胃癌患者血清miR-300的表達(dá)及臨床意義

龍香娥，董琢，楊杰，吳巧萍，陳慧玲

胃癌患者血清miR-300的表達(dá)及臨床意義

龍香娥，董琢，楊杰，吳巧萍，陳慧玲

目的探討胃癌患者血清中miR-300的表達(dá)水平及miR-300作為胃癌診斷標(biāo)記物的可能性。方法采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)25例胃癌患者及15例健康志愿者血清中miR-300的表達(dá)水平；采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析法，檢測(cè)上述標(biāo)本的血清癌胚抗原（CEA）、癌抗原125（CA125）、癌抗原199（CA199）及癌抗原153（CA153）水平。結(jié)果25例胃癌患者miR-300表達(dá)水平是正常人的23.4倍，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(=0.024)；胃癌患者血清CEA、CA125、CA199及CA153水平顯著高于對(duì)照組（均＜0.05）；在胃癌的診斷中miR-300的敏感性比CEA、CA125、CA199及CA153高，但特異性較低。結(jié)論血清miR-300在胃癌中的表達(dá)水平高于正常人，對(duì)于胃癌的診斷具有一定價(jià)值。

胃腫瘤；癌；腫瘤標(biāo)志物；miR-300

胃癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，病死率高居首位。胃癌的早期診斷、早期治療對(duì)于提高胃癌的治療效果、降低病死率十分有效，尋求積極有效的早期診斷胃癌的方法尤為重要。目前臨床上應(yīng)用較多的診斷胃癌的腫瘤標(biāo)志物存在著敏感度和特異度較低的缺點(diǎn)。本研究的主要目的是通過(guò)應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RTPCR檢測(cè)胃癌患者血清與正常人群血清中miR-300的表達(dá)水平，分析miR-300在胃癌患者血清中的表達(dá)水平與正常人的差異，比較miR-300與臨床常用診斷胃癌的腫瘤標(biāo)志物在胃癌的診斷中的敏感性與特異性，為miR-300作為胃癌輔助診斷的分子標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2011年11月至2012年7月寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院胃癌確診住院患者25例，其中男17例，女8例；年齡41～84歲，平均（66.3±10.9）歲。收集15例健康志愿者作為正常對(duì)照組，其中男10例，女5例；年齡53～77歲，平均（64.4±8.0）歲。兩組性別和年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＞0.05）。

1.2方法

1.2.1 主要試劑及儀器RNA提取試劑為美國(guó)Ambion產(chǎn)品TrizolLSreagent；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒為T(mén)AKARA公司產(chǎn)品；U6及miR-300特異RT及PCR引物購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。實(shí)時(shí)定量PCR儀為美國(guó)Stratagene的MX3005P PCR自動(dòng)系列化分析儀。

1.2.2 檢測(cè)方法

1.2.2.1 血清總RNA提取及含量測(cè)定收集各實(shí)驗(yàn)對(duì)象的外周血5 ml，離心分離得所有血清標(biāo)本放于－20℃冰箱凍存待用。按照抽提RNA試劑Trizol LSreagent的說(shuō)明書(shū)抽提各樣本血清總RNA。抽提的RNA溶解于10lDEPC水中。使用分光光度計(jì)測(cè)定提取的RNA樣品在260 nm和280 nm的吸收值用以分析RNA的純度。OD260/OD280在1.8～2.0時(shí)RNA純度較高。按1OD=40gRNA的公式計(jì)算提取的RNA含量。

1.2.2.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miRNA-300的水平用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板，用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA-300的表達(dá)水平。以U6小RNA作參照，每一樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，均分別擴(kuò)增miRNA和U6小RNA，用Mx3005P QPCR System進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束由計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算得到各反應(yīng)管Ct值。然后根據(jù)公式計(jì)算Ct、Ct的值，計(jì)算公式為：Ct=Ct miRNA－Ct U6；Ct=Ct實(shí)驗(yàn)組－Ct對(duì)照組。最后以2－△△Ct表示實(shí)驗(yàn)組miR-300的表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組的差異倍數(shù)。參照相關(guān)文獻(xiàn)，當(dāng)一個(gè)標(biāo)本的2－Ct值＞2.00時(shí)，被認(rèn)為陽(yáng)性[1]。

1.2.2.3 其他腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)血清癌胚抗原（CEA）、癌抗原125（CA125）、癌抗原199（CA199）、癌抗原153（CA153）均采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，儀器及試劑盒為Beckman公司產(chǎn)品。腫瘤標(biāo)志物陽(yáng)性界定值為：CEA＞5ng/ml、CA125＞35 U/ml，CA199＞37 U/ml，CA153＞38 U/ml。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清miR-300的表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果胃癌患者血清中miR-300的表達(dá)水平較正常對(duì)照組高，25例胃癌患者血清miR-300表達(dá)水平是正常人的23.4倍，按文獻(xiàn)報(bào)道的2－Ct值＞2.00為陽(yáng)性結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)，胃癌患者血清miR-300的陽(yáng)性率為96%；參照文獻(xiàn)報(bào)道的倍數(shù)＞4，認(rèn)為相對(duì)表達(dá)差異顯著[2]，25例患者中有21例明顯高于正常組，占整體研究患者的84%。正常對(duì)照組Ct平均為（－1.63±0.68），實(shí)驗(yàn)組Ct平均為（－5.18±2.03）；兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=8.03，＜0.01）。見(jiàn)表1和封三彩圖3。

