再生障礙性貧血實驗及中醫(yī)藥治療機制研究進展

張豐豐，張新雪，田 晨 綜述 趙宗江 審校

再生障礙性貧血實驗及中醫(yī)藥治療機制研究進展

張豐豐，張新雪，田 晨 綜述 趙宗江 審校

再生障礙性貧血；發(fā)病機制；動物模型

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)是一種由于化學、物理、生物因素及不明原因引起的全血細胞減少及骨髓造血功能衰竭的綜合病征。AA機制研究一直是研究工作的重點。隨著現(xiàn)代科研技術(shù)研究水平的不斷提高，AA的機制研究逐漸深入到分子生物學水平。AA機制的研究離不開動物模型，近年來，為了建立理想的動物模型，很多學者進行了多方面探索。中醫(yī)藥在AA的治療上有一定的優(yōu)勢，也取得了一定的進展。

1 免疫發(fā)病機制

AA的發(fā)病機制研究主要集中在造血干細胞損傷、免疫功能異常、造血微環(huán)境損傷3個方面，即種子學說、蟲子學說、土壤學說。其中，免疫功能異常是AA發(fā)病機制的主要環(huán)節(jié)。研究認為，免疫異常在再生障礙性貧血發(fā)病機制中起到了非常關鍵的作用[1]，近幾年的研究結(jié)果也進一步證實了這一點。

1.1 細胞免疫異常

1.1.1 T淋巴細胞亞群表型和活化狀態(tài)異常 研究認為獲得性AA是一種免疫因素介導的疾病[2]。研究發(fā)現(xiàn)AA患者活化的細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)增多，這類細胞具有T細胞活化標志，如：HLA-DR、CD8、δTCSI、γδTCR、GB-7、TIA-1等。AA淋巴細胞中細胞毒顆粒蛋白TIA-1增加，且其表達與AA細胞凋亡有關，說明AA淋巴細胞具有細胞毒性質(zhì)[3]。已有學者從AA患者骨髓淋巴細胞中分離出了對自體和異體造血干細胞(hematopoietic stem cell, HSC)都具細胞毒作用的淋巴細胞株。這些結(jié)果提示異?；罨牧馨图毎赡芘cAA患者骨髓衰竭密切相關。

1.1.2 T淋巴細胞亞群數(shù)量及其分布變化 AA患者T細胞數(shù)量相對增多，CD4/CD8，Th1/Th2，Tc1/Tc2比例失調(diào)，且活化的效應細胞相對增多[4]。早期研究發(fā)現(xiàn)骨髓殘余造血組織中CD3+T淋巴細胞明顯增多，且這些細胞處于活化狀態(tài)；另有研究發(fā)現(xiàn)AA患者CD8+T細胞比例明顯增高。

1.2 細胞因子負調(diào)控作用 AA患者存在相關細胞因子表達增高，例如：干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等。研究表明，AA患者血液和骨髓液中IFN-γ和TNF-α增加，淋巴細胞胞漿IFN-γ和TNF-α表達率也高于正常者，說明細胞因子在AA發(fā)病中起著重要作用[5]。Th3細胞可分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)發(fā)揮免疫負調(diào)節(jié)作用，CD4+CD25+T細胞可抑制自身反應性淋巴細胞活化增殖。而SAA患者體內(nèi)Th3細胞和CD4+CD25+T細胞都減少，并隨病情減輕而增加，說明兩者與免疫耐受的打破有關[6]。有些學者通過對免疫抑制治療前后AA患者CD3+T細胞內(nèi)的TNF-α比較發(fā)現(xiàn)，治療有效者TNF-α水平下降；AA患者血液、骨髓液、淋巴細胞胞質(zhì)中IFN-γ也都高于正常者，并且在免疫抑制治療前后有明顯變化，其IFN-γ受體基因在CD34+細胞中也表達上調(diào)[7,8]。此外，IFN-γ可上調(diào)mIL-15在AA患者成纖維樣基質(zhì)細胞(BMFSCs)表達，高表達的mIL-15通過細胞間近距離作用使T細胞增殖，引起造血細胞損傷[9]。

