利用排水稱重法測定、分析不同海區(qū)牡蠣的貝殼密度*

竺奇慧 張 瑞 紀(jì) 鵬 許 飛 李 莉 張國范①

(1. 海洋生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 中國科學(xué)院海洋研究所 青島 266071;2. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

牡蠣是一種營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值都較高的貝類,在我國已經(jīng)有2000多年的養(yǎng)殖歷史。它們呈世界性分布, 各臨海國家和地區(qū)幾乎都產(chǎn)牡蠣, 也是目前我國乃至全球產(chǎn)量最大的經(jīng)濟(jì)貝類(王如才等, 2008)。作為濾食性貝類, 牡蠣主要分布在潮間帶, 營固著和群聚生活, 是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要成員, 對其生活的內(nèi)灣和近海水域環(huán)境起重要調(diào)控作用。海洋酸化是指由于吸收大氣中過量二氧化碳(CO2)而導(dǎo)致的海水逐漸變酸的現(xiàn)象。調(diào)查顯示, 大多數(shù)中低緯度陸架海近岸海域表層CO2分壓明顯高于海區(qū)中部區(qū)域(薛亮等,2011), 也就是說, 相對其他海洋區(qū)域而言, 牡蠣所生活的近岸海域是最先也是最容易受到海洋酸化影響的海域。而牡蠣在貝殼形成的過程中, 能將餌料中攝取的有機(jī)碳以無機(jī)碳酸鈣的形式固化, 從而為減少溫室效應(yīng)以及海洋酸化作出積極貢獻(xiàn)。

貝殼的形成是一個有機(jī)和無機(jī)分子之間相互識別的過程, 即有機(jī)分子控制無機(jī)凝聚態(tài)納米結(jié)構(gòu)材料形成的過程(Bermanet al, 1993)。同時, 貝殼也是牡蠣抵抗外界環(huán)境變化和保護(hù)自身安全的第一道防線,例如貝類在遭遇低鹽等滲透壓壓力的脅迫時, 它們首先啟動的是閉殼反應(yīng), 以隔絕軟體部與環(huán)境的交流(Hoyauxet al, 1976)。而牡蠣所處的潮間帶, 由于介于海陸之間, 交替露空和浸水, 對所處的生物在溫度、鹽度、缺氧等環(huán)境因素適應(yīng)性上有較高的要求。因此, 貝殼的硬度、厚度及密度等物理性質(zhì)與牡蠣適應(yīng)潮間帶惡劣環(huán)境之間有很大的相關(guān)性, 但是國內(nèi)外卻鮮見與之相關(guān)的研究報道。Zhang等(2012)從基因組及轉(zhuǎn)錄組的角度分析了牡蠣貝殼形成的機(jī)制,對于牡蠣貝殼研究奠定了重要的組學(xué)基礎(chǔ); 有研究者還發(fā)現(xiàn)了一些與長牡蠣貝殼形成相關(guān)的基因和蛋白(Wanget al, 2013; Songet al, 2014)。除此之外, 不同海區(qū)的餌料結(jié)構(gòu)、水溫變化、鹽度變化以及潮汐海浪等環(huán)境因素也會作用于牡蠣的貝殼生長, 可能會影響牡蠣貝殼的密度。為此, 本研究采用排水稱重法對來自于不同海區(qū)26個站點(diǎn)的1100個樣品進(jìn)行了測定分析, 旨在初步解析環(huán)境效應(yīng)對牡蠣貝殼密度的影響, 為牡蠣貝殼形成機(jī)制以及溫度、鹽度和海洋酸化等環(huán)境因素對牡蠣貝殼形成的影響等研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究對不同海區(qū)牡蠣的貝殼密度進(jìn)行了測量及比較分析, 樣品取自國內(nèi)22個不同海域(圖1), 以及4個國外血統(tǒng)牡蠣群體: 23號來自日本、24號來自韓國、25號來自加拿大、26號來自南非, 它們均為引種國內(nèi)后的選育群體。

國內(nèi)取樣點(diǎn)以渤海近岸及黃海近岸為主, 少量分布在東海近岸以及南海近岸。巨牡蠣屬在中國沿海的分布具有區(qū)域性(王海艷, 2004), 通過鑒定, 我們確認(rèn)1至19號取樣點(diǎn)所取牡蠣均為長牡蠣(Crassostrea gigas), 20至22號取樣點(diǎn)所取為葡萄牙牡蠣(Crassostrea angulata)。而國外血統(tǒng)的牡蠣均為人工養(yǎng)殖的長牡蠣,與野生牡蠣相比, 其受到的環(huán)境壓力相對較弱。根據(jù)牡蠣在潮間帶的垂直分布, 取樣點(diǎn)2、6、13號以及20號的牡蠣均取自潮間帶上部。

