間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝樣細(xì)胞的研究進(jìn)展

黃一鳳，王 甦

揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬蘇北人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 揚(yáng)州225000

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，它們可以不斷地自我更新，并在特定條件下在體內(nèi)外轉(zhuǎn)變?yōu)楦螛蛹?xì)胞，在肝臟疾病的治療中越來越受重視。

1 分化為肝樣細(xì)胞的各種MSCs 的來源

Shu 等［1］從體外培養(yǎng)的小鼠骨髓中分離出MSCs和肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)，這兩種細(xì)胞都有分化為肝細(xì)胞的能力，但只有MSCs 能分化為肝樣細(xì)胞。目前，MSCs 主要來源于骨髓，骨髓源性MSCs易被病毒污染，其細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞增殖分化能力隨著年齡增長而下降;與BM-MSCs 相比，UC-MSCs 增殖能力更強(qiáng)［2］，免疫原性更低，且分化出的肝樣細(xì)胞仍保持低免疫原性。UC-MSCs 干細(xì)胞來源廣泛，不會產(chǎn)生異體排斥，沒有道德倫理的限制，因而成為干細(xì)胞領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。脂肪MSCs 也可分化為肝樣細(xì)胞，其分泌的G-CSF、IL-6、HGF 等細(xì)胞因子在肝衰竭的治療中發(fā)揮了重要作用。另外，MSCs 可從軟骨、臍血、胎盤組織、皮膚和骨骼肌的結(jié)締組織中、臍靜脈內(nèi)皮下層、成人膝關(guān)節(jié)滑膜、成人腮腺中［3］等處分離而來。胚胎干細(xì)胞、肝來源的干細(xì)胞及骨髓來源的肝干細(xì)胞在一定條件下均可分化為肝樣細(xì)胞。

2 MSCs 在體外分化為肝樣細(xì)胞

MSCs 分化為肝樣細(xì)胞的分子機(jī)制非常復(fù)雜，單純適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基不能誘導(dǎo)分化出特定的細(xì)胞類型，還需與生長因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)等細(xì)胞微環(huán)境共同培養(yǎng)。

2.1 細(xì)胞角蛋白(CK)、激素及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)

許多CK 對體外肝細(xì)胞的生長和分化有影響，包括肝細(xì)胞生長因子(HGF)、抑瘤素M(OSM)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、b 成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、胰島素、胰島素樣生長因子(IGF)、白血病抑制因子(LIF)等。另外，化合物如地塞米松(Dex)、維甲酸、丁酸鈉、尼克酰胺(NTA)、NA 和二甲亞砜等在肝細(xì)胞分化上也起作用。HGF 和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)在胚胎發(fā)育過程中的胚層起作用。OSM 在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化方面起著重要作用。Dong 等［4］通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)FGF-4、HGF 及OSM 在BMMSCs 分化為肝樣細(xì)胞中起著重要作用，且三者在BMMSCs 肝分化過程中起著不同作用:BM-MSCs 肝分化的早期階段由FGF-4 及HGF 協(xié)同作用，后期肝分化過程中OSM 起著至關(guān)重要作用。LIF 及IGF-1 均促進(jìn)了BM-MSCs 向肝細(xì)胞分化;化合物如胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉(ITS)、NTA 和地塞米松都有相關(guān)報(bào)道表明它們對肝細(xì)胞分化起作用。Chivu 等［5］通過單獨(dú)或組合的方式比較了各種肝臟特定因子(HGF、ITS、Dex和NTA)的分化效率，發(fā)現(xiàn)HGF 和NTA 有較大的肝源潛能。ECM 能為細(xì)胞提供很好的附著層，為細(xì)胞生長、分化提供很好的微環(huán)境，有助于肝細(xì)胞形態(tài)和功能的成熟。

