馬齒莧提取物對急性濕疹大鼠皮膚TNF-α與IL-4 表達的影響①

葛一漫 張朝明 胡一梅 王 毅 吳心語 謝國麗 張靈玲

(成都中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院，成都 610072)

急性濕疹，又稱特應(yīng)性皮炎，是一種復發(fā)性、炎癥性皮膚疾病，主要表現(xiàn)為廣泛的、多形性對稱性紅斑丘疹、皮膚瘙癢、干燥、炎癥等，影響著全世界15%～30%的兒童和2%～10%的成年人［1］。濕疹是由多種內(nèi)、外因素引起的皮膚病，發(fā)病機制復雜，一般認為與變態(tài)反應(yīng)有較密切的關(guān)系。治療濕疹這類變態(tài)反應(yīng)包括了局部類固醇和免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用。此類藥物如糖皮質(zhì)激素雖有較好的免疫抑制作用，但會出現(xiàn)皮膚萎縮、色素沉著等不良反應(yīng)，還可能出現(xiàn)代謝紊亂、誘發(fā)加重感染，不宜長期使用［2，3］。馬齒莧含有大量的多糖、揮發(fā)油、氨基酸等有效成份，具有止癢收澀功能，對濕疹的療效顯著［4］。

本實驗擬通過運用馬齒莧提取物對急性濕疹大鼠模型的進行干預(yù)治療，觀察大鼠皮膚的腫脹度，結(jié)合局部皮損處TNF-α、IL-4 的表達，從促炎因子和抗炎因子平衡的角度，探討馬齒莧提取液對濕疹的抑制作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD 大鼠，SPF 級，雌雄不限，體重180～220 g，由成都達碩生物科技有限公司提供，實驗動物合格證號:SCXK(111)2008-24。

1.2 藥物與試劑

1.2.1 馬齒莧提取液 500 g 新鮮馬齒莧放于榨汁機內(nèi)榨取新鮮馬齒莧粗汁200 ml，用無菌紗布5 層過濾，獲得淺紅色馬齒莧提取液，盛放于消毒處理的玻璃瓶內(nèi)，置于低溫0～5℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 陽性藥 復方黃柏液，山東漢方制藥有限公司，生產(chǎn)批號:Z10950097。

1.2.3 2，4-二硝基氯苯(DNCB) 成都科龍化工試劑廠，批號:20090813。

1.3 實驗分組及造模 SD 大鼠40 只，隨機分為4個組，每組10 只，分別作為正常組、模型組、復方黃柏組、馬齒莧組。用電推剪及電剃須刀去除大鼠腹部毛發(fā)，面積約2 cm×3 cm，并涂5%的2，4-二硝基氯苯(DNCB)30 μl 于皮膚首次致敏，第3 天，在右背部剃毛區(qū)涂0.2%DNCB 50 μl 進行二次抗原攻擊，左背部對稱的剃毛區(qū)不用藥物作為對照部位。以后每隔3 d 激發(fā)1 次，連續(xù)3 次。于第9 天觀察大鼠右背部較左背部明顯出現(xiàn)紅斑、水腫、丘疹、糜爛或滲出，表明造模成功。于第10 天開始，模型組、復方黃柏組、馬齒莧組分別給予1 ml 無菌蒸餾水、復方黃柏液和馬齒莧提取液，每天2 次，上下午各1次，連續(xù)9 d。所有實驗均根據(jù)赫爾辛基宣言和保護及運用動物的指導原則進行。

1.4 實驗取材 造模后第21 天，斷頸處死動物，使用無菌手術(shù)剪將大鼠后背部右側(cè)造模區(qū)皮膚兩塊及對稱的左側(cè)健康皮膚一塊分別剪下，第一塊造模區(qū)皮膚與左側(cè)健康皮膚均采用直徑6 mm 圓形打孔器分別打下相同面積的皮膚，用分析天平(BS-600L，規(guī)格:600 g/0.1 g，上海友聲衡器有限公司)稱重(計量單位mg，精確到0.1 mg)。第二塊造模區(qū)皮膚，裝于DEPC 水處理過的EP 管中，放置10%中性甲醛溶液中固定48 h，待做免疫組化檢查。

