不同方法提取和處理中華絨螯蟹組織蛋白的過敏原組分分析①

朱黎娜 侯麗英 張盈瑩 周宇捷 李韶深 李會(huì)強(qiáng) (天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，天津 300203)

食物過敏(Food allergy，F(xiàn)D)作為一類常見的過敏性疾病，近年來發(fā)病率逐漸升高，幾乎5%的成人和8%的兒童有食物過敏的癥狀，已嚴(yán)重影響了人們的生活健康［1-3］。甲殼類食物作為常見的食物過敏原，是八類主要過敏性食物之一，而中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)是我國人群最常食用的，也是極易引起過敏的特有的甲殼類動(dòng)物之一。

目前，臨床上檢測(cè)血清特異性IgE(special IgE，sIgE)多采用國外系統(tǒng)和試劑盒，常使用提取的天然過敏原作為已知抗原;在食物過敏的基礎(chǔ)研究中，也使用所提取的食物蛋白溶液作為食物過敏原鑒別的基礎(chǔ)材料。但由于蛋白的提取方法、抗原的處理方式不同，蛋白提取溶液中的組分也存在差異。此種差異可影響臨床實(shí)驗(yàn)室血清sIgE 檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)也會(huì)造成過敏原鑒別等基礎(chǔ)研究結(jié)果的差異。此外，進(jìn)口試劑盒提供的蟹蛋白溶液多為海蟹蛋白，與中華絨螯蟹蛋白存在一定差異［4］。因此，探討如何制備組分完整、免疫活性良好的中華絨螯蟹組織蛋白溶液具有重要意義。本研究通過分析不同提取方法及加熱處理前、后的中華絨螯蟹組織蛋白組分，并用蟹過敏患者血清中的sIgE 作為“探針”，通過Western blot 分析其過敏原免疫活性，以尋找最合適的中華絨螯蟹過敏原提取和處理方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 新鮮中華絨螯蟹購自天津市河西區(qū)三義莊菜市場。20 例蟹過敏患者的陽性血清(自天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院)，患者病史主訴為中華絨螯蟹過敏，血清總IgE＞100 kU/L，蟹sIgE＞0.35 kU/L 等。所有陽性血清均經(jīng)提取的河蟹蛋白混合溶液作為包被抗原采用斑點(diǎn)印跡方法進(jìn)行確認(rèn)。陰性對(duì)照血清:1 份。采集無任何過敏史的健康體檢人群血清作陰性血清。分離血清并分裝保存于-20℃。

1.1.2 儀器與試劑 垂直板型電泳槽、半干式轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像系統(tǒng)、PROTEAN i12 IEF 儀、水化盤、聚焦盤(美國Bio-Rad 公司);聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore 公司);微量電動(dòng)組織勻漿器(美國Kimble 公司)。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、過硫酸銨(AP)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、β-巰基乙醇、Tween-20、Tris、溴酚藍(lán)、甘油、碘乙酰胺、堿性磷酸酶(ALP)顯色底物、碘乙酰胺、ALP 標(biāo)記的鼠抗人IgE 等均購自美國Sigma公司;3-［(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基］-1-丙磺酸(CHAPS)、硫脲購自美國Amresco 公司;IPG 預(yù)制膠條7cm pH3-10、兩性載體Pharmalyte pH3～10、尿素、礦物油購自美國GE 公司;二硫蘇糖醇(DTT)，購自美國Merck 公司;蛋白酶抑制劑complete EDTA-free，購自瑞士羅氏公司;蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)SM1811，購自美國Fermentas 公司。

1.2 方法

1.2.1 制備蛋白粗提液 方法A:PBS 提取法。參考文獻(xiàn)［5］，取蟹肉組織用研缽在液氮環(huán)境中研磨成勻漿，按每克樣品加入0.01 mol/L PBS(pH7.2)15 ml，再用電動(dòng)勻漿器勻漿30 s，置4℃冰箱，期間攪拌大約1.5 h，24 h 后，10 000 r/min，4℃離心60 min，收集上清，過濾后分裝-80℃保存，備用。

