石斑魚及暫養(yǎng)環(huán)境中副溶血弧菌分離鑒定與毒力評價*

高 磊 鄧益琴 劉助紅 龍云映 陳 償

(中國科學院南海海洋研究所 中國科學院海洋生物資源可持續(xù)利用重點實驗室 廣東省應用海洋生物學重點實驗室 廣州 510301)

副溶血弧菌最早是由Fujino等(1953)于1953年從日本一個食物中毒患者體內初次分離得到的, 是一種革蘭陰性嗜鹽菌, 屬弧菌科弧菌屬成員。副溶血弧菌廣泛分布于近海區(qū)域、鹽湖及魚、貝類等海產品中, 是沿海地區(qū)引起食物中毒的重要病原菌, 可導致患者出現(xiàn)腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐和頭疼等典型胃腸炎反應, 嚴重者可引起敗血癥。我國沿海地區(qū)每年都有因副溶血性弧菌引起食物中毒的報道。

大量研究表明, 副溶血弧菌的致病作用與其產生的多種溶血素有關, 主要是耐熱直接溶血素(thermostable direct hemolysin, TDH)、TDH相關溶血素(TDH-related hemolysin, TRH)和不耐熱溶血素(thermolabile hemolysin, TLH) (寧喜斌等, 2008)。神奈川現(xiàn)象(Kanagawa phenomenon, KP)一直被認為與副溶血弧菌主要毒力因子之一TDH引起的β溶血現(xiàn)象有關。此外, TRH和TLH也能引起相關的溶血, 而KP也成為檢測副溶血弧菌致病性的一個重要生化指標。III型分泌系統(tǒng)(Type III secretion system, T3SS)廣泛存在于革蘭陰性病原菌中, 負責分泌與細菌毒力相關的多種蛋白質, 大量報道表明其與許多病原菌密切相關, 不同病原菌根據(jù)自身的需要, 通過T3SS的不同毒力策略導致臨床表型。已發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌存在兩個T3SS基因簇, T3SS-1介導副溶血弧菌的細胞毒性作用, 其VopQ, VopS和VPA0450等效應蛋白涉及誘導自噬性死亡(Burdetteet al, 2008;Broberget al, 2010)。而T3SS-2與副溶血弧菌的腸毒性有關(Makinoet al, 2003; Parket al, 2004; Onoet al,2006; Burdetteet al, 2009), 主要在臨床上的分離株中被發(fā)現(xiàn), 并與副溶血弧菌流行株和疾病大暴發(fā)相關(Parket al, 2004), 且沒有T3SS-2的菌株普遍被認為缺乏潛在的致病性(Caburlottoet al, 2010), 其效應蛋白VopC, VopT, VopA和VopL與各種引起腸毒性的細胞過程相關(Broberget al, 2011)。

細胞死亡不僅是生命有機體在生長發(fā)育過程中的正常生理現(xiàn)象, 同時也在抵抗外界病原細菌侵染的過程中發(fā)揮至關重要的意義。因此, 可利用感染細胞實驗來評價副溶血弧菌的毒力(Grassméet al,2001)。此外, 體內毒性實驗是最直觀、最具說服力的細菌致病力指標。很多動物模型已被用于研究副溶血弧菌的致病機理, 包括小鼠口胃和腹腔注射, 兔回腸循環(huán)模型以及哺乳期兔和小鼠的口頭感染。其中的一些試驗表明, 副溶血弧菌通過口灌或腹腔注射可以引起小鼠死亡。這些模型為副溶血弧菌的病理生理學提供了線索(Pi?eyroet al, 2010)。

作為食源性致病菌, 人們認為海鮮產品極易被副溶血弧菌污染, 但是迄今為止, 還沒有直接證據(jù)證明海鮮產品生產、運輸和暫養(yǎng)環(huán)境中副溶血弧菌能致病。多個研究結果顯示這些環(huán)境中的副溶血弧菌與臨床菌株間表型及致病性等方面存在極顯著差異(Theethakaewet al, 2013), 因此對這些環(huán)境中的副溶血弧菌致病力進行研究, 將有助于了解環(huán)境菌株與臨床菌株的關系, 并確定海鮮產品在生產和流動過程中副溶血弧菌污染的風險, 本研究將以石斑魚暫養(yǎng)環(huán)境為例進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細胞及KM(昆明)鼠 副溶血弧菌從廣州黃沙水產市場石斑魚及其養(yǎng)殖水體、廣州明記海鮮酒樓海鮮石斑魚及其養(yǎng)殖水體中分離得到; 胖頭魚肌肉細胞(FHM細胞)由本實驗室保存; KM鼠由廣州中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 TSA、TSB、TCBS培養(yǎng)基購自美國BD公司, 2216E培養(yǎng)基、我妻氏血瓊脂培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司, Medium199培養(yǎng)基購自杭州吉諾生物醫(yī)療技術有限公司。