圖1 國內(nèi)取樣點(diǎn)分布圖Fig.1 The sampling sites of this study

1.2 方法

1.2.1 殼形態(tài)指數(shù) 在清除貝殼表面附著的生物和污物后, 先對牡蠣的殼長(L)、殼高(H)、殼寬(W)等形態(tài)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行測量, 其中殼長、殼高、殼寬參照蔡英亞等(1995)的定義。根據(jù)許飛等(2007)報道的方法, 計算牡蠣殼形態(tài)指數(shù)(SMI值, shell morphological index), 用如下公式計算: SMI=L×W/H2。SMI值相對較大的牡蠣, 其形態(tài)更接近圓形; 而SMI值相對較小的牡蠣, 其體形較為狹長。

1.2.2 排水稱重法 在對牡蠣的形態(tài)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行測量后, 解剖牡蠣, 去除軟體部。最后用排水稱重法對牡蠣貝殼進(jìn)行測量, 操作步驟如下:

(1) 準(zhǔn)備量程600g、精度0.01g的電子天平一臺,盛有蒸餾水的500mL燒杯一只, 鑷子和記號筆, 以及待測的貝殼;

(2) 用記號筆在鑷子夾物端以上2cm左右處劃一條標(biāo)線;

(3) 將燒杯置于電子天平上, 鑷子伸入液面至步驟(2)所劃標(biāo)線處, 鑷子必須懸于水中不觸壁, 打開天平并調(diào)零(圖2a);

(4) 如圖2b所示, 用鑷子夾貝殼伸入液面至步驟(2)所劃標(biāo)線處, 鑷子以及貝殼必須懸于水中不觸壁, 待電子天平穩(wěn)定后記錄讀數(shù)m(單位: g), 該讀數(shù)m的值即等于貝殼體積V(單位: cm3)(此步驟的原理見本文討論部分);

(5) 如圖2c所示, 放開鑷子, 讓貝殼沉至底部,鑷子的位置保持伸入液面至標(biāo)線不變, 待電子天平穩(wěn)定后記錄讀數(shù)M(單位: g), 該讀數(shù)M即為貝殼質(zhì)量;

(6) 根據(jù)步驟(4)記錄的貝殼體積V和步驟(5)記錄的貝殼質(zhì)量M, 計算密度ρ=M/V。

其中步驟(1)中所述電子天平可以是較為常見的量程為500g及以上、精度為0.1g或0.01g的電子天平, 燒杯的大小根據(jù)待測貝殼大小選擇, 可以是100mL至500mL不等, 加入的水量以能夠完全淹沒貝殼但不溢出為度, 鑷子是普通10cm左右長的鐵質(zhì)鑷子, 記號筆是油性防水筆。

1.3 數(shù)據(jù)處理

圖2 排水稱重法操作示意圖Fig.2 Instructions of draining-weighing method

測量結(jié)果用Excel軟件及R語言軟件進(jìn)行分析和作圖, 其中R語言部分參照湯銀才(2008)以及薛毅等(2006)介紹的方法。除貝殼密度計算、密度均值及標(biāo)準(zhǔn)差計算等常規(guī)計算外, 對不同取樣點(diǎn)的每只牡蠣,利用配對樣本t檢驗(yàn)方法分析左右貝殼間的密度差異;對不同取樣點(diǎn)間的牡蠣貝殼密度, 用單因素方差分析法分析差異顯著性, 再利用多重t檢驗(yàn)方法, 對各取樣點(diǎn)間的均值進(jìn)行多重比較, 并用Bonferroni方法校正P值。

為了分析牡蠣外形是否影響貝殼的密度, 對不同取樣點(diǎn)牡蠣的貝殼形態(tài)參數(shù)與貝殼總密度之間又進(jìn)行了相關(guān)系數(shù)分析。相關(guān)系數(shù)的取值范圍為-1至+1之間(R表示相關(guān)系數(shù)), 相關(guān)系數(shù)的絕對值|R|越接近于1, 表示兩變量間的相關(guān)關(guān)系越密切; 越接近于0, 表示相關(guān)關(guān)系越弱; 若|R|=1, 則表示兩個變量完全相關(guān), 正數(shù)為正相關(guān), 負(fù)數(shù)為負(fù)相關(guān);R=0則表示完全不相關(guān)(李彥萍等, 2003)。