方法B:丙酮抽提法。參照文獻(xiàn)［6］，將蟹肉組織在液氮環(huán)境中按體積比1∶15 的比例加入預(yù)冷丙酮研磨均勻，再用電動(dòng)勻漿器勻漿30 s，置4℃冰箱脫脂24 h 至脫脂完全為止，待丙酮完全揮發(fā)后，按每克樣品加入0.01 mol/L PBS(pH7.2)15 ml，置4℃冰箱，期間攪拌大約1.5 h，24 h 后，10 000 r/min，4℃離心60 min，收集上清，過濾后分裝-80℃保存，備用。

方法C:裂解液提取法。分為熟蟹和生蟹，參考文獻(xiàn)［7］，將蟹肉組織在液氮環(huán)境中將按體積比1∶4的比例加入裂解液(7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、4%CHAPS、40 mmol/L Tris、蛋白酶抑制劑、去離子水，使用前加入65 mmol/L DTT)研磨均勻，再用電動(dòng)勻漿器勻漿30 s，置4℃冰箱靜置1 h，10 000 r/min，4℃離心60 min，收集上清，過濾后分裝-80℃保存，備用。

1.2.2 SDS-PAGE 和雙向電泳分析蛋白組分 用不連續(xù)系統(tǒng)進(jìn)行垂直板電泳，對(duì)蟹蛋白粗提液組分進(jìn)行分析，濃縮膠為5%，分離膠為10%，待分析樣品與上樣緩沖液以適當(dāng)比例混合(A、B 法1∶4，C 法1∶15)，煮沸5 min，每孔上樣6 μl，65 V 電壓堆積20 min，135 V 電壓分離，待溴酚藍(lán)指示到達(dá)底部，電泳完畢，考馬斯亮藍(lán)R250 染色1 h，脫色液充分洗脫，拍照。

雙向電泳分析蛋白組分 第一向:等電聚焦電泳。分別將不同方法提取的蛋白樣品與水化上樣緩沖液(7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、4% CHAPS、40 mmol/L Tris、0.001%溴酚藍(lán)、去離子水，使用前加入65 mmol/L DTT、0.2%兩性載體Pharmalyteph3-10)以適當(dāng)比例(A、B 法1∶4，C 法1∶15)混合，水化液與樣品溶液終體積為125 μl，用加樣槍將混合樣品均勻鋪在膠條槽內(nèi)，將7 cm 膠條膠面朝下覆蓋在蛋白樣品上，覆蓋礦物油1 ml。電泳參數(shù)設(shè)定為18℃，50 V 水化14 h;S1:250 V 線性30 min;S2:500V 快速30 min;S3:4 000 V 線性3 h;S4:4 000 V 快速20 000 Vh;S5:500 V 快速 任意時(shí)間。第二向:SDS-PAGE 電泳。等電聚焦完成后將膠條取出，用新鮮配制的平衡液Ⅰ和平衡液Ⅱ(平衡母液中含0.375 mol/L pH8.8 Tris-HCl、6 mol/L 尿素、20%甘油、2%SDS，平衡液Ⅰ加入2%DTT，平衡液Ⅱ加入2.5%碘乙酰胺)，分別平衡10 min，放在干燥的濾紙上，備用。配制T=10%的聚丙烯酰胺凝膠，待膠凝固后，將膠條輕推入凝膠上方，再加入0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液，凝固后，即可開始電泳。65 V 恒壓15 min，135 V 恒壓分離，待溴酚藍(lán)指示到達(dá)底部，電泳完畢，考馬斯亮藍(lán)R250 染色1 h，脫色液充分洗脫，拍照。

