香蕉MaBTB基因的表達分析及亞細胞定位

柴文龍金志強賈彩紅劉菊華苗紅霞張建斌徐碧玉

（1.海南大學農(nóng)學院，?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，?？?71101；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院?？趯嶒炚?海南省香蕉遺傳改良重點實驗室，海口 570102）

香蕉MaBTB基因的表達分析及亞細胞定位

柴文龍1金志強3賈彩紅2劉菊華2苗紅霞2張建斌2徐碧玉2

（1.海南大學農(nóng)學院，海口 570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海口571101；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院?？趯嶒炚?海南省香蕉遺傳改良重點實驗室，?？?570102）

利用熒光定量PCR分析在不同處理下的香蕉采后果實中MaBTB基因的表達，在正常成熟的果實中，MaBTB基因的表達與乙烯的釋放量呈正相關(guān)；相反，在1-MCP處理的香蕉果實中，該基因的表達相對變化不明顯；用乙烯處理的香蕉果實，其表達量在第3天達到高峰，比正常成熟的早11 d。這些結(jié)果表明MaBTB基因在香蕉采后果實中是受乙烯誘導表達的。最后，亞細胞定位分析表明MaBTB基因定位在細胞核上。

香蕉 MaBTB基因 表達分析 亞細胞定位

BTB/POZ（BR-C，ttk and bab or pox virus and zinc finger）家族蛋白是類Kuppel鋅指蛋白家族中的一種，廣泛地存在于從酵母到人類的各個物種中。它的發(fā)現(xiàn)要追溯到1994年，因最早在果蠅broadcomplex、tralntrack、bric-a-brac三個蛋白中發(fā)現(xiàn)而得名［1-3］。BTB蛋白并不是一類傳統(tǒng)意義上的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，而是一種既有轉(zhuǎn)錄激活作用又有轉(zhuǎn)錄抑制作用的蛋白［4-7］。它的主要特征是在N端含有BTB結(jié)構(gòu)域，絕大多數(shù)含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白通常包括其他的結(jié)構(gòu)域，如鋅指結(jié)構(gòu)域（Zinc finger domain），b-ZIP結(jié)構(gòu)域（Basic region-leucine zipper domain），MATH結(jié)構(gòu)域和錨蛋白重復（Ankyrin repeats）［8］。這些結(jié)構(gòu)域通過協(xié)同作用行使轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細胞骨架組織和染色質(zhì)的改變等生物學功能。植物中目前發(fā)現(xiàn)的含該結(jié)構(gòu)域的已知功能蛋白較少，但多具重要生物學功能。如擬南芥中的BPM蛋白參與調(diào)控脂肪酸代謝［9］，擬南芥中NPR1是植物抗性激素水楊酸的受體［10］，玉米中的MAB1調(diào)控紡錘體的長度和胞核特

性［11］，擬南芥中MATH-BTB參與調(diào)控ABA信號［12］，擬南芥中的LRB1和LRB2編碼的BTB1和BTB2蛋白對其光形態(tài)發(fā)生有強烈的影響［13］等。

香蕉是一種典型的躍變型果實，廣泛地分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。香蕉果實的乙烯釋放模式與其他躍變型果實不同，它在呼吸躍變前有一個突然上升和下降峰值。因此，香蕉中的乙烯釋放機制與其他躍變型果實的乙烯釋放機制不同［14］。為了研究香蕉果實成熟分子機制，我們利用抑制差減文庫分離克隆了采后成熟前差異表達基因［15］，獲得一個與香蕉果實成熟相關(guān)的BTB基因的cDNA片段。為了研究該基因是否與香蕉果實成熟和乙烯生物合成相關(guān)，克隆該基因的全長，利用熒光定量PCR分析該基因在乙烯生物合成不同時期的表達情況。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉（Musa acuminataL. AAA group cv.Brazilian）果實（開花后100-120 d）從中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所澄邁香蕉種植園獲得。選取成熟度一致的香蕉果實分為3組進行以下處理。正常成熟處理，將香蕉置于溫度25℃，相對濕度85%的三洋培養(yǎng)箱（SANYO MRL-350）中；外源乙烯處理，將香蕉果實放入密閉的保鮮盒中，并注射入100 μL /L的乙烯［14］，25℃放置18 h后開蓋，然后再將處理好的香蕉置于溫度25℃，相對濕度85%的三洋培養(yǎng)箱（SANYO MRL-350）中成熟；1-MCP處理：香蕉果實放入密封的保鮮盒中按1 μL /L的量秤取1-MCP粉末加水，25℃放置18 h后開蓋，然后再將處理好的香蕉置于溫度25℃，相對濕度85%的三洋培養(yǎng)箱（SANYO MRL-350）中成熟。處理的香蕉果實取樣用液氮速凍，于-75℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 乙烯釋放量的測定 果實乙烯釋放速率測定的方法如下：將3個果指放入體積為0.5 L的密封罐中，封罐3 h。用1 mL注射器抽出氣體，用日本島津GC2010型氣相色譜儀測定果實乙烯釋放速率，每個樣品測定3次。氣相色譜的工作條件為：火焰離子化檢測器（FID），載體為60-80目AI2O2，柱溫90℃，進樣氣溫度100℃，載氣為N2，流速為25 mL/min［16］。測定完成后，量取果實的體積和質(zhì)量，計算香蕉果實單位體積質(zhì)量下的乙烯的釋放速率。