2 結(jié)果

2.1 牡蠣貝殼形態(tài)指數(shù)分析

各取樣點(diǎn)牡蠣的殼長、殼高、殼寬等參數(shù)測量結(jié)果如表1所示, 大部分取樣點(diǎn)的牡蠣其SMI值在0.19至0.28之間; 而18和22號取樣點(diǎn)的牡蠣SMI值相對較大, 牡蠣形態(tài)較圓; 取樣點(diǎn)10、11和23號的牡蠣SMI值較小, 牡蠣形態(tài)較狹長。

表1 不同取樣點(diǎn)牡蠣形態(tài)參數(shù)測量結(jié)果Tab.1 Morphological parameters of oysters shells from different sampling sites

2.2 不同海區(qū)牡蠣的貝殼密度

不同取樣點(diǎn)牡蠣的貝殼密度測量結(jié)果見表2。對左殼密度與右殼密度進(jìn)行比較分析, 發(fā)現(xiàn)對于大部分取樣點(diǎn)的牡蠣, 左殼與右殼之間的密度差異在統(tǒng)計上是顯著(P<0.05)甚至極顯著(P<0.01)的, 且從均值上反映出左殼密度小于右殼(配對樣本單尾t檢驗(yàn)P<0.001); 僅三個取樣點(diǎn)牡蠣的左右殼密度差異不顯著。牡蠣的左殼一般稍大, 用于固著在巖礁等固形物上, 而右殼朝外。相對于左殼而言, 右殼需要承受更多的海浪沖擊等環(huán)境壓力, 這可能是導(dǎo)致牡蠣左殼密度小于右殼密度的原因。

表2 不同取樣點(diǎn)牡蠣貝殼密度均值Tab.2 Shell density of oysters from different sampling sites

圖3 不同取樣點(diǎn)間牡蠣貝殼密度均值的差異顯著性Fig.3 The significance of difference in density of oyster shells among sampling sites

對于不同取樣點(diǎn)間牡蠣貝殼密度的差異, 我們分別對左殼密度、右殼密度以及貝殼總密度在26個取樣點(diǎn)間共1100只牡蠣進(jìn)行了單因素方差分析, 發(fā)現(xiàn)三者的P值均小于0.001, 即各取樣點(diǎn)間三者的差異都是極顯著的。再對各取樣點(diǎn)間的均值進(jìn)行多重比較, 結(jié)果見圖3。26組樣本間一共進(jìn)行了351組比較,每組又有左殼密度、右殼密度及貝殼總密度3個比較, 即一共比較1053次。其中0.01

雖然牡蠣的左殼密度一般小于右殼, 對于不同海區(qū)間的牡蠣群體, 左殼密度差異、右殼密度差異以及貝殼總密度差異三者相比, 變化趨勢是相似的(圖4)。而地理位置相近的海區(qū)間的牡蠣群體間, 殼密度也有相近趨勢。例如, 取樣點(diǎn)2號、3號及4號密度相近, 7號與8號密度相近, 9號、10號及11號密度相近, 而它們之間的地理位置也相對較近。圖3的差異顯著性分析, 也佐證了兩者間這一聯(lián)系。推測原因?yàn)橄嘟蛴邢嗨频乃疁刈兓?、餌料結(jié)構(gòu), 牡蠣基因的差異也相對較小。

圖4 不同取樣點(diǎn)牡蠣的左殼(a)、右殼(b)及左右殼總和(c)的密度分布箱線圖Fig.4 Box plot of oysters left-shell (a), right-shell (b) and all-shells (c) density in different sampling sites

相對于養(yǎng)殖牡蠣以及潮間帶中下部所取牡蠣,取自潮間帶上部的牡蠣密度相對較大。本研究中, 取樣點(diǎn)2、6、13號及20號的牡蠣取自潮間帶的上部, 相比其他組, 它們的貝殼密度顯著較大。而比較取樣點(diǎn)20、21號及22號的牡蠣, 它們均為葡萄牙牡蠣, 但是在潮間帶上部生長的20號取樣點(diǎn)牡蠣擁有相對較大的貝殼密度。一般認(rèn)為, 處于潮間帶的上部的牡蠣,會經(jīng)受較長時間的海浪沖擊, 暴露在空氣中的時間也相對較長, 這也導(dǎo)致它們所攝食的餌料較少, 且溫度、鹽度等環(huán)境因子的變化在四季之間甚至一日之內(nèi)都非常劇烈。潮間帶上部這種惡劣的生長環(huán)境, 足以導(dǎo)致貝殼生長緩慢, 從而使生物和非生物物質(zhì)在貝殼內(nèi)慢慢累積, 這可能是它們的貝殼密度相對較大的原因。

