智.N-cadherin和MMP-3在胃癌中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生,2010,48(23):31-32.

[6]Spurbeck WW,Cat Herine YE,Vanin EF, et al.Retroviral Vector pro-ducer cellmediated in vivo gene transfer of TIMP-3 restricts angiogenesis and neuroblastoma growth in mice[J].Cancer Gene Therapy, 2003,10（1）:161-167.

[7]Mylona E,Magkou C,GiannoPoulou L, et al.Expression of tissue in Hibitor of matrix metalloProteinases(TIMP)-3 Protein in invasive Breast carcinoma:relation totumorPhenotypeandclinicalout-come[J]. Breast Cancer Res,2006,8(5):57-59.

10.3969/j.issn.1671-0800.2014.07.007

R735.2

A

1671-0800(2014)07-0801-02

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馬海青，Email：xiaoxianer77@163.com