1.2.2 RNA的提取和cDNA的合成 香蕉果實的總RNA提取采用改良的CTAB法［17］，第一鏈cDNA合成根據(jù)SMARTTMPCR cDNA試劑盒說明書進行。

1.2.3 熒光定量PCR分析MaBTB基因的表達 分別提取不同處理的香蕉果實總RNA。自然成熟：發(fā)育不同階段的果實分別采取同一植株雌花花序的第1輪、第4輪和第8輪子房（ov1、ov4和ov8）、采后0、2、6、10、12、14和16 d的果實；乙烯處理：0、1、2、3、4、5、6和7 d的果實；1-MCP處理：0、2、6、10、12、14和16 d的果實。利用SMART PCR cDNA試劑盒將200 ng的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用于熒光定量PCR的模板。

利用熒光定量PCR對MaBTB基因在香蕉不同處理下的表達進行分析。反應體系為：12.5 μL的2ⅹ SYBR Green PCR Master Mix，0.5 μL的 ROX，100 μg的反轉(zhuǎn)錄RNA。所用引物為：MaBTB5'：5'-AAACGGCTAATGGTTACAAG-3'（10 pmol）；MaBTB3'：5'-GTGACGCACATCCACAACTC-3'（10 pmol），actin5'：5'-CGAGGCTCAATCAAAGA-3'（10 pmol），actin3'：5'-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3'（10 pmol）。反應程序為：94℃預變性 3 min，94℃變性7 s，55℃ 退火15 s，72℃ 延伸20 s，40個循環(huán)。Actin作為內(nèi)對照。

1.2.4 MaBTB基因植物表達載體的構(gòu)建與亞細胞定位 為了分析MaBTB基因在細胞內(nèi)的定位情況，構(gòu)建了帶有報告基因GFP的熒光植物表達載體。用NcoI和SpeI分別雙酶切植物表達載體pCAMBIA1302和MaBTB目的片段。然后將目的片段和表達載體進行連接，獲得的即是pCAMBIA1302-MaBTB融合植物表達載體。亞細胞定位試驗中用只攜帶GFP的空載體作為陽性對照，水作為陰性對照。最后利用基因槍將該基因?qū)胙笫[表皮，26℃暗處培養(yǎng)18 h后在熒光顯微鏡下進行觀察。

2 結(jié)果

2.1 香蕉采后果實乙烯釋放量的測定

對香蕉果實采后不同處理下的乙烯釋放量進行了測定。研究發(fā)現(xiàn)（圖1），在自然成熟的香蕉果實中，

乙烯釋放量在采后8 d開始上升，到14 d時達到高峰，而后快速下降（圖1-A）。在乙烯處理的香蕉果實中，內(nèi)源乙烯在采后第1天開始產(chǎn)生，比自然成熟果實乙烯釋放量提早了7 d，并且在采后第3天達到高峰（圖1-B），比自然成熟果實的乙烯峰值提早了11 d，而且，乙烯處理的香蕉果實的乙烯釋放量最大值比自然成熟的香蕉果實的乙烯釋放量最大值高很多。1-MCP處理的香蕉果實的乙烯釋放量在采后14 d時開始釋放，并且沒有峰值出現(xiàn)（圖1-C）。

圖1 乙烯釋放量的測定

2.2 MaBTB基因在香蕉采后果實不同處理下的表達分析

利用實時熒光定量PCR方法對MaBTB基因在香蕉果實采后不同處理下的表達進行分析。結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，在乙烯處理的香蕉果實中，MaBTB基因在采后0到3 d表達量急劇上升。在自然成熟的香蕉果實中，該基因的表達最高峰與乙烯處理的表達最高峰時間不同，自然成熟的在采后第14天（圖3），乙烯處理的在采后第3天（圖2）。在1-MCP處理的香蕉果實中，在0-12 d內(nèi)表達量逐漸上升，沒有明顯的峰值，這種情況持續(xù)到采后第14天（圖4）。