對于不同取樣點(diǎn)牡蠣的貝殼形態(tài)參數(shù)與貝殼總密度之間相關(guān)系數(shù)的分析結(jié)果見表3。對于大部分取樣點(diǎn)的牡蠣, 貝殼形態(tài)參數(shù)與貝殼總密度之間的相關(guān)性很弱(|R|<0.4); 僅少數(shù)幾個取樣點(diǎn)的牡蠣, 某些形態(tài)參數(shù)與貝殼總密度有顯著相關(guān)(|R|>0.6); 而SMI值在大部分取樣點(diǎn)的牡蠣中與貝殼總密度都相關(guān)性很弱, 說明牡蠣外形長或圓與貝殼密度的大小基本沒有關(guān)系。

表3 不同取樣點(diǎn)牡蠣的貝殼形態(tài)參數(shù)與貝殼總密度相關(guān)系數(shù)Tab.3 The correlation coefficient between shell morphological parameters and density of all oysters shells in different sites

3 討論

3.1 排水稱重法的原理

本研究首次提出了采用排水稱重法測量貝殼的質(zhì)量和體積。在該方法的步驟(2)中用記號筆在鑷子夾物端以上2cm左右處劃一條標(biāo)線, 且后續(xù)步驟中鑷子均伸入液面至此標(biāo)線處, 這樣可以使每次伸入液面下鑷子的體積基本一致, 以盡量消除該部分體積的變化對測量準(zhǔn)確度的影響。而步驟(3)和(4)中均提及鑷子或貝殼必須懸于水中不觸壁, 這是為了不使鑷子或貝殼的重力直接作用于燒杯而影響測量的準(zhǔn)確度。

由于步驟(4)中(圖2b)貝殼沒有觸壁, 故所測得的質(zhì)量m等于液面升高的水的質(zhì)量, 根據(jù)密度公式,該液面升高的水的體積v=ρ×m, 而蒸餾水的密度ρ在常溫下為1.0g/cm3, 故有v=m; 而根據(jù)阿基米德定律,該液面升高的水的體積v即等于所測的貝殼體積V,于是有V=v=m, 故得出m的值等于貝殼體積V的值。

貝殼在步驟(5)中(圖2c)沉入水底, 其重量直接作用于燒杯底部。若將所有燒杯內(nèi)各物體考慮為一個整體系統(tǒng), 與步驟(3)比較, 此時該系統(tǒng)中只增加了貝殼的重量。水作用于貝殼的浮力及貝殼對水的反作用力, 均屬于該系統(tǒng)內(nèi)部的力, 而對于燒杯外的電子天平而言, 只增加了貝殼的重力, 故讀數(shù)M即為貝殼質(zhì)量。

3.2 排水稱重法的優(yōu)勢

牡蠣殼形極不規(guī)則且殼表粗糙, 各種環(huán)境因子比如風(fēng)浪沖擊、其他生物的固著或附著以及固著物的形狀和種類, 都會影響到牡蠣貝殼形狀(王如才等,2008)。傳統(tǒng)的不規(guī)則物體的體積測量方法有排液法、稱重法和排氣法等(遲善武, 1996), 而測量牡蠣貝殼體積一般用排水法和稱重法(許飛等, 2007)。

其中排水法是在量筒中加入蒸餾水并記錄水位刻度, 將貝殼浸沒于水中, 再次讀取水位刻度, 兩個水位刻度差即貝殼體積。該方法中, 誤差主要源于操作者對牡蠣浸沒前后量筒中的水位進(jìn)行讀數(shù)時的人為誤差和由于量筒刻度不夠精細(xì)所帶來的誤差, 這種誤差的絕對值隨量筒的量程增大而增加。由于量筒相對燒杯來說是細(xì)長型容器, 口徑較小, 所以牡蠣的殼尺寸決定了使用量筒的量程, 比如500mL的量筒只能適用于殼長小于4.5cm的牡蠣。又由于量筒的刻度不夠精細(xì), 比如500mL的量筒最小刻度為10mL,而牡蠣貝殼的體積一般小于10cm3, 故貝殼體積測量值只能是估計數(shù), 系統(tǒng)誤差較大。

