現代色譜技術在藥物分析中的應用

吳路民 劉偉芬 李祿輝

（1.輔仁藥業(yè)集團有限公司，河南 鹿邑477293；2.河南省醫(yī)藥學校，河南 開封475004）

1 衍生技術

隨著液相色譜技術的發(fā)展， 要求使用通用型的高靈敏檢測器，但迄今為止，高效液相色譜還沒有一個足以同氣相色譜相比擬的通用型檢測器。 為了擴大高效液相色譜的適用范圍，提高檢測靈敏度和改善分離效果，采用化學衍生法是一個行之有效的途徑。 化學衍生法是借助化學反應給樣品化合物接上某個特定基團，從而改善樣品混合物的檢測性能和分離效果。

高效液相色譜的化學衍生法是指在一定條件下利用某種試劑(一般稱作化學衍生試劑或標記試劑)與樣品組分在色譜分離之前或分離之后發(fā)生化學反應，從而使得反應產物有利于色譜檢測或分離。 簡言之，化學衍生法主要有以下幾個目的：

（1）提高對樣品的檢測靈敏度；

（2）改善樣品混合物的分離度；

（3）適合于進一步作結構鑒定，如質譜，紅外或核磁共振等。

衍生主要分為紫外和熒光衍生， 下面我們將介紹這兩種衍生方法。

1.1 紫外衍生技術

紫外衍生即加入發(fā)色團使正常形式下不能被檢測的物質能夠檢測。 發(fā)色團應具有較大的摩爾吸收系數，使其吸收光譜能盡量提高檢測靈敏度，使背景噪音變小。

一般情況下用于紫外衍生的試劑要有兩個重要的官能團。第一個用于控制試劑與被測物反應，第二個用于紫外檢測，即發(fā)色團。

常用的紫外衍生試劑有4-溴甲基-7 甲氧基香豆醛、 對-(9-葸酰氧基)苯甲酰甲基溴化物、對-硝基芐基-N，N，-二異丙基異脲、3，5-二硝基芐基-N，N’-二異丙基異脲、溴化對-溴苯甲酰甲基、卜氨基萘(1.NA)、3，5-二硝基氯芐，4-二甲基胺偶氮苯-4-亞磺酰基、 卜萘異氰酸酯、對-硝基芐基羥胺鹽酸鹽、3，5-二硝基芐基羥胺鹽酸鹽、N-琥鉑酰亞胺基-對-硝基苯醋酸酯、N-琥鉑酰亞胺基-3，5-二硝基苯醋酸酯等。

1.2 熒光衍生技術

高效液相色譜的熒光檢測器比紫外檢測器靈敏度更高。具有強紫外吸收的化合物檢測靈敏度可達ng 級水平， 而熒光衍生物的檢測水平一般為10-12.1044mol／L 靈敏度比紫外檢測器提高10-100 倍。HPLC 結合熒光檢測方法所具有的高選擇性、高靈敏度以及試樣用量少的特性， 使得其對各種復雜生物樣品中的分析物測定變得更加靈敏、準確、快速。 但熒光檢測器要求被檢測樣品能被激發(fā)產生熒光。 對于熒光較弱或不產生熒光的樣品靈敏度則很低，甚至不能被檢測。 為了擴大檢品范圍，提高檢測靈敏度，常采用熒光衍生法。

衍生化反應的關鍵是衍生試劑的選擇，從實際分離和檢測經驗方面考慮，用于熒光衍生化反應的衍生化試劑應具備下列條件：（1）試劑應具有較大的摩爾吸光系數。（2）試劑應具有良好的發(fā)光發(fā)色性能，與分析物結合后不減弱。 （3）衍生試劑對某一官能團的衍生反應具有高度選擇性。（4）過量衍生試劑易從反應產物中分離，衍生物應具有好的色譜分離穩(wěn)定性。 （5）在溫和條件下能夠很快定量地生成衍生物。 （6）形成的衍生物的熒光信號應遠高于溶劑的背景吸收，對比明顯且檢測靈敏度高。 （7）試劑合成方法簡單，原料易得、毒性小。 （8）生成的衍生物在甲醇或乙睛溶液中有足夠的溶解度。 （9）衍生物對光有足夠穩(wěn)定性。