1.1.3 主要試劑 無菌脫纖維兔血購自廣州蕊特生物科技有限公司, 細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司, PCR及電泳相關試劑購自大連Takara公司, 4%多聚甲醛固定液購自廣州晶欣生物科技公司, 胰酶(Trypsin)、血清購自美國Gibco公司。

1.2 引物設計與合成

副溶血弧菌鑒定基因gyrB擴增引物序列, 參考Venkateswaran等(1998); 副溶血弧菌毒力基因檢測引物序列, 其中tdh、trh、tlh基因引物序列參考Bej等(1999), T3SS效應蛋白的引物序列, 通過NCBI下載基因序列, 并通過引物設計軟件Premier 5設計相應引物。引物序列由上海生工生物工程技術有限公司合成(表1)。

1.3 菌株分離、純化、保種及初步鑒定實驗

在黃沙水產市場及明記海鮮酒樓等石斑魚暫養(yǎng)環(huán)境中設立監(jiān)測點, 每1—2周取樣一次, 連續(xù)監(jiān)測,采集樣品為石斑魚及其暫養(yǎng)水體。對于石斑魚, 進行常規(guī)解剖, 用接種環(huán)刮取體表、鰓、心、肝、脾、腎等處的黏液后于3%鹽度的TSA平板中劃線分離純化;對于水體樣品, 將水樣搖勻, 取100uL涂布于3%鹽度的TSA平板中分離并多次純化, 挑克隆后用甘油終濃度為20%的2216E培養(yǎng)基于-80°C凍存; 通過弧菌選擇性培養(yǎng)基TCBS對分離菌株進行初步鑒定。

1.4 菌株PCR鑒定實驗

用Tiangen細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA; 50uL PCR反應體系含10×PCR 緩沖液5uL, dNTP 混合液 (10mmol/L) 4uL, gyrB 上游引物(10μmol/L) 2uL, gyrB 下游引物 (10μmol/L) 2uL, Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.5uL, DNA模板1uL, 加水至50uL; 擴增產物取5μL用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并由上海英俊生物技術有限公司測序, 對測序結果進行NCBI在線Blast比對分析及多重序列比對分析;引物序列、擴增程序、目的片段大小及參考文獻參照表1。

1.5 已鑒定副溶血弧菌毒力基因的PCR檢測實驗

基因組提取、PCR體系、瓊脂糖檢測及測序參照菌株PCR鑒定實驗, 引物序列、擴增程序、目的片段大小及參考文獻參照表1, 對測序結果進行NCBI在線Blast比對分析。

1.6 神奈川溶血實驗

將副溶血弧菌接種于1% NaCl的TSB (pH=7.6—8.0)培養(yǎng)基中, 30°C、230r/min搖床培養(yǎng)約15h后取1uL點種到我妻氏血瓊脂平板, 37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h, 觀察溶血結果(Wagatsuma, 1968; Takeda,1983), 重復實驗三次。

表1 本研究中所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.7 細菌感染實驗

將接種于2216E培養(yǎng)基中, 30°C、230r/min搖床培養(yǎng)約15h后的待測菌株, 3000r/min, 離心3min后,用新鮮培養(yǎng)基重懸菌沉淀, 并稀釋至OD600(吸光度)=0.4, 然后用10uL稀釋后菌液感染FHM細胞, 使感染復數(shù)達到100。2h后用4%多聚甲醛固定0.5h, 然后用Hoechst33258染色, 于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)尤其是細胞核的變化, 確定細胞死亡情況并拍照, 重復實驗三次。