1.2.3 Western blot 分析過敏原組分 將不同方法提取的蛋白粗提液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳后，干轉(zhuǎn)膜儀15 V 電壓下30 min，干轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，用5%脫脂奶封閉過夜;TBST 洗滌3 次，每次10 min;將已封閉的膜依次加入TBST 稀釋20 倍的過敏患者血清(3 例陽性單例血清和10 例陽性混合血清)，室溫?fù)u床孵育2 h，再4℃過夜;洗3 次;加入酶標(biāo)二抗(TBST 稀釋1 000 倍)，室溫?fù)u床孵育2 h;洗3 次;加入AP 底物避光顯色10 min;用水洗滌，觀察結(jié)果，拍照。同時(shí)，將裂解液提取的加熱前、后的蟹蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，并進(jìn)行半干轉(zhuǎn)，用10 例陽性血清和1 例陰性血清進(jìn)行Western blot 試驗(yàn)，方法同上。

2 結(jié)果

2.1 不同提取和處理方法蟹蛋白組分分析

2.1.1 3 種提取方法蟹蛋白組分分析 3 種提取方法中華絨螯蟹蛋白提取液經(jīng)SDS-PAGE 及考馬斯亮藍(lán)染色后結(jié)果見圖1。3 種方法制備的蛋白溶液所含成分不相同，PBS 提取液顯示出12 條可辨的蛋白條帶，其中94、85、76、66、18 kD 條帶染色較深，為主帶;丙酮提取液有12 條可辨的蛋白條帶，較清晰的為94、85、76、36 kD;裂解液提取液白有21 條可辨的蛋 白條帶，較清晰的為200、125、51、43、38kD。采用雙向電泳對(duì)上述3 種蛋白提取液進(jìn)一步分析，結(jié)果如圖2 所示。PBS 提取液在18～100 kD、pH4～9 的范圍內(nèi)存在斑點(diǎn)，其中70～100 kD、pH5 和18 kD、pH4處有兩個(gè)斑點(diǎn)大且染色深，為主要蛋白。丙酮提取液在18～100 kD、pH4～10 的范圍內(nèi)存在斑點(diǎn)，其中70～100 kD、pH5，38 kD、pH4 和18 kD、pH4 處有三個(gè)主要斑點(diǎn)。裂解液提取液斑點(diǎn)多，分布廣，在18～200 kD、pH3～10 的范圍內(nèi)有大量斑點(diǎn)，其中130 kD、pH5.5，100 kD、pH5，50 kD、pH4、40 kD、pH5，38 kD、pH8 和18 kD、pH4 處有6 個(gè)主要斑點(diǎn)。綜合SDS-PAGE 電泳和雙向電泳結(jié)果可以認(rèn)為裂解液提取法所制備的蛋白提取液蛋白質(zhì)組分較完整。

圖1 中華絨螯蟹組織蛋白提取液SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of extract from tissue protein of Eriocheir sinensis

圖2 中華絨螯蟹組織蛋白提取液雙向電泳分析Fig.2 2-DE analysis of extract from tissue protein of Eriocheir sinensis

圖3 加熱前、后(裂解液提取法)蛋白溶液SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of extract of heating and without heating crab proteins

圖4 中華絨螯蟹組織蛋白提取液Western blot 分析Fig.4 Western blot analysis of extract from tissue protein of Eriocheir sinensis

2.1.2 加熱前、后(裂解液提取法)蟹蛋白組分分析 裂解液提取的加熱前、后的中華絨螯蟹蛋白提取液經(jīng)SDS-PAGE 蛋白電泳后圖譜如圖3 所示，生蟹和熟蟹的蛋白基本相同，僅個(gè)別條帶有區(qū)別:200、125、115、105、94、85、79、53、51、43、38、36、33、29、27、25、20、19、18、16、14 kD 為共同條帶，生蟹在76 kD 處有條帶，熟蟹在130、113、10 kD 處也有條帶。

