鼻咽癌基因選擇及基因治療的研究進(jìn)展

丁 矢，張艷平，李雪蘭

（常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 常德 415000）

鼻咽癌（NPC）是一種多基因遺傳性疾病，其發(fā)生與遺傳、病毒感染、環(huán)境、飲食等多種因素有關(guān)，主要發(fā)生在中國(guó)南方及中國(guó)南方移民的后裔人群中，尤其以廣東省最為嚴(yán)重。我國(guó)發(fā)病率較歐美等國(guó)家高25～30倍，因此鼻咽癌又被稱為“中國(guó)癌”。目前其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，治療效果亦不理想，5年生存率仍在50%～60%[1]。主要原因是其發(fā)病部位隱蔽，不易早期發(fā)現(xiàn)，且治療方式單一，缺乏特異治療藥物，傳統(tǒng)治療方法以放療為主，所以尋求一種新的治療方法迫在眉睫。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，腫瘤基因治療已成為新興的有效治療腫瘤的手段。目的基因的選擇及基因治療的方法和策略是腫瘤基因治療的兩個(gè)關(guān)鍵因素。利用與抗凋亡基因mRNA序列互補(bǔ)的特異性小分子干擾核糖核酸，作用于有凋亡抵抗的腫瘤細(xì)胞，阻斷其抗凋亡基因的表達(dá)，為調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡提供了新的治療策略。

1 EBV 基因組在腫瘤中的存在特點(diǎn)

研究表明，在EBV（EB病毒）相關(guān)腫瘤組織中，EBV只感染癌細(xì)胞而不感染正常細(xì)胞，而在EBV陽(yáng)性癌組織中，EBV基因組存在于幾乎所有的癌細(xì)胞中，提示EBV可能是治療EBV陽(yáng)性腫瘤的理想靶點(diǎn)，因此可以利用EBV陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的差異，采用適當(dāng)方法選擇性地殺傷EBV陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞[2]。腫瘤組織中EBV主要以潛伏感染的形式存在，不同EBV相關(guān)腫瘤組織中，病毒潛伏感染狀態(tài)不同，所表達(dá)的癌基因也不完全相同[3]。潛伏膜蛋白1（LMP1）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的病毒瘤基因，盡管100%的鼻咽低分化鱗癌存在EBV基因組，卻只有50%～60%的鼻咽癌組織表達(dá)LMP1，提示可能存在其他EBV瘤基因參與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程。

2 其他EBV 瘤基因在腫瘤中的作用

2.1 BHRF1 蛋白表達(dá)的作用

EBV裂解早期表達(dá)的蛋白BHRF1是近年來公認(rèn)的導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的病毒癌基因。BHRF1基因位于EBV基因組第54 376至54 951位核苷酸區(qū)域,全長(zhǎng)576 bp,開放讀碼框有191個(gè)密碼子,編碼17kDa的蛋白質(zhì),屬于Bcl-2家族。該蛋白由約150個(gè)氨基酸組成的疏水性N末端、21個(gè)疏水性氨基酸組成的跨膜區(qū)以及兩個(gè)精氨酸組成的C末端構(gòu)成。其中氨基端可以作為一個(gè)信號(hào)肽；羥基端的21個(gè)疏水性殘基與轉(zhuǎn)移膜固定序列相似，有兩個(gè)Asn-X-Thr/Ser序列，可以作為N-糖基連接的位點(diǎn)[4]。BHRF1蛋白有25%的氨基酸序列與人類原癌基因Bcl-2的編碼產(chǎn)物Bcl-2蛋白同源，42%的序列相似，而C區(qū)38%的氨基酸序列與Bcl-2序列同源。Henderson等曾用BHRF1表達(dá)載體pDH222轉(zhuǎn)染3種BL細(xì)胞系Wan-BL，Akata-BL和Raj-i BL，結(jié)果顯示，BHRF1能提高3種細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基或含Ionomycin（離子霉素）培養(yǎng)基中的生存能力。Huang等為研究BHRF1表達(dá)在Co60照射后的鼻咽癌細(xì)胞中的抗凋亡作用，構(gòu)建BHRF1高效表達(dá)載體轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞系CNE2，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Co60照射后細(xì)胞增殖和凋亡活性的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，照射前BHRF1的表達(dá)可以增加G1期細(xì)胞的數(shù)量，減少S期細(xì)胞的數(shù)量；照射后的BHRF1則能降低CNE2細(xì)胞的凋亡率，增加S期細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。提示BHRF1的表達(dá)能改變細(xì)胞復(fù)制周期,提高CNE2細(xì)胞抵抗照射的能力。說明BHRF1蛋白在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞抵抗凋亡的能力，BHRF1基因的表達(dá)可抑制細(xì)胞的終末分化和細(xì)胞凋亡的發(fā)生。但BHRF1基因編碼的蛋白最終是通過何種途徑抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而導(dǎo)致細(xì)胞癌變的分子機(jī)制目前還未完全闡明。