1.8 KM鼠灌胃實驗

將接種于2216E培養(yǎng)基中, 30°C、230r/min搖床培養(yǎng)約15h后的待測菌株, 測定其OD600后, 進行梯度稀釋, 用10–5、10–6稀釋度的菌液100uL涂布于含3%鹽度的TSA培養(yǎng)基平板中, 每個濃度涂布3個平板, 30°C恒溫箱中培養(yǎng)約15h后, 對每個平板上的菌落進行計數(shù), 選擇一個合適的稀釋度(一般每個平板上的菌落數(shù)為30—300個為有效計數(shù))進行菌落的平均計數(shù), 用以確定1mL菌液中1個OD600的細菌數(shù)量。

將待測菌株接種于2216E培養(yǎng)基中, 30°C、230r/min搖床培養(yǎng)一定時間后, 4000r/min離心3min后, 去上清, 用2216E培養(yǎng)基懸浮細菌, 使得最終菌液濃度為(1.5—2.5)×109CFU/mL, 并對10—12g的KM鼠進行灌胃。每只小鼠灌胃菌液0.2mL, 即(3.0—5.0)×108CFU, 每種待測菌株灌胃5只KM鼠,并設置一組灌胃2216E培養(yǎng)基作為對照, 觀察灌胃后一周內KM鼠的死亡情況, 以確定各待測菌株對KM鼠的致病致死情況。

2 結果

2.1 菌株篩選結果及其形態(tài)特征

2011年10月到2012年3月, 共分離純化得到菌株281株, 根據(jù)菌落來源、表型等選取各環(huán)境中分離到的有典型意義的菌株共12株。這些菌株通過弧菌選擇性培養(yǎng)基TCBS初步鑒定, 結果MJ01-1、MJ03-1、HS51-5、HS52-3、HS54-4 共5株在TCBS平板上呈綠色, 可能為副溶血弧菌。

2.2 PCR鑒定結果

初步鑒定為副溶血弧菌的菌株中, 在菌體基因組質量檢測合格的條件下, 均有gyrB鑒定基因目標條帶(圖1); 測序Blast比對后, HS52-3為創(chuàng)傷弧菌,其余4株為副溶血弧菌(圖2), 且多序列比對分析結果顯示, HS52-3與其余4株相似性很低, 其余4株之間相似性很高, 因此, 這4株副溶血弧菌作為毒力評價的待測菌株。

圖1 待測菌株gyrB基因的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of gyrB gene

2.3 副溶血弧菌毒力基因檢測結果

鑒定得到的4株副溶血弧菌均有tdh基因和tlh基因, 而均沒有trh基因; 均含有所檢測的T3SS-1效應蛋白基因vopQ、vopR、vopS和vpa0450; 只有HS51-5和HS54-4含有所檢測的T3SS-2效應蛋白基因vopC、vopT、vopA和vopL, 而MJ01-1和MJ03-1都只含有vopA(圖3, 表2)。

表2 副溶血弧菌的毒力基因分布Tab.2 Virulence genes of V. parahaemolyticus

2.4 副溶血弧菌神奈川溶血檢測結果

4株副溶血弧菌在我妻氏血瓊脂上均有KP現(xiàn)象的典型特征, 菌落周圍都有一明顯的透明溶血圈, 其中MJ01-1的溶血圈較其它3株大、而且亮, 顯示為較強溶血。

2.5 細菌感染實驗結果

FHM細胞, 經待測副溶血弧菌感染之后, 細胞均有死亡, 而陰性對照菌沒有細胞死亡, 說明待測副溶血弧菌都存在細胞毒性。通過Hoechest33258染色后, 在熒光顯微鏡下觀察到HS51-5、HS54-4、MJ01-1、MJ03-1導致細胞死亡的表現(xiàn)均為: 細胞大量死亡, 細胞變圓脫落、細胞核皺縮、DNA片段化并形成凋亡小體。但是HS51-5、MJ01-1導致細胞死亡的情況較HS54-4、MJ03-1嚴重, 這表現(xiàn)為感染時間均為2h, 但HS51-5、MJ01-1導致細胞死亡后, 細胞核嚴重皺縮, DNA嚴重片段化(圖4)。

