草魚(Ctenopharyngodon idellus)呼腸孤病毒(GCRV)VP6相互作用蛋白的篩選*

丁 燏 李 杰 閆秀英 簡(jiǎn)紀(jì)常① 吳灶和

(1. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 湛江 524025;2. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 廣州 510000)

草魚(Ctenopharyngodon idellus)出血病是草魚的主要病害之一, 廣泛流行于我國(guó)魚類主產(chǎn)區(qū)域。它是我國(guó)第一例魚類病毒性疾病, 與其相關(guān)的研究也最為深入, 歷史最為悠久。該病的病原為草魚呼腸孤病毒(GCRV), 是水生呼腸孤病毒屬的C亞型, 且是該屬中毒力最強(qiáng)的病毒株型, 因此具有較高的感染率、流行率、致死率、發(fā)病季節(jié)多等特點(diǎn)(Rangelet al,1999; 遲妍妍等, 2011; Tianet al, 2013)。除了感染草魚外, 還能感染鰱、稀有鯽、青魚、麥穗魚等魚類。GCRV基因組編碼產(chǎn)物計(jì)12種, 其中結(jié)構(gòu)蛋白7種(VP1—VP7), 非結(jié)構(gòu)蛋白5種; 結(jié)構(gòu)蛋白中除了VP2與VP4之外, 其它均是病毒雙層衣殼的蛋白組分(Ivanovicet al, 2007; Caiet al, 2011)。而VP6是該病毒粒子內(nèi)層衣殼的成分, 能夠聯(lián)系內(nèi)外兩層衣殼, 在病毒核酸的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及病毒裝配過(guò)程中起著較重要的作用, 與哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒中δ2蛋白的功能相似(肖波, 2010)。VP6由基因S8編碼, 含有氨基酸殘基412個(gè), 大小為44.6 kDa左右。目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)學(xué)者僅關(guān)注該蛋白的免疫原性、重組表達(dá)、疫苗研制等,對(duì)其相互作用蛋白的研究還未引起足夠的重視(孟思妤等, 2010; 郭帥等, 2010; 周勇等, 2011), 在一定程度上, 阻礙了該病毒的致病機(jī)制、預(yù)防性疫苗等研究工作的深入開展。

基因的作用最終是靠其翻譯表達(dá)的蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)的, 而不同蛋白之間的相互作用對(duì)其功能的發(fā)揮具有重要的意義, 因此了解蛋白質(zhì)之間的作用是掌握基因及其蛋白功能的一種重要途徑, 已成為各領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。常用的蛋白質(zhì)研究方法包括噬菌體表面展示技術(shù)、酵母雙雜交系統(tǒng)、GST標(biāo)記的pull-down技術(shù)、免疫共沉淀法、質(zhì)譜鑒定、病毒鋪覆蛋白印跡技術(shù)、基于生物信息學(xué)的分析方法等。其中酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two-hybrid system)可以直接在體內(nèi)或胞內(nèi)分析蛋白質(zhì)相互作用, 到目前為止該技術(shù)平臺(tái)已廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域以檢測(cè)蛋白與蛋白之間的相互作用(Fieldet al, 1989)。對(duì)病毒而言, 其相互作用蛋白很有可能是其在宿主細(xì)胞上相應(yīng)的受體,而病毒受體是病毒侵染宿主細(xì)胞的決定因素之一(Marret al, 2013), 病毒受體的鑒定及其與病毒蛋白的相互作用過(guò)程與機(jī)制的闡明對(duì)病毒感染機(jī)制分析具有重要作用。GCRV相互作用的蛋白的研究極少,通過(guò)相互作用蛋白的篩選與鑒定是研究其致病機(jī)理的一種重要途徑, 本研究采用GCRV 096株的VP6蛋白作為誘餌蛋白, 通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)篩選與其相互作用的蛋白, 為進(jìn)一步確定GCRV在侵染宿主過(guò)程中VP6的地位打下良好基礎(chǔ), 為進(jìn)一步闡明GCRV的致病機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

GCRV 096株、草魚腎臟組織細(xì)胞系(CIK), 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