2.2 Bcl-2 蛋白表達(dá)的作用

雖然BHRF1與Bcl-2有高度同源序列（BH1區(qū)、BH2區(qū)和C末端），但兩種基因編碼N末端部分（即BHRF1的BH3區(qū)、BH4區(qū)與Bcl-2的BH3區(qū)）氨基酸序列有不同的蛋白,提示BHRF1和Bcl-2可能具有不同的功能。BHRF1與Bcl-2的另一不同點(diǎn)是翻譯后的修飾不同，Bcl-2在體內(nèi)以磷酸化形式存在,這種磷酸化修飾對(duì)Bcl-2的調(diào)節(jié)功能非常重要，而BHRF1具有兩個(gè)潛在的N-糖基化修飾位點(diǎn),說明BHRF1同靶分子的作用方式與Bcl-2不同。BHRF1缺少Bcl-2家族其他成員共有的用于結(jié)合促凋亡家族成員的暴露的疏水性溝槽結(jié)構(gòu)。此外，與Bcl-2蛋白相反，BHRF1并未與促凋亡蛋白Bak、Bax、Bik和Bad的肽段緊密結(jié)合，提示其抗凋亡作用機(jī)制與細(xì)胞癌基因Bcl-2或Bcl-xl不同。BHRF1并非EBV體外誘導(dǎo)B細(xì)胞轉(zhuǎn)化及病毒復(fù)制所必需基因，但從自然界不同來源的EBV基因中都能檢測(cè)到BHRF1基因序列，而且其編碼的氨基酸序列和抗凋亡活性高度保守，因此推測(cè)BHRF1抗凋亡功能對(duì)病毒生命周期至關(guān)重要，即可能通過延長(zhǎng)感染細(xì)胞的生存時(shí)間，有利于病毒的大量繁殖和建立持續(xù)性感染。在本項(xiàng)目前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示BHRF1基因在本研究所選用的人鼻咽癌CNE2細(xì)胞株過表達(dá)，F(xiàn)CM檢測(cè)CNE2細(xì)胞BHRF1陽(yáng)性率為56.8%，將構(gòu)建的攜帶BHRF1的慢病毒載體轉(zhuǎn)染無血清培養(yǎng)的CHO細(xì)胞，細(xì)胞凋亡時(shí)間明顯延長(zhǎng)，這與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)的報(bào)道較一致。鑒于EBV早期基因BHRF1可導(dǎo)致細(xì)胞癌變，并且與抗凋亡基因協(xié)同作用參與EBV相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，提示BHRF1基因很可能成為鼻咽癌基因治療較為理想的選擇性干預(yù)的靶基因。

3 RNA 干涉抑制鼻咽癌相關(guān)基因的表達(dá)

RNA干涉（RNA interference，RNAi）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（Post-Transcriptional Gene Silencing，PTGS）技術(shù)，它通過內(nèi)源性或外源性雙鏈小分子干擾RNA片段介導(dǎo)，在基因轉(zhuǎn)錄水平上特異性降解具有相應(yīng)序列的mRNA，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默，它是一個(gè)十分有效的基因敲除的方法。這一現(xiàn)象最先發(fā)現(xiàn)于隱桿線蟲中，現(xiàn)已證明存在于各種生物如植物、果蠅及哺乳動(dòng)物中。近年用RNAi技術(shù)在多種不同的腫瘤細(xì)胞中成功干擾了多種靶基因的表達(dá)，這些基因包括癌基因、抗凋亡分子、端粒酶、生長(zhǎng)因子受體、某些信號(hào)分子以及其他的一些基因，抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，已成為目前腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。伴隨著對(duì)其作用機(jī)理的研究，發(fā)現(xiàn)RNAi具有高特異性、高效性、高穿透性、可遺傳性等特點(diǎn)，能夠簡(jiǎn)單、高效地抑制特定基因的表達(dá)，適用于低等動(dòng)物及高等動(dòng)物[5]。它不僅是研究基因功能的一種有力工具，而且為特異性基因治療提供了新的技術(shù)手段，有廣泛的應(yīng)用潛能。目前制備siRNA的方法有：化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、體外消化法、siRNA表達(dá)載體法，其中前3種方法是在體外制備siRNA，通過轉(zhuǎn)染或電轉(zhuǎn)的方法將它導(dǎo)入細(xì)胞中，這使siRNA抑制作用時(shí)間短，且成本昂貴，并且易因污染RNAs酶而被降解，所以其應(yīng)用受到限制。RNA聚合酶III依賴性啟動(dòng)子U6和HL-RNA可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生小發(fā)夾RNA（shorthairpin RNA，shRNA），即轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生同時(shí)含有RNA正義鏈（19～23nt）、回折片段（1～7nt）和反義鏈（19～23nt）的小RNA，經(jīng)分子內(nèi)配對(duì)形成19～23nt的小發(fā)夾RNA[6]。由此介導(dǎo)的RNA干涉不僅可避免上述缺點(diǎn)，還可獲得較好的基因抑制效果。另外，經(jīng)過合適的抗藥性篩選，還可獲得干涉質(zhì)粒穩(wěn)定整合入基因組的永久干涉細(xì)胞克隆。病毒癌基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用導(dǎo)致了病毒相關(guān)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，說明理論上RNAi技術(shù)可將選擇性沉默腫瘤細(xì)胞內(nèi)病毒癌基因用于病毒相關(guān)腫瘤的治療是可行的。也有研究表明，survivin基因的過表達(dá)會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)放、化療的敏感性[7]。Yang等利用腺病毒載體介導(dǎo)的siRNA轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞性肺癌，通過干擾降低了survivin基因的表達(dá)，從而加強(qiáng)了該細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。提示RNAi技術(shù)可選擇外源性病毒基因?yàn)榘悬c(diǎn)，成為病毒陽(yáng)性腫瘤基因治療的新途徑。