目前常用的熒光衍生化試劑有：熒光胺、鄰苯二甲醛、丹酰氯、4-氯-7-硝基-2，1，3-苯駢惡二唑等。 熒光胺是最常用的熒光衍生化試劑，可同伯胺及大多數氨基酸反應，反應迅速，衍生物具有高的熒光強度，而試劑本身則迅速水解為不發(fā)熒光的產物，是一種理想的柱前衍生化試劑；丹酰氯是應用最廣的熒光衍生試劑，常用于含氨基藥物的測定，同伯胺和仲胺都能反應，也可用于含酚羥基的藥物如雌激素的測定；鄰苯二甲醛，常用于伯胺類及氨基酸類化合物的熒光分析。胺類化合物的衍生試劑還有熒光素異硫氰酸酯、芴代甲氧基酰氯、4-氯-7-硝基.2，1，3.苯駢惡二唑、6-氨基喹啉琥珀酰亞胺碳酸酯等。 目前已開發(fā)出一些醇和酸的衍生化試劑。 醇、酚的衍生試劑有：羰基氯類，芴代甲氧基酰氯；磺酰氯類，丹酰氯，鹵代三嗪類，1-乙氧基-4-(二氯.三嗪)萘(EDTN)；羧酸類化合物的衍生試劑有：4-溴甲基.7-甲氧基香豆素，7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯駢呋喃重氮、9-葸重氮甲烷、4-氨甲基.6，7-二甲基香豆素、9-(2-羥乙基).吖啶酮等。 羰基化合物的衍生試劑還有肼類，如DNs.H、CEOC.H；氨基類，如氨基甲基芘等。

衍生化反應從是否形成共價鍵來說，可分為兩種：標記和非標記反應，標記反應是在反應過程中，被分析物與標記試劑之間形成共價鍵。而所有其它類型的反應，如形成離子對、光解、氧化還原反應、電化學反應等都是非標記反應。另一種區(qū)分衍生化反應是根據衍生反應的場所，分為柱前衍生化，柱上衍生化和柱后衍生化三種。從是否與儀器聯機的角度來分有在線和離線兩種。 目前在HPLC 中以離線的柱前衍生法(簡稱柱前衍生法)與在線的柱后衍生法(簡稱柱后衍生法)使用居多。

柱前衍生是在色譜分離前，預先將樣品進行衍生，然后根據衍生物性質進行色譜分離并檢測的方法，其優(yōu)點是勿需考慮衍生反應的動力學因素，衍生化試劑、反應條件和反應時間的選擇不受色譜系統的限制，不需附加儀器設備。缺點是操作過程較繁瑣，容易影響定量分析的準確性， 且衍生反應形成的副產物可能對色譜分離造成較大干擾，從而影響分析結果。 但使用柱前衍生化方法衍生效率高，所以柱前衍生仍是目前分離分析中最常用的方法之一。

柱后衍生是將混合樣品先經色譜柱分離，再進行熒光標記，最后進入檢測器檢測的方法，是液相色譜中比較常用的一種手段。 在分離柱和檢測器之間連接一個小型反應通道，反應混合物以恒定的速度流過，使得衍生反應的操作簡便、重現性好，并且可連續(xù)反應，便于實現分析自動化，因此引起了許多分析專家的興趣。 但由于反應是在色譜系統中進行，對衍生試劑、反應時間和其它反應條件均有嚴格限制，需要通過控制反應通道的尺寸、流動相的流量以及反應通道的溫度來實現在特定溫度下特定時間內的反應，所以在一定程度上限制了它的廣泛應用。

2 色譜聯用技術

由于色譜和各種光譜、質譜手段的多樣性，包含了各種各樣的聯用方式和技術，包括不同色譜技術之間的聯用等。 由于對分析要求的日益增高和各種微量、高通龜色譜及光譜、電子計算機技術的發(fā)展，每種聯用均得到較大發(fā)展，其中最引人注目的是色譜與質譜的成功聯用與多維色譜技術。

2.1 多維色譜技術

常規(guī)的以一維色譜為核心的分析方法由于峰容量的限制，樣品分析時要么采用繁瑣的預處理方法，要么采用選擇性的檢測器，否則色譜峰重疊不可避免。 為了解決這方面的共性問題，建立多維分離方法十分必要。多維色譜分離技術是將樣品注入呈正交分布的多個分離體系中，樣品中各組分以進樣點為原點在多維的分離方向上展開。 多維液相色譜在不同的分離階段采用不同的分離模式，而分離階段的數日多少被稱為維度。 對于柱串聯色譜系統而言，其維度依據所連接分離模式的數目可以是2.3，或更多。 因此，多維分離系統提供了比一維系統更多的分離空間，允許組分峰沿著各分離維的坐標方向展開，從而減少了峰重疊。