2.2 共培養(yǎng) 肝細(xì)胞、非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞及一些細(xì)胞因子在肝源分化中有重要作用。在體外將MSCs 與肝細(xì)胞共培養(yǎng)可以誘導(dǎo)MSCs 分化為肝樣細(xì)胞。Zhang 等［6］將GFP 轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSCs 與鼠肝細(xì)胞共培養(yǎng)，共培養(yǎng)的MSCs 不僅呈典型的肝細(xì)胞形態(tài)，還大量表達(dá)肝細(xì)胞特異性標(biāo)記ALB、AFP 和CK-18。與HGF 共培養(yǎng)的MSCs 相比，前者在誘導(dǎo)肝細(xì)胞分化上效率更高。將鼠MSCs 與胎肝細(xì)胞共培養(yǎng)，這樣一個共培養(yǎng)體系不僅為鼠MSCs 分化為肝樣細(xì)胞提供了有力的環(huán)境，而且促進(jìn)了胎肝細(xì)胞的分化和增殖。非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞與MSCs共培養(yǎng)有相似的影響。Yamazaki 等［7］將小鼠GFP 轉(zhuǎn)基因MSCs 與非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞和肝衰竭患者血清共培養(yǎng)，他們發(fā)現(xiàn)鼠MSCs 能轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞。BM-MSCs與不同活化階段的HSC 共培養(yǎng)，只有完全活化且不是靜止的HSC 可以調(diào)節(jié)MSCs 分化為肝樣細(xì)胞。此外，肝臟本身可以被認(rèn)為是MSCs 分化為肝細(xì)胞的理想場所，但是，這個機(jī)制還未完全闡明。

2.3 三維培養(yǎng) 許多研究顯示不同的細(xì)胞類型，包括肝臟起源或非肝臟起源的間質(zhì)細(xì)胞與肝細(xì)胞的3-D 共培養(yǎng)提高了體外肝細(xì)胞的活力和功能。3-D 模式可以提高膜極性和保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，維持功能特性和抑制標(biāo)記物的去分化。有關(guān)MSCs 分化為肝樣細(xì)胞的3-D 培養(yǎng)的相關(guān)研究很少。Piryaei 等［8］通過實(shí)驗(yàn)證明有納米纖維培養(yǎng)環(huán)境促進(jìn)了MSCs 向肝細(xì)胞分化，并可以在長時間內(nèi)使細(xì)胞保持其功能，這可能與納米纖維增強(qiáng)了能誘導(dǎo)分化的生長因子和細(xì)胞因子生物活性有關(guān)。Lin 等［9］使用三維藻酸鹽體系培養(yǎng)BM-MSCs，發(fā)現(xiàn)這個三維體系能更好的誘導(dǎo)BM-MSCs 分化為肝樣細(xì)胞。

2.4 轉(zhuǎn)錄因子 雖然肝源性分化的確切機(jī)制還未完全闡明，一些轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)用于誘導(dǎo)MSCs 轉(zhuǎn)分化為肝樣細(xì)胞。研究稱HNF3β 是老鼠胚胎形成時期肝臟生長的一個關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因子，同時對肝臟形成起著重要作用。Ishii 等［10］發(fā)現(xiàn)HNF3β 能有效地誘導(dǎo)UE7T-13 人BM-MSCs 分化。HNF-4α 過表達(dá)也可以促進(jìn)BM-MSCs 向肝樣細(xì)胞的分化。

3 MSCs 在體內(nèi)分化為肝細(xì)胞

MSCs 在體外能誘導(dǎo)分化為肝樣細(xì)胞研究得到證實(shí)，但是MSCs 在體內(nèi)的分化特性還需進(jìn)一步研究。

Petersen 等［11］及Arikura 等［12］的 實(shí) 驗(yàn) 均 證 明MSCs 能在小鼠體內(nèi)分化為肝前體細(xì)胞甚至成熟的肝樣細(xì)胞。Hwang 等［13］將BM-MSCs 植入肝硬化大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)BM-MSCs 歸巢至肝實(shí)質(zhì)后，先分化為肝卵圓細(xì)胞，隨后分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，并證實(shí)BM-MSCs 分化來的肝前體細(xì)胞減輕肝纖維化。