1.3 轉(zhuǎn)錄因子表達異常

1.3.1 Th1、Th2細胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3表達異常 轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3是特異性調(diào)控Th0細胞分化、起著Thl/Th2細胞轉(zhuǎn)換開關作用的關鍵因子。T-bet在mDCs分泌的IL-12作用下，通過信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子Ⅰ(STATⅠ)途徑促進Th0向Thl極化，使后者分泌IFN-γ、TNF-α等Ⅰ型淋巴因子，介導細胞免疫；在IL-4作用下，Th0細胞通過信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子6(STAT6)途徑促進GATA-3高表達，使Th0向Th2極化，后者分泌IL-4、IL-5、IL-13等Ⅱ型淋巴因子，介導體液免疫應答[10,11]。AA患者外周血淋巴細胞胞漿內(nèi)T-bet蛋白水平升高，免疫功能向Thl偏移。沈紅石等[12]發(fā)現(xiàn)T-bet與GATA-3異常表達可增強Th1細胞功能，抑制Th2細胞功能，導致患者免疫功能異常，最終引起AA發(fā)生、發(fā)展。

1.3.2 T細胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達減少 Foxp3是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞發(fā)育和功能維持的關鍵性調(diào)節(jié)基因，其特異性地表達于CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞。孟麗娟等[13]采用RT-PCR方法檢測AA小鼠外周血單個核細胞Foxp3 mRNA的表達，用免疫組織化學方法檢測AA小鼠脾組織Foxp3蛋白水平的表達，結(jié)果提示Foxp3的表達降低可能參與AA的免疫發(fā)病機制。

1.3.3 NF-κB蛋白表達異常 NF-κB作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，在CD34+細胞信號傳導、基因表達和轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮非常重要的作用。羅梅宏等[14]采用Q-PCR、免疫組織化學等方法檢測小鼠骨髓單個核細胞NF-κB mRNA、蛋白表達及活性變化，認為NF-κB蛋白表達異常及活性改變在AA的發(fā)病機制中具有一定意義，但具體作用機制還有待進一步研究。

2 AA實驗動物模型

目前，AA動物模型的造模方法種類較多，主要有物理方法、化學方法、物理化學方法、免疫介導方法等[15]。物理方法中，60Co-γ射線可引起DNA損傷，干擾DNA復制，阻斷有絲分裂，抑制細胞增殖?；瘜W方法中，用于AA造模的藥物通常有環(huán)磷酰胺、馬利蘭、苯劑等，乙酰苯肼為一種緩慢性氧化藥物，可導致紅細胞膜損傷，從而減少外周紅細胞數(shù)量；氯霉素骨髓抑制被認為主要作用于造血微環(huán)境或造血干細胞。AA發(fā)生的過程就是造血細胞不斷增殖分化的過程中，如阻斷其中任一過程均可導致造血調(diào)控的功能異常[16]。