多維色譜實現的關鍵技術在于樣品在兩種分離模式之間的轉換，接口與控制技術是該項技術應用的瓶頸。 Ste-ven[91]綜述了多維液相色譜分離在生物醫(yī)學和藥物分析中的應用，指出在多維色譜法中樣品使用的不僅僅是一種分離機制，任何一種分離機制都被看成是獨立的分離維數，被測物的分析可以通過離線收集或直接在線完成。

2.2 色譜／質譜聯用技術

在色譜／質譜聯用技術中，氣相色譜和質譜聯用儀（GC/MS）是開發(fā)最早的色譜聯用儀器，現已廣泛用于藥物濫用監(jiān)測、興奮劑檢測、臨床疾病診斷、藥動學研究等體內藥物分析。 液相色譜與質譜聯用技術（HP I-C/MS）的發(fā)展主要體現在液相色譜通過各種連接口與各種質譜的聯用上。 目前，大氣壓下的液相色譜與質譜的聯用接口主要是電噴霧接口（ESI）和大氣壓下化學電離接口（APCI），其原理是利用氣體輔助（或加高壓）下流動相進行噴霧，將溶劑揮發(fā)掉，同時，流動相中的溶質分子在大氣壓下進行電離。 這種方式在很大程度上解決了使用LC/MS 時對流動相的限制問題， 靈敏度也得到了很大的提高。 HPLC/MS技術可以用來對新藥研發(fā)的各個階段進行整體分析，并測定和評價這些新的化學實體的各種物理和化學性質。 此外，一系列的藥物代謝和藥動學實驗需要測定藥物的吸收、分布、代謝和排泄的特征，以及分析藥動學（PK）參數。 藥物代謝研究是LC/MS 的一個重要的應用方面，LC/MS 除了可確定分子量以外，還可以根據特異性斷裂規(guī)律推導出部分結構共至是完整的結構。LC/MS 鑒定藥物代謝產物主要包括以下幾個步驟：測定原形藥物的質譜；選擇準分子離子、加合離子和主要的碎片離子進行多級質譜分析；選擇原形藥物的主要中性丟失，測定生物樣品的中性丟失譜，圖譜中的離子即為原形藥物和可能的代謝物的分子離子；選擇主要的子離子測定生物樣品的母離子譜，所得母離子即為各個代謝物；測定生物樣品中所有可能代謝物的子離子譜，解譜得到代謝物的結構。 串聯質譜（MS/MS）是將一個質量選擇的操作接到另一個質量選擇的后面， 在單極質譜給出化合物相對分子量的信息后，對準分子離子進行多極裂解，進而獲得豐富的化合物碎片信息，確認目標化合物，對目標化合物定量。 HPLC/MS/MS 聯用技術在新藥研發(fā)和藥物研究方面已成為一種很重要的應用技術。大部分的候選藥物的分析方法都是以GC 或HPLC 為基礎的，并且這種技術已經使藥物代謝并入藥物的研發(fā)過程中。 MS/MS 與單級MS 相比，能明顯改善信號的信躁比，具有更高的靈敏度及選擇性，其檢測水平可以達到pg 級，其高靈敏度和寬選擇性使得血漿中的藥物分析發(fā)展成為快速、定量的分析。 當前，CE 的檢測通常由紫外、二極管陣列或激光誘導熒光等檢測器來完成。 近年來，由于MS 能提供更為豐富的有關相對分子質量和分子結構的信息， 已經成為CE 的最重要的檢測技術之一，CE/MS聯用技術得到很大的發(fā)展。 CE/MS 聯用中，主要離子化手段有快原子轟擊（FAB）和電噴霧電離（ESI）離子化；而CE 的分離模式則主要集中在CZE，MEKC，毛細管凝膠電泳（CGE）和毛細管等速電泳（CITP）等。CE/MS 聯用的關鍵問題是CE 和MS 的接口技術。 當前主要采用無鞘接口、液體接界和鞘式液體接界等接口技術。CE/MS 雖然發(fā)展很快，但是現階段，該技術的應用廣度離常規(guī)定量檢測還有很大距離。 主要問題是：較低的樣品利用率以及由此產生的較弱的濃度靈敏度；與LC／MS 相比有更大的檢測波動性； 分離靈敏度過于依賴樣品基底離子強度等，解決這些問題必將是未來CE／MS 聯用技術發(fā)展的重點。

［1］王俊德,高振華,郁蘊璐,等.高效液相色譜法[M].中國石化出版社,1992.

［2］閆旭光,梁曉波,楊玉坤.高效液相法測定中西藥復方乳劑中甲硝唑的含量[J].藥物分析雜志,1994,14(6)：23-24.

［3］顧小曼,李蕾.高效液相法測定銀杏葉中蘆丁[J].色譜,1995,13(3)：216-217.