4 結(jié)語

基因載體的選擇與構(gòu)建合適的載體系統(tǒng)是基因治療的關(guān)鍵。由于病毒基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，分子背景比較清楚，易于改造和操作，感染效率高，有較高靶細(xì)胞特異性，所以在以基因治療為目的的載體系統(tǒng)中，病毒載體就顯得格外令人關(guān)注。雖然脂質(zhì)體較病毒載體有許多優(yōu)越性，它的轉(zhuǎn)導(dǎo)無需受體，無免疫源性，安全性高且制備簡(jiǎn)單，但主要缺點(diǎn)是外源基因表達(dá)短暫。借鑒病毒對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有感染性，人們構(gòu)建了各種有效的病毒轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體雖可使目的基因整合至靶細(xì)胞基因組，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，但只能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞，主要用于基因治療的離體方案；腺病毒載體既能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞，亦可轉(zhuǎn)導(dǎo)靜止細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也較高，但目的基因不整合至靶細(xì)胞基因組，僅能短暫表達(dá)，而且腺病毒本身的某些抑制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是以HIV21為基礎(chǔ)發(fā)展而得，原表達(dá)可引起DC成熟。慢病毒載體能夠轉(zhuǎn)染非分裂期細(xì)胞和分裂期細(xì)胞，而且病毒的遺傳物質(zhì)能夠整合到宿主的基因組，慢病毒載體RNAi作用持久，免疫反應(yīng)小，同時(shí)擴(kuò)大了載體感染細(xì)胞的范圍，適于體內(nèi)基因治療[8]。本研究旨在利用RNAi技術(shù)，以慢病毒為載體，將負(fù)載BHRF1的shRNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至人鼻咽癌CNE2細(xì)胞后，觀察其對(duì)BHRF1基因沉默及細(xì)胞增殖和凋亡的影響以及腫瘤細(xì)胞對(duì)放射敏感性的變化，進(jìn)一步闡明BHRF1對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡機(jī)制，從而為臨床治療鼻咽癌提供新的理論依據(jù)。

[1]Setton J，Wolden S，Caria N，et al. Definitive treatment of metastatic nasopharyng ealcarcinoma: Report of 5 cases with review of literature[J].Head Neck，2012，34（5）：753-757.

[2]Li Z，Chen X，Li L，et al.EBV encoded miR-BHRF1-1 potentiates viral lytic replication by down regulating host p53 in nasopharyngeal carcinoma[J].Int J Biochem Cell Biol，2012，44（2）：275-279.

[3]Kim do N，Song YJ，Lee SK. The role of promoter methylation in Epstein-Barr virus （EBV）microRNA expression in EBV-infected B cell lines[J].Exp Mol Med，2011，43（7）：401-410.

[4]Jing YZ，Wang Y，Jia YP，et al.Polymorphisms of Epstein-Barr virus－BHRF1gene，a homologue of bcl-2 [J].Chin J Cancer，2010，29（12）：1000-1005.

[5]Xing L，Kieff E. Epstein-Barr Virus BHRF1 micro and stable RNAs during latency III and after induction of replication [J].J Virol，2007，81（18）：9967-9975.

[6]Kim do N，Chae HS，Oh ST，et al.Expression of viral microRNAs in Epstein-Barr Virus associated gastric carcinoma [J].J Virol，2007，81（2）：1033-1036.

[7]Landais E，Saulquin X，Bonneville M，et al.Long-term MHC class II presentation of the EBV lytic protein BHRF1 by EBV latently infected b cells following capture of BHRF1antigen [J].J Immunol，2005，175（12）：7939-7946.

[8]Pratt ZL，Kuzembayeva M，Sengupta S，et al. The microRNAs of Epstein-Barr Virus are expressed at dramatically differing levels among cell lines[J].Virology，2009，386（2）：387-397.■