2.1 化學藥物造模法 任行洲等[17]選用CD1雄性小鼠，按給苯劑量不同分為4組：B1組(0.5 ml/kg)、B2組(1.0 ml/kg)、B3組(1.5 ml/kg)、B4組(2.0 ml/kg)，血象檢測、組織病理學檢查顯示：只有B4組(2 ml/kg)接觸苯25次后模型建立成功。趙厚德等[18]使用SD大鼠作為模型鼠，腹腔注射環(huán)磷酞胺(300 ml/kg)連續(xù)5 d，給藥3 d外周血白細胞總數(shù)明顯下降，5 d降至最低值，且維持時間較長；停藥后15 d白細胞仍維持在最低值水平。苑曉磊等[19]選用昆明種雄性小鼠50只，模型組動物按2.0 ml/kg皮下注射苯油混合液，1次/d，隔日給藥；再以環(huán)磷酰胺溶液(50 mg/kg)腹腔注射，1次/ d,共7次。結(jié)果顯示，利用苯與環(huán)磷酰胺聯(lián)合誘導小鼠造血功能障礙結(jié)果穩(wěn)定，發(fā)生率高，各項指標與人的再生障礙性貧血相似。肖純等[20]選用昆明種雄性小鼠，給予皮下注射環(huán)磷酰胺(50 mg/kg，隔天1次，共4次)及甲苯吸入染毒(濃度30 mg/L，每次2 h，共8 d)，10 d后小鼠全血細胞、網(wǎng)織紅細胞、骨髓造血細胞均減少，非造血細胞成分增多，脾萎縮及出血、感染等表現(xiàn)，與人的AA表現(xiàn)相似。黃崇剛等[21]采用Wistar大鼠雌雄兼用，給予氟尿嘧啶100 mg/kg腹腔注射，5 d后給予馬利蘭10 mg/kg, 口服1次，2周后，再給予1次馬利蘭10 mg/kg，大鼠的外周血紅細胞、血紅蛋白和白細胞以及骨髓有核細胞記數(shù)和造血組織容量顯著減少，大量脂肪細胞代替造血細胞，造血細胞減少，骨髓增生極度低下，與AA患者特征有相似點。陳志偉等[22]采用BALB/c小鼠，通過正常組(生理鹽水0.2 ml/只)、單純照射組(高劑量組6 Gy，中劑量組4 Gy，低劑量組2 Gy)、單純注射環(huán)磷酰胺組(高劑量組150 mg/kg，中劑量組100 mg/kg，低劑量組50 mg/kg)、照射加環(huán)磷酰胺注射組(4 Gy+25 mg/kg，2 Gy+50 mg/kg)和照射加環(huán)磷酰胺加氯霉素注射組(2 Gy+50 mg/kg+30 mg/kg)等復合造模比較骨髓造血情況。根據(jù)死亡率和全血細胞數(shù)分析，認為復合造模照射加環(huán)磷酰胺注射是一種AA小鼠的理想模型。

2.2γ射線造模法 孫巍巍等[23]采用Wistar大鼠用60Co-γ射線8.0 Gy全身一次性照射造成AA模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠的外周血紅細胞、血紅蛋白和白細胞明顯減少，骨髓切片示造血細胞數(shù)減少，脂肪細胞增多。劉寶山等[24]選用近交系ICR雌雄各半小鼠，經(jīng)60Co-γ射線(3 Gy，劑量率0.6，照射時間5 min，距離4 m)全身照射后，于第4、5、6天腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg和氯霉素62.5 mg/kg，以外周血象、骨髓象驗證成模。陳慧莉[25]選用Wistar大鼠，雌雄各半，200 g/只，大鼠一次性全身亞致死量均勻照射(直線加速器X線，13 Gy)，照射后第4、5、6天腹腔注射環(huán)磷酰胺35 mg/kg及氯霉素43.75 mg/kg，通過外周血象及骨髓象的檢測證明造模成功。張海斌等[26]用SD大鼠，以直線加速器照射(劑量率300 cGy/min，SSD=100 cm，照射時間1.2 min)，隨后于第3 、5 、7天分別給予腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺50.0 mg/kg和氯霉素62.5 mg/kg，實驗第8天檢測實驗室指標判斷動物模型成功。結(jié)論：射線照射結(jié)合化療的方法能在較短時間內(nèi)方便地制作出符合臨床特征的AA動物模型，是建立教學用AA動物模型的理想方法。

2.3 免疫介導造模法 Chen等[27]發(fā)現(xiàn)，對正常小鼠輸注被激活的淋巴細胞能夠破壞造血和基質(zhì)細胞而誘導骨髓抑制模型。趙忻等[28]選用近交系BALB/c小鼠，DBA/2小鼠，采用不同劑量的60Co-γ射線對BALB/c小鼠進行全身照射，并輸入DBA/2小鼠的胸腺、淋巴結(jié)混合細胞，于照射并輸入細胞后第14天處死實驗小鼠觀察股骨骨髓增生程度及病理改變。結(jié)果：6.0 Gy、5.5 Gy和5.0 Gy各照射劑量AA誘導組的AA發(fā)生率分別為85.7%、84.6%和22.2%。丁敬遠等[29]選用Balb/c小鼠，5.5 Gy60Co-γ射線照射后4 h，由尾靜脈輸人取自DBA/2小鼠胸腺淋巴混合細胞懸液，實驗室檢查證實模型建立成功。李愛民等[30]選用近交系Balb/c小鼠、DBA/2小鼠，取Balb/c小鼠10只，6.0 Gy60Co-γ射線全身照射，4 h內(nèi)由尾靜脈輸入DBA/2小鼠的胸腺、淋巴結(jié)混合細胞懸液0.2 ml，細胞數(shù)為1×106個，制模后即腹腔注射生理鹽水0.4 ml/只，連續(xù)9 d，造模成功。孟麗娟等[31]選用DBA/2雄性小鼠，作為細胞供體，BALB/c小鼠，雌雄各半，隨機取BALB/c小鼠20只雌雄各10只，經(jīng)60Co-γ5.5 Gy射線全身均勻照射后，4 h內(nèi)由尾靜脈輸入取自DBA/2小鼠胸腺淋巴細胞混懸液，輸細胞量為每只約含1×106個淋巴細胞，參照各項實驗室指標證明造模成功。