質(zhì)粒pGEX-KG購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司, 克隆質(zhì)粒pGBKT7 DNA-BD、pGADT7 AD等和對(duì)照質(zhì)粒pGBKT7-53、pGADT7-T等, 以及酵母菌株(Y2Hgold和Y187)均購(gòu)自Clontech公司, E.coli DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

dNTP 、ExTaq酶、T4DNA連接酶、DNA Marker等試劑, 及MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒, 限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司。

反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM(TransGen公司); QIA quick PCR Purification Kit (QIAGEN公司);UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒與酵母質(zhì)粒小量抽提試劑盒, 實(shí)驗(yàn)中所用的引物(上海生工生物工程有限公司); 質(zhì)粒提取試劑盒(U-gene公司)。

MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System、Yeastmaker Yeast Transformation System 2、Make Your Own “Mate & PlateTM” Library system試劑盒、酵母菌培養(yǎng)所用各種培養(yǎng)基及Advantage 2 Polymerase Mix均購(gòu)自Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 利用軟件Primer Premier_5.0設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增GCRV096 VP6基因, 其序列為: F:5′-CGCGGATCCATGGCACAGCGTCAGTT-3′ (BamH I)和R:5′-ACGCGT CGACTTAGACGAACATCACC-3′(SaII)。

1.2.2 GCRV VP6誘餌載體的構(gòu)建 用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒提取GCRV總RNA, 再以此為模板合成cDNA的第一條鏈(采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒), 然后對(duì)VP6基因用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)參數(shù)參照李杰等(2013)的方法。同樣按照李杰等(2013)的方法完成PCR產(chǎn)物的回收、產(chǎn)物和誘餌載體的連接、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、誘餌重組質(zhì)粒的鑒定等。

pGBKT7-VP6的自激活作用檢測(cè)與毒性檢測(cè)參照YeastmakerTMYeast Transformation System 2操作手冊(cè)與李杰等(2013)的方法進(jìn)行。

1.2.3 VP6相互作用蛋白的篩選 相互作用蛋白的篩選鑒定參照李杰等(2013)的方法進(jìn)行, 包括誘餌菌的篩選和純化、誘餌菌與文庫(kù)菌的體外融合、接合子的顯微觀察、克隆數(shù)的統(tǒng)計(jì)計(jì)算、結(jié)合效率的確定、陽(yáng)性克隆的鑒定與測(cè)序分析等過(guò)程。其中CIK cDNA文庫(kù)(>2.0×107cfu/mL)由本課題組前期工作中所構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 pGBKT7-VP6誘餌質(zhì)粒

將VP6基因PCR產(chǎn)物與克隆質(zhì)粒pGBKT7分別進(jìn)行雙酶切, 然后用T4連接酶連接構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP6, 經(jīng)雙酶切后電泳分析與菌落PCR分析鑒定, 相應(yīng)大小的PCR產(chǎn)物克隆成功(圖1), 且序列測(cè)定結(jié)果完全吻合。其中圖1a為菌落PCR的結(jié)果,說(shuō)明其基因已存在于細(xì)菌的質(zhì)粒之中; 圖1b為雙酶切分析結(jié)果, 與預(yù)期的片段大小、插入位點(diǎn)相符?？梢? 所需的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-VP6構(gòu)建成功, 為VP6相互作用蛋白的篩選提供了可靠的質(zhì)粒。

圖1 VP6基因菌落PCR檢測(cè)與pGBKY7-VP6雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Results of colony PCR analysis of VP6 gene and AGE analysis of pGBKT7-VP6 digested with BamH I and Sal I

2.2 pGBKT7-VP6自激活作用檢測(cè)和毒性檢測(cè)

在SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/Kan培養(yǎng)基上, 含有pGBKT7-VP6的轉(zhuǎn)化菌生長(zhǎng)良好, 但在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固體培養(yǎng)基上未見其生長(zhǎng), 排除了誘餌蛋白的自激活特性。含有pGBKT7-VP6的轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母菌在SD/-Trp平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一切正常, 且在液體培養(yǎng)基(SD/-Trp/Kan)中振蕩培養(yǎng)后, OD600大于0.8, 可見誘餌蛋白并無(wú)毒性。該結(jié)果保證了進(jìn)一步進(jìn)行相互作用蛋白篩選試驗(yàn)的可行性。