1.5 觀察指標

1.5.1 皮膚腫脹度指標 皮膚腫脹度=炎癥皮膚重量-健康皮膚重量，抑制率%=(炎癥皮膚重量-健康皮膚重量)/健康皮膚重量×100%。

1.5.2 免疫組化檢測TNF-α、IL-4 含量 取上述經(jīng)過固定的皮膚組織，取材、逐級酒精脫水、浸蠟，石蠟包埋，切片2 張，厚度4 μm，采用免疫組化SP 法分別做TNF-α、IL-4 染色，操作按照說明書進行，設(shè)置陽性及陰性對照。TNF-α 一抗(克隆號:BA0131，兔抗鼠TNF-α 多克隆抗體)，IL-4 一抗(克隆號:BA0980，兔抗鼠IL-4 多克隆抗體，購自武漢博士德生物工程有限公司，相應(yīng)二抗及試劑盒購自北京中杉生物有限公司)。陽性物質(zhì)判定標準:陽性物質(zhì)呈棕黃色、黃色、淺黃色，顆粒狀、細絲狀，位于細胞漿內(nèi)或間質(zhì)內(nèi)。顯微鏡下觀察TNF-α、IL-4 免疫組化染色切片，首先在低倍(×100)下觀察陽性物質(zhì)分布、范圍及位置，選擇陽性物質(zhì)最明顯處(“熱點”)5 個視野，然后在中倍(×200)下，采用Image-Pro Plus 圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics，Inc.公司)半定量檢測上述5 個視野陽性物質(zhì)的積分光密度(IOD)，計算5 個視野陽性物質(zhì)的積分光密度總和，表示TNF-α、IL-4 含量。

1.6 統(tǒng)計學方法 用SPSS17.0 軟件進行統(tǒng)計分析。檢測數(shù)據(jù)用均±s 表示。采用t 檢驗，檢驗標準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠皮膚肉眼觀察結(jié)果 模型組大鼠在二次抗原攻擊后的9 d 內(nèi)，右背部較左背部皮膚出現(xiàn)明顯紅斑、水腫、丘疹、糜爛和滲出(圖1A)。復方黃柏組、馬齒莧組隨著給藥時間的持續(xù)，大鼠右背部皮膚紅斑、水腫、丘疹、糜爛和滲出癥狀得到明顯的改善(圖1B、C)。馬齒莧組比復方黃柏組癥狀改善更為明顯(圖1C)。

2.2 各組大鼠皮膚腫脹度以及抑制率結(jié)果 大鼠皮膚腫脹度及抑制率值，用藥組與模型組相比有極顯著性差異(P＜0.01)，馬齒莧組與復方黃柏組相比也具有顯著性差異(P＜0.05)。見表1。

2.3 各組大鼠皮膚組織TNF-α、IL-4 觀察檢測結(jié)果 顯微鏡下觀察TNF-α、IL-4 免疫組化染色切片(見圖2、3)，可見TNF-α、IL-4 陽性物質(zhì)呈顆粒狀、細絲狀，棕黃色、黃色、淺黃色，位于皮膚表皮棘細胞、皮膚附屬器汗腺細胞、皮脂腺細胞、毛囊細胞、真皮內(nèi)炎細胞胞漿，部分位于真皮內(nèi)間質(zhì)組織中。

空白組大鼠背部皮膚內(nèi)TNF-α、IL-4 陽性物質(zhì)染色淺黃色，分布面積小、稀疏(A1、A2)。模型組大鼠背部皮膚組織內(nèi)TNF-α、IL-4 陽性物質(zhì)染色呈棕黃色、黃色，分布面積廣、密集(B1、B2)，復方黃柏組和馬齒莧組TNF-α、IL-4 陽性物質(zhì)染色呈黃色、淺黃色，分布面積縮小、較稀疏(C3、C4、D3、D4)。各組大鼠背部皮膚TNF-α、IL-4 半定量檢測結(jié)果，與模型組相比，復方黃柏組和馬齒莧組對濕疹大鼠皮膚組織有明顯的抑制作用(P＜0.01)。與復方黃柏組比較，馬齒莧組TNF-α、IL-4 含量也明顯降低也(P＜0.05)。見表2。