3 中醫(yī)藥的作用環(huán)節(jié)

3.1 調(diào)節(jié)細胞免疫功能 倪海雯[32]選用近交系BALB/c(H2 d，MLsb)、DBA/2(H2 d，MLsa)2種品系小鼠，建立免疫介導再生障礙性小鼠模型，設立正常組、模型對照組、血復生用藥組、環(huán)孢菌素對照組、血復生加環(huán)孢菌素組，采用流式細胞術(shù)檢測其T細胞表面CD28及CTLA4表達，結(jié)果顯示,AA模型組CD28的表達高于正常組，血復生及環(huán)孢菌素單獨用藥可下調(diào)CD28的表達，兩者聯(lián)合使用有增效作用，說明CD28的表達增加參與了AA的免疫功能異常。觀察發(fā)現(xiàn)，AA組小鼠腸壁色澤較暗，腸腔或變細，或變遷曲擴張，腸腔病理切片后顯示AA模型組腸壁細胞排列紊亂，這些病理改變可為中醫(yī)的脾胃虛弱、脾運失健、氣血虧虛、腸府失濡提供客觀依據(jù)，說明在AA發(fā)病中存在脾虛失運。

3.2 調(diào)控細胞因子

3.2.1 正調(diào)控因子 劉寶山等[24]采用60Co-γ射線造模法建立AA小鼠模型，模型組予補腎化痰活血中藥喂養(yǎng)。結(jié)果顯示,模型組骨髓CD34+細胞抗原檢測結(jié)果、骨髓造血生長因子SCF、GM-CSF mRNA表達水平均低于正常對照組，經(jīng)治療后各組小鼠骨髓CD34+細胞抗原水平、骨髓造血生長因子表達水平均明顯提高。說明補腎化痰活血方可能通過增強AA小鼠骨髓造血生長因子GM-CSF、SCF mRNA表達水平，刺激造血細胞分化成熟，達到調(diào)控骨髓造血的目的。丁敬遠等[33]用溫腎方、滋腎方灌喂DBA/2大鼠，抽取、制備含中藥血清，用Ba1b/C小鼠采用60Co-γ射線造模法建立免疫介導AA模型。結(jié)果表明，滋腎方對IL-3的生成有影響，溫腎方、滋腎方對培養(yǎng)體系中IFN-γ的生成均無影響。由實驗結(jié)果推測，補腎方藥治療AA的確切療效是通過影響造血促進因子IL-3總量生成，造血抑制因子IFN-γ局部濃度改變而進一步作用于造血干細胞，促使其正常增殖、分化而達到治療目的。

3.2.2 負調(diào)控因子 鄭瑾等[34]選用BALB/c及DBA-2小鼠，復制免疫介導的AA小鼠模型，胃飼中藥復方，結(jié)果顯示中藥組骨髓增生好轉(zhuǎn)，骨髓微環(huán)境損傷減輕，血清IL-2、IFN-γ水平較AA模型組減低。說明化瘀補腎湯能促進AA小鼠骨髓微環(huán)境的修復，減少造血負調(diào)控因子的釋放，從而促進造血功能恢復。陳育等[35]選用SD大鼠建立白消安誘發(fā)造血功能障礙大鼠模型，胃飼補腎調(diào)肝化瘀中藥，觀察血清TNF-α、IL-1β水平的變化。結(jié)果顯示模型組TNF-α顯著高于正常對照組，IL-1β低于正常對照組，而補腎調(diào)肝化瘀中藥治療組TNF-α顯著低于模型組，IL-1β顯著高于模型組。說明補腎調(diào)肝化瘀中藥可通過改善造血系統(tǒng)細胞因子分泌異常，減輕免疫因素對機體的損害，促進骨髓造血功能的恢復。