2.3 VP6相互作用蛋白的篩選

酵母CIK文庫(kù)菌與VP6釣餌菌相互配合, 在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)已形成了明顯的三葉草型結(jié)構(gòu)(圖2),示2個(gè)大球形的親代單倍體細(xì)胞與1個(gè)正在出芽小球形的二倍體細(xì)胞。說(shuō)明形成了有效的接合子, 可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn), 即將其接種于不同培養(yǎng)基以確定篩選克隆數(shù)。篩選克隆數(shù)(cfu/mL)的獲得是經(jīng)各培養(yǎng)基中平板菌落數(shù)的統(tǒng)計(jì)來(lái)完成的; VP6試驗(yàn)組在SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu等三種不同選擇培養(yǎng)基中的篩選克隆數(shù)依次為5.16×107、3.31×106、1×105cfu/mL,而陽(yáng)性對(duì)照組在三種培養(yǎng)基中的篩選克隆數(shù)依次為7.84×107、6.63×106、3.2×105cfu/mL (表1)。經(jīng)公式: 融合效率 = 二倍體克隆數(shù)(或培養(yǎng)基SD/-Trp/-Leu中的克隆數(shù))/另兩種培養(yǎng)基中克隆數(shù)相比較小的值, 可以計(jì)算出VP6、對(duì)照組的融合效率分別為3.02%、4.83%,介于2%—5%之間, 完全滿足進(jìn)一步試驗(yàn)的基本要求。經(jīng)高篩選培養(yǎng)基SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA反復(fù)對(duì)融合產(chǎn)物(即SD/-Trp/-Leu/ X-α-Gal/AbA平板上的藍(lán)色克隆)進(jìn)行多次篩選確定, 通過(guò)共轉(zhuǎn)化酵母菌Y2HGold等方法驗(yàn)證它們之間的相互作用, 最后共獲得4株可能的陽(yáng)性克隆(呈藍(lán)色、圓形的單菌落)(圖3)。

圖2 酵母融合子的形態(tài)Fig.2 Form of the fused yeasts

表1 篩選克隆數(shù)結(jié)果(cfu/mL)Tab.1 Number of screened clones on the selective medium(cfu/mL)

圖3 融合酵母的篩選結(jié)果Fig.3 Screening result of yeast zygote on the medium ofSD/-Trp/-Leu/ -Ade/-His/X-α-Gal/AbA

對(duì)獲得的4株待定陽(yáng)性克隆文庫(kù)質(zhì)粒插入片段分別送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序, 經(jīng)序列分析與堿基校正后, 發(fā)現(xiàn)它們分別屬于兩條不同的基因序列, 其有效序列長(zhǎng)度分別為470bp和807bp。利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)分析所得序列的結(jié)果表明, 一條序列對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列與3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)呈高度同源, 其同源性為99%, 這種蛋白極可能就是3-磷酸甘油醛脫氫酶; 而另一條蛋白質(zhì)序列暫時(shí)并沒找到其相應(yīng)的同源性蛋白, 可能是一種未知蛋白。