2.2 免疫活性鑒定 不同方法提取的蟹蛋白提取液經(jīng)Western blot 分析，分別使用單例和混合的陽性血清作為探針，結(jié)果如圖4 所示。以陽性血清為探針的印跡中，76、43、38、18 kD 為三種提取和處理方法的共同條帶;PBS 提取的蟹蛋白陽性反應(yīng)條帶主要分布在76、66、53、43、38、18 kD;丙酮提取的蟹蛋白陽性反應(yīng)條帶主要分布在94、76、66、50、43、38、18 kD;裂解液提取的蟹蛋白陽性反應(yīng)條帶主要分布在200、105、94、76、43、38、18 kD，裂解液提取的加熱前、后蟹蛋白提取液經(jīng)Western blot 分析，分別使用10 例陽性和1 例陰性血清作為探針，結(jié)果如圖5 所示。病人血清與生蟹和熟蟹蛋白反應(yīng)條帶基本一致，僅個(gè)別條帶有區(qū)別。3 號(hào)和6 號(hào)病人在200 kD處生蟹蛋白出現(xiàn)條帶，而熟蟹沒有。某些條帶不同病人有不同的反應(yīng)性。陰性對(duì)照血清(N)無反應(yīng)條帶出現(xiàn)。

圖5 加熱前、后蟹蛋白提取液提取的蟹蛋白Western blot結(jié)果Fig.5 Western blot analysis of extract of heating and without heating crab proteins

3 討論

中華絨螯蟹，又稱河蟹、大閘蟹，是引起食物過敏的主要的甲殼類食物之一。研究顯示，存在于甲殼類動(dòng)物中的過敏原有原肌球蛋白、球蛋白輕鏈、精氨酸激酶、肌鈣蛋白C 等［8-11］，不同種類的甲殼類動(dòng)物過敏組分不同。此外，不同個(gè)體間對(duì)同一過敏食物的反應(yīng)存在異質(zhì)性，可能導(dǎo)致漏檢。因此，為提高臨床診斷中華絨螯蟹過敏原的靈敏度和特異度及脫敏治療的效果，需要制備組分全、免疫活性好的過敏原溶液，開發(fā)適合我國人群的過敏性疾病診斷試劑。

本研究通過SDS-PAGE 比較分析了文獻(xiàn)報(bào)道中常用的提取食物蛋白的PBS 提取法、丙酮抽提法和裂解液提取法3 種方法所制備的中華絨螯蟹蛋白溶液的蛋白組分及其分子量，發(fā)現(xiàn)裂解液提取法提取的蛋白組分多、全，分子量跨度大，不同提取方法不同分子量的蛋白濃度也不相同。雖然3 種蛋白提取液中94、85、76、43、36、30、18 kD 的蛋白都存在，但雙向電泳的結(jié)果顯示裂解液提取的蛋白溶液分子量和等電點(diǎn)分布都較其他兩種方法廣泛，所含蛋白組分較豐富。

以過敏患者的血清(特異性IgE)為“探針”，通過Western blot 可鑒別所提取蛋白溶液中蛋白質(zhì)的免疫活性。76、50、43、38、18 kD 處的蛋白為三種提取液都含有的致敏蛋白，與吳興達(dá)課題組的報(bào)道相似［12］。吳序櫟等［13］用Western blot 鑒定分離的蛋白組分中的致敏成分，蟹全身蛋白有5 條明顯的陽性條帶，為25、23、21、19 和11 kD 處;毛露甜等［14］的研究發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹在66 kD 處有明顯致敏條帶，與本研究結(jié)果有差別，可能與蟹蛋白的提取方法不同及人群的地域性有關(guān)而在裂解液提取的蟹蛋白中有些特有的高分子量的蛋白可與陽性血清中的sIgE 結(jié)合，為致敏蛋白，此前未見報(bào)道;圖4 中2 號(hào)病人對(duì)丙酮和PBS 提取的蛋白幾乎沒有反應(yīng)性，但對(duì)裂解液提取的蟹蛋白有反應(yīng)性，說明裂解液提取的蛋白有助于判斷弱陽性病人。這些對(duì)發(fā)現(xiàn)新的中華絨螯蟹過敏原，完善臨床診斷試劑盒，減少臨床假陰性的產(chǎn)生有很大的幫助。