4 MSCs 分化的肝樣細(xì)胞的特性

MSCs 分化的肝樣細(xì)胞的特性包括形態(tài)學(xué)的、表型的和功能性的特點(diǎn)。形態(tài)上，我們可以看到從成纖維細(xì)胞樣到上皮細(xì)胞典型多邊形的變化;表型上，我們可以發(fā)現(xiàn)體外分化的臍帶MSCs 可貯存糖原，產(chǎn)生尿素氮，誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450(CYP)3A4 活性等幾種肝細(xì)胞標(biāo)記，但也缺乏一些肝細(xì)胞標(biāo)記(HepPar1 或HNF-4α)。在MSCs 分化為肝細(xì)胞早期，這些細(xì)胞表達(dá)RNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物如巢蛋白(干細(xì)胞特有標(biāo)記物)、CX43(肝干細(xì)胞特有的縫隙連接蛋白)、CK19(上皮細(xì)胞標(biāo)記)和一些早期肝細(xì)胞分化標(biāo)記物(如AFP、CK7、HNF3β、GATA4、HNF4、HNF1α 和C/EBPα)［14］。相比之下，在MSC 分化的后期，它們表達(dá)的細(xì)胞標(biāo)記物和蛋白與成熟肝細(xì)胞表達(dá)的相似，如CK18、FoxM1、E-鈣黏著蛋白和連接蛋白32(CX32);分泌血漿蛋白如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原和細(xì)胞間黏附分子;分化良好的肝細(xì)胞產(chǎn)生典型的酶，包括藥物代謝酶細(xì)胞色素P450 亞型3A4 和1A1、糖異生途徑磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1、參與尿素合成的酶氨甲酰磷酸合成酶(CPS)、胞膜蛋白水解酶二肽基肽酶Ⅳ型(CD26)［15］。人肝樣細(xì)胞也表達(dá)人肝細(xì)胞明確的標(biāo)記物Heppar1。同時，分化的肝細(xì)胞漸漸失去間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的標(biāo)記物如α-SMA。

體內(nèi)肝細(xì)胞分化系統(tǒng)與體外肝細(xì)胞分化系統(tǒng)相比，體內(nèi)表型特征更復(fù)雜。肝臟損傷類型的不同，干細(xì)胞就會顯示不同的表型。在一個膽管梗阻引起的膽源性肝硬化模型中，灌注的細(xì)胞呈現(xiàn)一個活化的成纖維細(xì)胞樣或肌成纖維細(xì)胞樣表型，表達(dá)成纖維細(xì)胞特定蛋白和α-SMA。然而，用酒精處理引起的肝硬化，灌注的骨髓細(xì)胞呈現(xiàn)一個活化的肝血管內(nèi)皮細(xì)胞樣表型［16］。

5 MSCs 分化為肝樣細(xì)胞的機(jī)制

MSCs 轉(zhuǎn)分化為肝樣細(xì)胞的詳細(xì)機(jī)制仍然不清楚。橫向分化可能是其中的一個機(jī)制。在MSCs 分化為肝樣細(xì)胞中發(fā)生了間質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)化(MET)，MET 是上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的相反過程，EMT 是腫瘤進(jìn)展和胚胎形成的關(guān)鍵步驟。Ochiya 等［17］發(fā)現(xiàn)EMT 調(diào)節(jié)子Twist 和Snail 表達(dá)水平在分化過程中表達(dá)下調(diào);同時，上皮標(biāo)記物如E-粘黏蛋白和α-連環(huán)蛋白在AT-MSCHepa 過程中表達(dá)上調(diào);相反，間質(zhì)標(biāo)記物如N-粘黏蛋白和波形蛋白表達(dá)下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)提示MET 出現(xiàn)在AT-MSCs 分化為肝細(xì)胞的過程中［18］。

Wnt 信號通路及Notch/Jagged 信號通路參與了MSCs 向肝樣細(xì)胞分化過程，阻滯Wnt 信號通路促進(jìn)了分化過程。表觀遺傳修飾如DNA 甲基化和組蛋白乙?；瑯右矊SCs 分化起作用。研究表明DNMTis 功能是作為肝細(xì)胞分化前預(yù)處理代理，而HDACis 是作為在分化中或分化后的興奮劑［19］。Snykers等［20］發(fā)現(xiàn)在經(jīng)肝源性刺激物預(yù)處理的人MSCs 加入曲古抑菌素A 培養(yǎng)6 d 后轉(zhuǎn)化成與原始肝細(xì)胞有相似表型和功能特性的細(xì)胞。植入MSCs 與宿主細(xì)胞融合也有可能是MSC 分化為肝樣細(xì)胞的一個機(jī)制，但細(xì)胞融合機(jī)制促使MSCs 分化的依據(jù)不足。