3 討論

酵母雙雜交技術(shù)是一種篩選和鑒定相互作用蛋白的有效手段, 不同于噬菌體展示技術(shù)、免疫印跡技術(shù)、質(zhì)譜分析技術(shù)、基于生物信息學(xué)的蛋白分析技術(shù)等蛋白質(zhì)研究方法, 它集分子克隆技術(shù)、克隆文庫(kù)技術(shù)、蛋白質(zhì)研究技術(shù)與方法于一體, 對(duì)實(shí)驗(yàn)者的實(shí)際操作能力與分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論的要求較高。通過(guò)熟練操作, 經(jīng)它篩選得到的蛋白, 一般而言與該蛋白功能的發(fā)揮密切相關(guān), 它們往往通過(guò)在胞內(nèi)的相互作用相互調(diào)節(jié), 共同參與某一復(fù)雜的生理病理過(guò)程。因此, 該技術(shù)是蛋白質(zhì)功能研究的有效手段之一, 有助于人們理解基因通過(guò)蛋白作用的分子機(jī)制。對(duì)病毒而言, 篩選的相互作用蛋白可能是其受體蛋白或其部分功能域, 也可能是在病毒增殖程中除了結(jié)構(gòu)蛋白之外其它相關(guān)的蛋白質(zhì), 因此在一定程度上, 篩選、鑒定其相互作用蛋白的難度明顯增加了(Fieldet al,1989)。本研究中在項(xiàng)目組已建立CIK cDNA文庫(kù)的基礎(chǔ)上, 充分利用酵母二倍體細(xì)胞來(lái)進(jìn)行CIK cDNA文庫(kù)篩選的方法, 有效地克服了誘餌質(zhì)粒與文庫(kù)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母菌效率低等技術(shù)瓶頸問(wèn)題(Fieldet al,1989); 在高效選擇培養(yǎng)基上反復(fù)篩選得到的陽(yáng)性結(jié)果, 對(duì)含有多種cDNA插入片段的融合菌株進(jìn)行了有效的淘汰, 保證了克隆的均質(zhì)性、有效性(Fieldet al,1989)。本文的結(jié)果也表明在GCRV相互作用蛋白的篩選中酵母雙雜交技術(shù)的高效性與可行性, 該技術(shù)在GCRV相互作用蛋白方面具有較好的應(yīng)用價(jià)值與借鑒意義, 為呼腸孤病毒屬中其它各病毒的功能研究提供了新的途徑與方法。

在草魚呼腸孤病毒粒子雙層衣殼中, VP6蛋白是一種典型的夾合蛋白, 具有聯(lián)系GCRV病毒粒子的內(nèi)外衣殼、穩(wěn)定內(nèi)層衣殼骨架分子VP3的作用, 還可能與病毒粒子表面的突起物也同樣存在一定的相互作用(Chenget al, 2008)。已有研究表明VP6在GCRV基因的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制, 及病毒粒子的裝配中有著重要的地位(方勤, 2005), 還發(fā)現(xiàn)VP6蛋白對(duì)dsRNA有一定的結(jié)合能力, 但對(duì)其相互作用蛋白尚未進(jìn)行深究。本研究中, 經(jīng)酵母雙雜交技術(shù)獲得VP6的兩種相互作用蛋白, 并通過(guò)共轉(zhuǎn)化試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了它們之間的相互作用。在得到的兩種相互作用蛋白質(zhì)中, 其中一種與GAPDH的同源性高達(dá)99%, 可見其為GAPDH的可能性較大, 這是在GCRV與宿主相互作用過(guò)程中新發(fā)現(xiàn)的一種相互作用蛋白。GAPDH是糖酵解反應(yīng)中一個(gè)重要的代謝酶, 此外它還會(huì)參與轉(zhuǎn)錄激活、細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)等非代謝生理過(guò)程(方勤, 2005; Tarzeet al, 2007; Marret al, 2013; Zinsseret al, 2014)。作為VP6的一種相互作用蛋白, GAPDH在GCRV侵染過(guò)程中極可能參與了宿主的代謝調(diào)控, 或參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)調(diào)節(jié)等過(guò)程。但其具體的機(jī)制還有待后續(xù)研究深入的闡明, 此外這種相互作用與VP6作為夾合蛋白間的聯(lián)系, 以及這種相互作用與病毒表面突起物間作用的關(guān)聯(lián)性都值得作更深入的探討。而另一種相互作用蛋白尚屬未知蛋白, 加強(qiáng)對(duì)其鑒定及其功能研究可能會(huì)有更多的發(fā)現(xiàn), 極可能是對(duì)GCRV致病機(jī)理研究的一個(gè)突破。盡管對(duì)未知蛋白的研究困難重重, 在后續(xù)研究中一定要重視對(duì)它的研究, 以獲取更多的病毒致病機(jī)制的相關(guān)信息。總之,本研究為進(jìn)一步探討VP6的生物學(xué)功能以及GCRV的侵染機(jī)制指明了一定的方向, 該蛋白的結(jié)構(gòu)與功能、相互作用的分子機(jī)制及其調(diào)節(jié)機(jī)理等研究工作需要更加深入進(jìn)行。

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