邵潔等［15］研究報(bào)道，血清sIgE 檢測(cè)結(jié)合皮膚點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)(Skin prick tests，SPT)具有較高的食物過敏確診率，但兩者也存在不相符的情況，需用雙盲安慰劑對(duì)照食物激發(fā)試驗(yàn)(Double-blind placebo-controlled food challenge，DBPCFC)進(jìn)行確診。這與試劑盒提供的蛋白原液有關(guān)。目前臨床檢測(cè)IgE 使用的進(jìn)口試劑盒提供的是鋸緣青蟹和梭子蟹等海蟹的天然過敏原作為蟹類過敏的檢測(cè)組分。研究報(bào)道鋸緣青蟹和梭子蟹的過敏組分主要集中在85、75、48、38kD 等處［14，16］，而對(duì)高分子量的蛋白的反應(yīng)報(bào)道較少，而本研究提取的中華絨螯蟹蛋白提取液除了以上海蟹的主要反應(yīng)區(qū)外，在105 甚至200kD 處也出現(xiàn)了反應(yīng)條帶，進(jìn)一步研究可發(fā)現(xiàn)新的蟹類過敏原，同時(shí)，證實(shí)海蟹與中華絨螯蟹的過敏原的差異。

我國人群對(duì)蟹的食用方法除了煮熟還會(huì)進(jìn)行腌制、生食，研究加熱前、后的過敏原成分及抗原性可指導(dǎo)食品加工業(yè)生產(chǎn)豐富的無過敏或低過敏的蟹食品。本研究發(fā)現(xiàn)加熱對(duì)蟹蛋白的影響較小，在高分子量區(qū)，熟蟹蛋白條帶增多，可能與加熱使某些蛋白結(jié)構(gòu)改變、通過S-S 鍵聚合引起分子量增多相關(guān)，但對(duì)于原肌球蛋白等熱穩(wěn)定蛋白無影響。加熱前后的蛋白抗原性基本相同，加熱對(duì)蟹蛋白的致敏性沒有改變。與文獻(xiàn)中相關(guān)研究相符［17］，加熱會(huì)引起牛乳中某些蛋白的結(jié)構(gòu)改變、聚合，引起抗原性降低，如β-乳球蛋白，但對(duì)于熱穩(wěn)定蛋白酪蛋白的抗原性沒有影響。但Abramovitch 等［18］通過ELISA、免疫印跡和嗜堿性粒細(xì)胞活化試驗(yàn)比較加熱前后梭子蟹與sIgE 的反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)加熱后的蟹肉反應(yīng)性更高。這提示我們需要進(jìn)行更多的試驗(yàn)及大樣本分析來驗(yàn)證加熱前、后的過敏原致敏性。但食用生、熟蟹肉都會(huì)都導(dǎo)致過敏人群的反應(yīng)，蟹過敏患者應(yīng)避免食用蟹產(chǎn)品。

根據(jù)本研究結(jié)果，我們認(rèn)為裂解液提取法更適合制備中華絨螯蟹蛋白溶液，所獲蛋白組分較完整，分子量跨度大，免疫活性強(qiáng)，與sIgE 結(jié)合更強(qiáng)，更適合應(yīng)用于臨床診斷中華絨螯蟹過敏性疾病。加熱前、后蟹肉蛋白組分差別不大，但需要進(jìn)一步收集病例，用多種試驗(yàn)對(duì)加熱前、后的蟹肉蛋白的致敏性進(jìn)行研究分析。下一步可通過中華絨螯蟹和海蟹的過敏原組分比較，研究兩者不同的過敏原組分，并進(jìn)一步分析抗原表位，通過重組表達(dá)，人工制備出適合中國人群的、過敏原組分齊全的蟹標(biāo)準(zhǔn)化抗原，提高臨床對(duì)蟹過敏人群的特異性診斷，構(gòu)建人工嵌合過敏原進(jìn)行脫敏治療。

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