稱重法是在燒杯中加入蒸餾水至足夠浸沒貝殼,并標(biāo)記水位刻度, 再測出4個數(shù)據(jù): 空燒杯的質(zhì)量(W0)、空燒杯加牡蠣貝殼的質(zhì)量(W1)、空燒杯加水至標(biāo)記水位處后的總質(zhì)量(W2)、以及空燒杯內(nèi)放入牡蠣貝殼, 然后加水至標(biāo)記水位處后的總質(zhì)量(W3)。把4個數(shù)值代入公式計算貝殼體積。這種方法的誤差主要也來源于操作者對燒杯中水位的辨別, 由于燒杯內(nèi)徑較大, 所以標(biāo)定水位時的誤差也較大; 且對于體積較小的牡蠣貝殼, 排水所造成的液面上升不明顯, 測量準(zhǔn)確度低。

相比這兩種方法, 本研究提出的排水稱重法更加簡單、快速而準(zhǔn)確, 其優(yōu)點(diǎn)有: 操作簡單, 一次操作即可以準(zhǔn)確得到牡蠣貝殼的體積, 且無需如稱重法中所述的繁瑣計算步驟; 測量結(jié)果準(zhǔn)確, 該方法中人工標(biāo)定的過程只涉及控制鑷子伸入液面的高度,不易出現(xiàn)大誤差; 適用于所有牡蠣貝殼的測量, 即使對小體積的牡蠣貝殼也能進(jìn)行準(zhǔn)確測量。

雙殼貝類中常用肥滿指數(shù)(也稱條件指數(shù))作為育種的重要指標(biāo), 它是指肉質(zhì)部的肥瘦程度(張福綏等, 1986), 可以用來確定適宜的采收時期、進(jìn)行采苗預(yù)報, 并對其開展增養(yǎng)殖工作具有重要指導(dǎo)意義。而牡蠣一般以軟體部干質(zhì)量與殼腔容積的比值計算肥滿度(Massapinaet al, 1999; Huanget al, 2006)。利用排水稱重法, 可以方便快捷地測量和計算出牡蠣的殼腔容積, 只需測量牡蠣個體體積及其貝殼體積, 兩者相減即為殼腔容積。

3.3 貝殼密度與環(huán)境效應(yīng)關(guān)系

生物與其所處環(huán)境總是相互影響、密不可分的,尤其是對于像蠣這樣營固著生活的物種, 其環(huán)境效應(yīng)更不可忽視。在物理因子方面, 有研究表明牡蠣的生長效率在20°C左右最高(周一兵等, 2000), 在此溫度下所攝入的能量用于生長的部分最高, 而較快的生長速度可能會引起牡蠣在貝殼上的積累減少, 導(dǎo)致貝殼密度相對較小; 另一個影響牡蠣貝殼密度的顯而易見的因素是海浪沖擊, 在受到海浪沖擊較嚴(yán)重的海域, 牡蠣往往需要更堅硬的外殼保護(hù)自己。在化學(xué)因子方面, 海水的pH值是對牡蠣貝殼密度影響較大的因素。海洋酸化所導(dǎo)致最嚴(yán)重的結(jié)果是破壞碳酸鹽在水中的電離平衡, 使海水中的碳酸根離子濃度降低, 引起海洋中碳酸鹽的不斷溶解,這將影響具有碳酸鈣外殼的貝類的生物礦化過程。已有的許多研究表明, 海洋pH值降低對海灣扇貝、文蛤、櫛孔扇貝及馬氏珠母貝等多種貝類的貝殼形成過程有顯著的影響(Talmageet al, 2010; 何盛毅等, 2011;Van Colenet al, 2012)。在生物因子方面, 牡蠣餌料的種類與數(shù)量會影響貝殼的生長; 而牡蠣所處海域如捕食牡蠣、寄生于牡蠣的敵害生物也會影響牡蠣貝殼密度的大小。

不同海區(qū)間牡蠣的貝殼密度的差異以及相同海區(qū)牡蠣的左右殼密度差異, 是牡蠣適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果。一方面, 在全球變暖、海洋酸化等惡劣環(huán)境因子日益加重的背景下, 牡蠣無論是內(nèi)在生理還是外在貝殼都遭受到更加嚴(yán)峻的環(huán)境壓力; 另一方便, 環(huán)境給予牡蠣的選擇壓力, 迫使牡蠣調(diào)整自身, 以適應(yīng)環(huán)境。因此, 不同海區(qū)的牡蠣貝殼密度的差異, 是牡蠣基因?qū)用娴倪z傳特性以及環(huán)境因子如溫度、鹽度以及餌料等綜合作用的結(jié)果, 也是牡蠣適應(yīng)性進(jìn)化的外在表現(xiàn)。