3.3 改善造血微環(huán)境 孫忠亮[36]將78例AA患者隨機分為兩組，均用司坦唑醇聯(lián)合環(huán)孢素A作為基礎治療藥物，一組加用川芎嗪注射液治療，定期測定血象、骨髓象、骨髓病理(微血管情況)，觀察臨床表現(xiàn)，進行成纖維細胞的培養(yǎng)并進行比較。結(jié)果顯示，川芎嗪組與基礎治療組相比外周血網(wǎng)織紅細胞、中性粒細胞、血小板、血紅蛋白骨髓造血細胞比例均明顯升高；骨髓微血管的數(shù)量、造血組織容量(%)及成纖維細胞集落，較治療前及基礎治療組有明顯增多。說明川芎嗪對AA患者骨髓微環(huán)境具有改善作用。

3.4 抑制細胞凋亡 有研究發(fā)現(xiàn)，慢性AA發(fā)病與CD34+細胞凋亡增多密切相關，而凋亡抑制基因bcl-2在CD34+細胞凋亡調(diào)控過程中具有重要作用，可抑制細胞凋亡。有學者采用DNA末端原位標記(TUNEL)技術(shù)，檢測用愈障湯治療的39例慢性AA患者骨髓CD34+細胞凋亡狀況，研究結(jié)果表明，愈障湯使慢性AA患者骨髓CD34+細胞的凋亡率減少[37]。陳慧莉[25]采用全身照射加腹腔注射藥物法建立大鼠AA模型，中藥組予愈障湯治療。治療組外周血象及骨髓細胞線粒體病理變化明顯好于模型對照組。說明愈障湯具有升高AA大鼠外周血各項指標，保護、修復骨髓造血細胞損傷，并促進細胞分化、增殖作用。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，隨著現(xiàn)代科研技術(shù)水平的不斷提高，再生障礙性貧血機制研究不斷深入，但其發(fā)病機制越來越集中在造血干細胞損傷，免疫功能異常，造血正調(diào)控因子降低，負調(diào)控因子升高等方面。AA動物模型的造模方法種類較多，但存在造模時間長，造模方法復雜，模型不穩(wěn)定，持續(xù)周期短等缺點，如何建造更簡單、穩(wěn)定的AA模型仍是研究者們探索的重點。參考現(xiàn)有文獻，筆者認為，通過化學方法之間或者化學方法與物理方法聯(lián)合的方式可以成功誘導AA大鼠模型，通過聯(lián)合誘導的方法制備AA實驗模型，具有耗時短，方法簡便，易于掌握，重復性好的特點，短期內(nèi)可誘導出大量模型，且能模擬人類AA表現(xiàn)出的相似病理生理過程，使得研究者能夠動態(tài)觀察病情發(fā)展，深入了解發(fā)病機制。AA動物模型的建立更是為相關治療藥物的研發(fā)和新的治療方法的研究提供了平臺。

多年中醫(yī)藥研究工作表明，中醫(yī)藥在AA治療中發(fā)揮了巨大的作用，它可能通過調(diào)控AA免疫系統(tǒng)T細胞的功能，延緩淋巴細胞減少，起到明顯的AA血液系統(tǒng)調(diào)節(jié)及延緩病程進展的作用。臨床及實驗研究找到了一些中醫(yī)藥治療AA、調(diào)節(jié)免疫功能的客觀依據(jù)，但還存在很多不足之處，AA中醫(yī)證型與免疫學客觀指標的研究還缺乏系統(tǒng)性。因此，如何利用免疫學、遺傳學新技術(shù)并與中醫(yī)辨證相結(jié)合，深入研究中醫(yī)藥治療AA、調(diào)節(jié)免疫的物質(zhì)基礎、作用機制，并尋找其與AA中醫(yī)證型的關系，將成為中醫(yī)藥研究者面臨的新課題。

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(2014-01-12收稿 2014-05-20修回)

(責任編輯 郭 青)

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