2.6 副溶血弧菌對KM鼠的體內毒性結果

通過對KM鼠進行灌胃待測副溶血弧菌, 每組灌胃5只KM鼠, 并通過設置灌胃2216E培養(yǎng)基為陰性對照。在灌胃后的24h內, HS51-5只導致本組4號死亡, 之后也沒有小鼠死亡, 死亡率為20.00%; HS54-4導致3只KM鼠死亡, 并在接下來的24h內又導致1號KM鼠死亡, 最后只有4號存活, 死亡率為80.00%;MJ01-1導致4只KM鼠死亡, 只有2號存活, 之后2號也沒有死亡, 死亡率為80.00%; MJ03-1導致5只KM鼠均死亡, 死亡率達到100.00%。在48h后, 存活的小鼠沒有死亡, 活動也正常(表3)。

3 討論

目前為止, 對副溶血弧菌致病性的研究已有很多。本研究旨通過毒力基因分布、神奈川溶血、細胞和動物模型的毒性分析, 評價石斑魚暫養(yǎng)環(huán)境中副溶血弧菌對人的致病風險。

副溶血弧菌作為一種食源性致病菌, 主要分布于沿岸海水、海河交界處及海產品中。由于生吃或食用未熟的海產品可導致患者腹瀉、惡心、發(fā)燒等典型的胃腸炎及食物中毒, 本病多在夏秋季發(fā)生于沿海地區(qū), 常造成集體發(fā)病(寧喜斌等, 2008)。在本研究中, 對運輸(廣州黃沙水產市場)和銷售(廣州明記海鮮酒樓)等海鮮暫養(yǎng)環(huán)境進行采樣、分離、純化菌株,最后在運輸環(huán)節(jié)中, 選取的10株菌株中有2株是副溶血弧菌, 并且其中有一株在KM鼠體內毒性實驗中毒性不強; 而銷售環(huán)節(jié)中選取的2株細菌均為副溶血弧菌, 且2株毒性都較強。

圖2 待測菌株gyrB 基因的多重序列比對Fig.2 Multiple sequence alignment of gyrB gene in the strains

表3 副溶血弧菌導致KM鼠的死亡情況Tab.3 Death of the Kunming mice induced by V. parahaemolyticus

此外, 鑒定得到的4株副溶血弧菌均有tdh和tlh基因, 而均沒有trh基因。一般認為tdh與神奈川溶血相關(Broberget al, 2011), 而trh的存在可能抑制tdh的表達(寧喜斌等, 2008),tlh的作用目前尚不清楚。本研究的KP實驗結果也驗證了這一點, 即4株待測副溶血弧菌都存在神奈川溶血現(xiàn)象。

一般而言, T3SS-1與細胞毒性有關。本研究中, 4株待測副溶血弧菌均含有所檢測的T3SS-1效應蛋白基因, 而通過細菌感染實驗, 我們可以看到這4株待測菌株都對FHM細胞存在細胞毒性, 都使得細胞變圓、細胞核皺縮以及DNA片段化, 但具體是凋亡、自噬性細胞死亡、脹亡或促炎癥細胞死亡中的哪種死亡方式(Finket al, 2005), 我們尚無定論, 這還需要通過TUNEL標記、Caspase活性檢測、自噬泡形成檢測和LDH釋放等不同方法來分析T3SS-1導致FHM細胞死亡的特征, 從而揭示細胞死亡的具體方式, 但是本研究中檢測的T3SS-1的vopQ、vopR、vopS和vpa0450效應蛋白基因, 除vopR的作用機制尚不確定之外, 其余三種效應蛋白基因均涉及誘導細胞自噬性死亡(Burdetteet al, 2008; Broberget al, 2010), 因此, 我們推測這4株待測菌株通過誘導自噬途徑導致細胞死亡。

另外, 對于T3SS-2, 一般認為其與腸毒性有關。本研究中檢測了vopC、vopT、vopA和vopL四種效應蛋白基因。HS51-5和HS54-4都含有這四種基因, 而MJ01-1和MJ03-1都只含有vopA。在KM鼠體內毒性實驗中, 4株待測菌株都具有毒性, 但是HS51-5的毒性較弱。這與基因檢測結果不太一致, 但是從本研究中所檢測基因的作用來看,vopC和vopT還是主要與細胞毒性有關(Broberget al, 2011), 而vopA和vopL與細胞轉錄有關(Broberget al, 2011), 而且T3SS-2的效應蛋白不止于這四種, 因此, 還需要通過檢測更多可能的效應蛋白基因, 并進行基因敲除與回補等方法進一步確定與待測菌株致病致死有關的效應蛋白。