致謝 本研究樣本的采集、解剖和測量等工作量較大, 華中科技大學(xué)王夢娜同學(xué)全程參與了貝殼密度的測量工作, 中國海洋大學(xué)的李琪教授提供了韓國和日本血統(tǒng)的牡蠣樣本, 本實(shí)驗(yàn)室其他同仁參與了牡蠣的解剖, 在此一并感謝。

王如才, 王昭萍, 2008. 海水貝類養(yǎng)殖學(xué). 青島: 中國海洋大學(xué)出版社, 116—140

王海艷, 2004.中國近海常見牡蠣分子系統(tǒng)演化和分類的研究.青島: 中國科學(xué)院海洋研究所博士學(xué)位論文, 39—99

湯銀才, 2008. R語言與統(tǒng)計分析. 北京: 高等教育出版社,226—239

許 飛, 劉 曉, 張國范, 2007. 牡蠣殼腔容積的兩種測量方法比較. 海洋科學(xué), 31(7): 15—19

李彥萍, 楊紅霞, 2003. 非參數(shù)統(tǒng)計中相關(guān)系數(shù)的計算及其應(yīng)用. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 23(4): 363—366

何盛毅, 林傳旭, 何毛賢等, 2011. 海洋酸化對馬氏珠母貝胚胎和早期幼蟲發(fā)育的影響. 生態(tài)學(xué)雜志, 30(4): 747—751

遲善武, 1996. 一種實(shí)現(xiàn)小體積測量的精確方法. 化工自動化及儀表, 23(2): 44—47

張福綏, 何義朝, 劉祥生等, 1986. 膠州灣貽貝肥滿度的研究.中國貝類學(xué)會. 貝類學(xué)論文集. 北京: 科學(xué)出版社, 2:80—88

周一兵, 宋 堅等, 2000. 不同溫度下太平洋牡蠣三倍體和二倍體生物能量學(xué)比較. 水產(chǎn)學(xué)報, 24(6): 504—509

蔡英亞, 張 英, 魏若飛, 1995. 貝類學(xué)概論(第二版). 上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社, 28—31

薛 亮, 張龍軍, 2011. 北黃海夏季pCO2分布及海-氣CO2通量. 中國海洋大學(xué)學(xué)報, 41(12): 22—29

薛 毅, 陳立萍, 2006. 統(tǒng)計建模與R軟件. 北京: 清華大學(xué)出版社, 144—151

Berman A, Hanson J, Leiserowitz Let al, 1993. Biological control of crystal texture: a widespread strategy for adapting crystal properties to function. Science, 259(5096): 776—779

Hoyaux J, Gilles R, Jeuniaux Cet al, 1976. Osmoregulation in molluscs of the intertidal zone. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology, 53(4): 361—365

Huang S C, Hsieh H L, Chen C P, 2006. Effects of the winter Monsoon on the growth, mortality, and metabolism of adult oysters in Kinmen Island, Taiwan. Aquaculture, 251(2—4):256—270

Massapina C, Joaquim S, Matias Det al, 1999. Oocyte and embryo quality inCrassostrea gigas(Portuguese strain)during a spawning period in Algarve, South Portugal.Aquatic Living Resources, 12 (5): 327—333

Song X R, Wang X T, Li Let al, 2014. Identification two novel nacrein-like proteins involved in the shell formation of the Pacific oysterCrassostrea gigas. Molecular Biology Reports,41(7): 4273—4278

Talmage S C, Gobler C J, 2010. Effects of past, present, and future ocean carbon dioxide concentrations on the growth and survival of larval shellfish. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America,107(40): 17246—17251

Van Colen C, Debusschere E, Braeckman Uet al, 2012. The early life history of the clamMacoma balthicain a high CO2world. PLoS One, 7(9): e44655

Wang X, Song X, Wang Tet al, 2013. Evolution and functional analysis of the Pif97 gene of the Pacific oysterCrassostrea gigas. Current Zoology, 59(1): 109—115

Zhang G, Fang X, Guo Xet al, 2012. The oyster genome reveals stress adaptation and complexity of shell formation. Nature,490(7418): 49—54