2.2 血清CEA、CA125、CA199、CA153檢測(cè)結(jié)果研究結(jié)果顯示25例胃癌組血清CEA、CA125、CA19-9、CA153平均水平比15例正常組高，且兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=2.72、2.35、2.36、3.19，均＜0.05）。見(jiàn)表2。

表1 胃癌患者血清中miR-300的表達(dá)水平

2.3 血清miR-300及血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)胃癌的特異性及敏感性25例胃癌患者中，miR-300檢測(cè)結(jié)

果為陽(yáng)性的有24例，而血清腫瘤標(biāo)志物CEA、CA125、CA199、CA153的檢測(cè)中陽(yáng)性例數(shù)分別為8例、10例、11例、16例，可見(jiàn)血清miR-300在胃癌的診斷中敏感度較其他4種常用血清腫瘤標(biāo)準(zhǔn)物高。15例正常組中，miR-300檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的有2例，血清腫瘤標(biāo)志物CEA、CA125、CA199、CA153的檢測(cè)中陽(yáng)性例數(shù)分別為1例、1例、0例、1例，血清miR-300在胃癌的診斷中特異性較其他血清腫瘤標(biāo)志物低。見(jiàn)表3。

3 討論

miRNA是一類(lèi)分子大小為20～25個(gè)核苷酸的具有調(diào)控功能的非編碼RNA。近年來(lái)研究人員在多種腫瘤（如肺癌、肝細(xì)胞癌及宮頸癌等）中發(fā)現(xiàn)了miRNA的異常表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miRNA與人類(lèi)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，miRNA在人類(lèi)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等扮演著重要角色。已有研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及胃癌細(xì)胞的凋亡上均有相關(guān)miRNA在發(fā)揮相應(yīng)的作用。在胃癌的發(fā)生發(fā)展中，miR-21、miR-27a等發(fā)揮著促癌作用[3-4]；miR-9、miR-494等發(fā)揮抑癌作用[5-6]。在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移中，miR-19、miR-106a等發(fā)揮著促進(jìn)癌癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用[7-8]；miR-145等發(fā)揮抑制癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用[9]。

miR-300為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，已有研究結(jié)果顯示miR-300調(diào)控的潛在靶基因在多種生物學(xué)進(jìn)程如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等發(fā)揮重要作用[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-300在胃癌患者血清中表達(dá)水平明顯增加，25例胃癌患者中miR-300表達(dá)水平高于正常人的有24例，即陽(yáng)性率達(dá)96%，21例胃癌患者的miR-300的表達(dá)水平明顯高于正常人。

腫瘤標(biāo)記物是由腫瘤細(xì)胞本身合成或者是由機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞反應(yīng)而產(chǎn)生的一類(lèi)物質(zhì)，目前臨床上診斷胃癌的常用的腫瘤標(biāo)志物有CA199及CEA等。但是目前常用的腫瘤標(biāo)準(zhǔn)物都存在著陽(yáng)性率和特異性較低的問(wèn)題[12]。本研究發(fā)現(xiàn)在胃癌的診斷中miR-300有較高的敏感性，而目前臨床上診斷胃癌常用的腫瘤標(biāo)志物CEA、CA125、CA199及CA153等敏感性均較低；但在胃癌的診斷中miR-300的特異性較低。

本研究將為miR-300作為胃癌輔助診斷的分子標(biāo)志物提供了可能性。但是本研究還存在著不足，如病例標(biāo)本數(shù)量不多，非大樣本量的研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否存在一定偏差等，需擴(kuò)大病例標(biāo)本數(shù)量、結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

表2 胃癌患者血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果

表3 血清miR-300及腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)胃癌的特異性及敏感性%

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ObjectiveTo investigate the expression level of miR-300 in serum of patients with gastric cancer and to explorethevalueofmiR-300inthediagnosisofgastriccancer.MethodsReal-timequantitativeRT-PCR(qRT-PCR) was performed to detect miR-300 level of 25 gastric cancer patients and 15 healthy volunteers.Automatic chemiluminescence immunoassay was used to detect the serum level of CEA,CA125,CA199 and CA153.ResultsThe expression of miR-300 in 25 gastric cancer patients was 23.4 times as more as the normal controls.Compared with the control group,the levels of CEA,CA125,CA199 and CA153 were higher in patients with gastric cancer.In the diagnosis of gastric cancer,the sensitivity of miR-300 was higher than that of CEA,CA125,CA199 and CA153,but the specificity of miR-300 was lower than that of CEA,CA125,CA199 and CA153.ConclusionsExpression level of serummiR-300ingastriccancerpatientswassignificantlyhigerthanthatinnormalcontrols,andithasdiagnosisvalue in gastric cancer.

Gastric neoplasm;Cancer;Tumor marker;miR-300

10.3969/j.issn.1671-0800.2014.07.005

R735.2

A

1671-0800(2014)07-0796-04

2011年度寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院校級(jí)課題（201103）

315100寧波，寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院（龍香娥、陳慧玲）；浙江醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校（董琢）；寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院（楊杰）；寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院（吳巧萍）

龍香娥，Email：longxiangehappy99@163.com