表1 馬齒莧提取液對急性濕疹大鼠皮膚腫脹度的影響( ±s)Tab.1 Effect of Portulaca extracts on skin levels of swelling in rats with atopic eczema( ±s)

表1 馬齒莧提取液對急性濕疹大鼠皮膚腫脹度的影響( ±s)Tab.1 Effect of Portulaca extracts on skin levels of swelling in rats with atopic eczema( ±s)

Note:Compared with model group，1)P＜0.01;compared with Cortex Phellodendri group，2)P＜0.01.

圖1 大鼠皮膚肉眼觀察結(jié)果Fig.1 Results of macroscopic observation of rat skin

圖2 皮膚組織中TNF-α 的表達(免疫組化染色，×200)Fig.2 Expression of TNF-α in skin tissue(immunohistochemical staining，×200)

圖3 皮膚組織中IL-4 的表達(免疫組化染色，×200)Fig.3 Expression of IL-4 in skin tissue (immunohistochemical staining，×200)

表2 馬齒莧提取物對急性濕疹大鼠皮膚TNF-α、IL-4 的影響( ±s)Tab.2 Effect of Portulaca extracts on skin levels of TNF-α and IL-4 in rats with atopic eczema( ±s)

表2 馬齒莧提取物對急性濕疹大鼠皮膚TNF-α、IL-4 的影響( ±s)Tab.2 Effect of Portulaca extracts on skin levels of TNF-α and IL-4 in rats with atopic eczema( ±s)

Note:Compared with normal control group，1)P＜0.01;compared with model group，2)P＜0.01;compared with Cortex Phellodendri group，3)P＜0.05.

3 討論

急性濕疹是一種由多種內(nèi)外因素共同作用引起的復發(fā)性、炎癥性皮膚疾病，主要臨床表現(xiàn)為皮膚糜爛滲出、紅斑丘疹、水腫、瘙癢等。馬齒莧屬馬齒莧科，是我國古老的菜藥兼用植物，據(jù)《本草綱目》記載，臨床可用于“散血消腫，利腸滑胎，解毒通淋，治產(chǎn)后虛汗”［5］。現(xiàn)代科學研究表明［6，7］，馬齒莧含有大量多糖、氨基酸、去甲腎上腺素等活性成分，具有消炎抑菌、增強免疫等作用。臨床上使用復方黃柏液治療嬰兒急性濕疹起到了較好作用，因此選擇該藥作為本實驗的陽性藥物［8］。本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠右背部皮膚較左背部明顯出現(xiàn)紅斑、水腫、丘疹、糜爛和滲出，腫脹度明顯增加，腫脹抑制率高達41.5%，這與Kim 等［9］報道的急性濕疹癥狀一致，表明本實驗造模成功。用藥后，復方黃柏組和馬齒莧組大鼠右背部皮膚急性濕疹癥狀得到明顯的改善，其中腫脹度與模型組比較明顯減輕，且馬齒莧組減輕更為顯著，這與胡一梅等［4］報道的鮮馬齒莧治療急性濕疹有明顯的療效是一致的，提示復方黃柏液和馬齒莧提取液均能改善濕疹癥狀，尤以馬齒莧提取液效果更為顯著。