6 MSCs 分化的肝樣細(xì)胞的臨床應(yīng)用

陳楠等［21］發(fā)現(xiàn)MSCs 對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肝炎小鼠具有治療作用，可以在短時間內(nèi)降低小鼠血清ALT 水平，緩解肝臟炎性細(xì)胞的浸潤。研究顯示，骨髓源性肝細(xì)胞的形成和長期定植在急、慢性肝臟損傷均可發(fā)生，但是慢性肝損傷更利于這一現(xiàn)象的持續(xù)存在。Terai 等［22］采用自體骨髓MSCs 移植治療肝硬化患者，移植后患者肝功能和MELD 評分顯著提高，提示肝纖維化或肝硬化所致的慢性嚴(yán)重肝損傷也可采取MSCs移植方法達(dá)到治療目的。Peng 等［23］對乙肝肝衰竭患者進(jìn)行自體BM-MSCs 移植，移植組2 ～3 周內(nèi)MELD評分、TBIL、PT 及ALB 得到明顯改善，隨訪至192 周，患者肝癌患病率或死亡率與內(nèi)科治療相比無明顯差異，可見自體BM-MSCs 移植對治療乙肝肝衰竭患者短期療效較好，但長期療效有待進(jìn)一步觀察。此外，目前已見應(yīng)用MSCs 成功治療遺傳代謝性肝病，包括Crigler-Najjar 綜合征［24］，但目前僅限于動物模型研究階段，尚無MSCs 應(yīng)用于臨床的文獻(xiàn)。鄧長卿等［25］已進(jìn)行了UMSCs 治療肝衰竭、肝硬化和自身免疫性肝病的臨床研究，初步取得較滿意的臨床療效。但是UMSCs移植后短期療效顯著，長期療效稍差，需要反復(fù)移植。

7 安全性

體細(xì)胞起源的MSCs 通常被認(rèn)為有優(yōu)越性，分化的MSCs 比未分化的MSCs 似乎更穩(wěn)定和安全，因?yàn)樗鼈兊淖V系是轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞。未分化的MSCs 有仿制腫瘤細(xì)胞并自我更新的能力。Serakinci 等［26］將端粒酶基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入MSC 中，觀察到MSC 顯示了很高的腫瘤特異性。Rubio 等［27］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，體外實(shí)驗(yàn)中MSCs 在6 ～8 周內(nèi)可以安全有效表達(dá)，但是從長期來看有可能會發(fā)生自發(fā)性的突變(4 ～5 個月)。

純化的T 細(xì)胞對同種異體MSCs 不會產(chǎn)生免疫應(yīng)答。但最近一項(xiàng)動物研究表明同種異體和異種的MSCs 注入免疫功能正常的主體后能引起記憶性T 細(xì)胞反應(yīng)。同種異體MSCs 容易被CD8+T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞溶解，會引起淋巴細(xì)胞浸潤和炎癥，且易于發(fā)生NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解。脂肪組織起源的干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞后展現(xiàn)出免疫原性(上調(diào)HLA-DR)和免疫抑制(表達(dá)抑制免疫的HLA-G 和IL-10)［28］。

MSCs 在肝臟再生醫(yī)學(xué)中充當(dāng)著關(guān)鍵性的角色。除了肝細(xì)胞替代功能，MSCs 免疫調(diào)節(jié)和抗纖維化特性，不僅提高了MSCs 移植存活率和MSCs 的壽命，而且有助于一些免疫介導(dǎo)的肝臟疾病的治療，例如自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化和原發(fā)性硬化性膽管炎。MSCs 分化為肝細(xì)胞的有效性和穩(wěn)定性需要得到改善，同時需要進(jìn)行大量臨床試驗(yàn)驗(yàn)證MSCs 在人肝臟疾病中治療效果。

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