圖3 副溶血弧菌毒力基因的PCR檢測Fig.3 PCR identification of virulence genes in V. parahaemolyticus

圖4 副溶血弧菌誘導FHM細胞的細胞核皺縮和片段化Fig.4 Shrinkage and fragmentation of FHM (fat head minnow) cell nucleus induced by V. parahaemolyticus

通過本研究的各項實驗, 可以看出副溶血弧菌的致病機制非常復雜, 而且一些毒力因子的作用機理以及它們之間的相互作用并不是十分的清楚, 還需要更進一步研究。但不同的檢測手段從不同水平對副溶血弧菌進行致病性檢測, 它們之間的確存在著相互聯(lián)系。

寧喜斌, 劉代新, 張繼倫, 2008. 副溶血性弧菌的致病性及其快速檢測. 微生物與感染, 3(1): 53—56

Bej A K, Patterson D P, Brasher C Wet al, 1999. Detection of total and hemolysin-producingVibrio parahaemolyticusin shellfish using multiplex PCR amplification oftlh, tdhandtrh. Journal of Microbiological Methods, 36(3): 215—225

Broberg C A, Calder T J, Orth K, 2011.Vibrio parahaemolyticuscell biology and pathogenicity determinants. Microbes and Infection, 13(12—13): 992—1001

Broberg C A, Zhang L, Gonzalez Het al, 2010. AVibrioeffector protein is an inositol phosphatase and disrupts host cell membrane integrity. Science, 329(5999): 1660—1662

Burdette D L, Seemann J, Orth K, 2009.VibrioVopQ induces PI3-kinase independent autophagy and antagonizes phagocytosis. Molecular Microbiology, 73(4): 639—649

Burdette D L, Yarbrough M L, Orvedahl Aet al, 2008.Vibrio parahaemolyticusorchestrates a multifaceted host cell infection by induction of autophagy, cell rounding, and then cell lysis. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105(34): 12497—12502

Caburlotto G, Lleò M M, Hilton Tet al, 2010. Effect on human cells of environmentalVibrio parahaemolyticusstrains carrying type III secretion system 2. Infection and Immunity,78(7): 3280—3287

Fink S L, Cookson B T, 2005. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infection and Immunity, 73(4): 1907—1916

Fujino T, Okuno Y, Nakada D, 1953. On the bacteriological examination of shirasu food poisoning. Medical January of Osaka University, 953(4): 299—304

Grassmé H, Jendrossek V, Gulbins E, 2001. Molecular mechanisms of bacteria induced apoptosis. Apoptosis, 6(6): 441—445

Makino K, Oshima K, Kurokawa Ket al, 2003. Genome sequence ofVibrio parahaemolyticus: a pathogenic mechanism distinct from that ofV cholerae. Lancet, 361(9359): 743—749

Ono T, Park K S, Ueta Met al, 2006. Identification of proteins secreted viaVibrio parahaemolyticustype III secretion system 1. Infection and Immunity, 74(1): 1032—1042

Park KS, Ono T, Rokuda M et al, 2004. Functional characterization of two type III secretion systems ofVibrio parahaemolyticus.Infection and Immunity, 72(11): 6659—6665

Pi?eyro P, Zhou X, Orfe L Het al, 2010. Development of two animal models to study the function ofVibrio parahaemolyticustype III secretion systems. Infection and Immunity, 78(11): 4551—4559

Takeda Y, 1983. Thermostable direct hemolysin ofVibrio parahaemolyticus. Pharmacological & Therapeutics, 19: 123—146

Theethakaew C, Feil E J, Castillo-Ramírez Set al, 2013. Genetic relationships ofVibrio parahaemolyticusisolates from clinical, human carrier and environmental sources in Thailand determined by multilocus sequence analysis.Applied and Environment Microbiology, 79(7): 2358—2370

Venkateswaran K, Dohmoto N, Harayama S 1998. Cloning and nucleotide sequence of thegyrbgene ofVibrio parahaemolyticusand its application in detection of this pathogen in shrimp.Applied and Environment Microbiology, 64(2): 681—687

Wagatsuma S, 1968. A medium for the test of haemolytic activity ofVibrio parahaemolyticus. Media Circle, 66: 143—151