急性濕疹屬于Ⅳ型超敏反應(yīng)性炎癥性疾病，是效應(yīng)T 細胞與特異性抗原結(jié)合后引起的炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)過程中炎細胞會釋放炎癥介質(zhì)，包括促炎因子與抗炎因子。濕疹發(fā)生發(fā)展過程中，貫穿著這些炎癥介質(zhì)的相互作用，其變化對濕疹的發(fā)展方向與結(jié)局產(chǎn)生深遠的影響。既往對濕疹機制的研究發(fā)現(xiàn)［10，11］，免疫調(diào)節(jié)異常是濕疹發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，尤其是Th 細胞亞群功能失衡，對于促炎因子和抗炎因子及其平衡與濕疹的關(guān)系少有報道。鑒于此，本實驗通過觀察大鼠濕疹皮膚促炎因子腫瘤壞死因子(TNF-α)和抗炎因子白細胞介素(IL-4)的改變，探討濕疹發(fā)生發(fā)展與促炎因子和抗炎因子的關(guān)系，為臨床治療濕疹提供另一種思路。

TNF-α 屬于促炎因子之一，TNF-α 含量增高不僅可促進炎癥部位血管擴張、血管壁通透性增加、趨化白細胞、發(fā)熱、致痛及引起炎癥部位組織損傷，導致炎癥程度加重，同時，還可引起IL-1、IFN 等促炎因子含量增加，進一步加重濕疹皮損的炎癥反應(yīng)［12］。臨床上抗炎作用的途徑之一就是通過減少促炎因子包括TNF-α 的產(chǎn)生［13］。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模成功后大鼠背部皮膚TNF-α 含量比空白組明顯增高，用藥后，復方黃柏組和馬齒莧組TNF-α 含量明顯低于模型組，同時馬齒莧組低于復方黃柏組。揭示馬齒莧提取液治療濕疹的可能機制之一是通過下調(diào)促炎因子TNF-α 的含量來發(fā)揮作用。

IL-4 屬于抗炎因子之一，炎癥過程中抗炎因子與促炎因子在不同的環(huán)節(jié)上相互作用、相互拮抗，發(fā)揮抑制炎癥的作用。研究發(fā)現(xiàn)［14］，IL-4 不僅可調(diào)節(jié)T、B 淋巴細胞的分化、活化，促進以Th2 細胞為特征的免疫應(yīng)答，同時還可通過抑制單核巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α 發(fā)揮抗炎作用。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組、復方黃柏組及馬齒莧組IL-4 含量顯著增高，并隨著TNF-α 含量的增高呈比例的增高，表明機體在炎癥時炎細胞生成釋放一定量促炎因子的同時也生成釋放相應(yīng)量的抗炎因子，限制炎癥的加重、放大，發(fā)揮炎癥的局部防御作用。然而，IL-4 具有抗炎作用的同時也具有促炎作用，它是B 細胞產(chǎn)生IgE 所必需，在濕疹等變態(tài)反應(yīng)中IL-4 分泌過量導致IgE 的增高，IgE 的增高與濕疹發(fā)病顯著相關(guān)［15，16］，所以IL-4具有抗炎/促炎的雙重作用。這就意味著在臨床控制炎癥時，既要通過調(diào)控機體一定程度升高IL-4 的含量發(fā)揮其抗炎作用，又要適度控制升高幅度抑制其促炎作用。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比，模型組IL-4 顯著升高，并與TNF-α 呈比例增高，濕疹癥狀非常明顯，復方黃柏組、馬齒莧組大鼠皮膚組織的IL-4 含量輕微升高，但差異無顯著性。同時與模型組比，復方黃柏組、馬齒莧組大鼠皮膚組織的IL-4含量明顯降低，并與TNF-α 呈比例降低，濕疹癥狀顯著減輕，顯示模型組濕疹的形成不僅是由于TNFα 顯著增高所致，還可能是IL-4 呈比例過度增高引起，復方黃柏和馬齒莧提取液治療濕疹有明顯療效，其機制可能不僅是降低TNF-α 含量，同時還呈比例的降低IL-4 的含量，即馬齒莧提取液療效的另一個機制可能是適度地調(diào)控IL-4 的含量。

綜上所述，馬齒莧提取液對濕疹具有明顯的療效，其機制可能是通過下調(diào)TNF-α 的含量，同時適度地調(diào)控IL-4 的含量。

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