圖2 MaBTB基因在香蕉果實乙烯處理下的表達

圖3 MaBTB基因在香蕉果實自然成熟中的表達

圖4 MaBTB基因在香蕉果實1-MCP處理下的表達

2.3 MaBTB基因植物表達載體的構(gòu)建與亞細胞定位

以含有MaBTB基因全長的質(zhì)粒為模板進行PCR擴增獲得的即是目的基因片段MaBTB（圖5）。再利用NcoI和SpeI雙酶切重組質(zhì)粒進行鑒定（圖6），

結(jié)果表明目的片段已插入表達載體中，測序表明該序列與目的基因一致，且與GFP的閱讀框都未發(fā)生變化，這些都表明載體構(gòu)建成功。

圖5 MaBTB基因PCR擴增

圖6 pCAMBIA1302-MaBTB 雙酶切鑒定

為了分析MaBTB基因的定位情況，將帶有熒光標記的表達載體轉(zhuǎn)入洋蔥表皮。觀察發(fā)現(xiàn)，陽性對照在洋蔥整個細胞中均有表達（細胞核和細胞質(zhì)中）（圖7-a，7-b），帶有MaBTB基因的GFP只在細胞核中表達（圖7-c，7-d）。而陰性對照則在細胞中沒有熒光出現(xiàn)（圖7-e，7-f）。

3 討論

在多數(shù)躍變型果實中，乙烯的釋放是在躍變時發(fā)生并且不斷增加，一直持續(xù)到果實成熟。香蕉作為典型的呼吸躍變型果實，其乙烯生物合成與其它躍變型果實的乙烯生物合成不同，在整個呼吸過程中，乙烯的釋放量有一個快速上升和快速下降的過程［14］。本研究中，在自然成熟條件下香蕉果實的躍變早期，乙烯沒有明顯的變化，在采后的10-14 d有一個快速升高的過程，在采后14 d達到高峰，在14-16 d有一個快速下降的過程。在乙烯處理的香蕉采后果實中，乙烯的生物合成立即被啟動，在整個成熟過程中均有乙烯的產(chǎn)生，且乙烯產(chǎn)生的高峰的出現(xiàn)比自然成熟的早了11 d。這表明外源乙烯加速了香蕉采后的成熟過程［14］。在1-MCP處理的香蕉采后果實中，乙烯的釋放幾乎完全被抑制。

圖7 洋蔥表皮細胞GFP熒光的觀察

用1-MCP處理的香蕉采后果實中，在呼吸躍變前MaBTB基因的表達量比在自然成熟中的表達量高，但其相對變化不明顯，這表明1-MCP沒有直接影響MaBTB基因的表達，可能在香蕉成熟過程中影響了其它的路徑。Inaba等［18］研究發(fā)現(xiàn)，在香蕉的綠熟期，1-MCP能抑制香蕉的成熟和推遲呼吸的到來。然而，當香蕉由綠轉(zhuǎn)黃的過程中，用1-MCP處理香蕉對其成熟則沒有影響。

MaBTB基因在3種處理下的表達分析表明該基因是受乙烯誘導表達的。在自然成熟的香蕉果實中MaBTB基因的最大表達量與乙烯高峰出現(xiàn)一致，同時該基因的表達量變化與乙烯釋放量的變化趨勢也是一致的。在乙烯處理的香蕉采后果實中，MaBTB基因的表達量迅速上升與乙烯的釋放趨勢一致。而在1-MCP處理的香蕉采后果實中，雖然乙烯的產(chǎn)生量幾乎被抑制，但MaBTB基因的表達量緩慢上升與乙烯的釋放趨勢相一致。這些結(jié)果都表明在香蕉果實采后成熟的過程中，MaBTB基因的表達是受乙烯調(diào)控的。MaBTB基因在乙烯處理、自然成熟和1-MCP處理的香蕉采后果實中的最大表達量分別為84.2%、17.1%和11.5%。外源乙烯處理下香蕉采后果實中MaBTB基因的最大表達量分別是自然成熟和1-MCP處理下的MaBTB基因的最大表達量的4.9和8.2倍。

這些結(jié)果有力地證明了外源乙烯促進了MaBTB基因的表達。雖然內(nèi)源乙烯的釋放量在第3天達到高峰，與MaBTB基因的表達量趨勢一致，但是在乙烯處理下的香蕉采后果實中MaBTB基因的表達量的變化趨勢比在自然成熟條件下的要迅速。前人研究表明［14］，在自然成熟和乙烯處理的香蕉果實中，乙烯釋放量不同，可能是在乙烯合成中有不同的機制參與引起的。Weber和Hellma［19］研究表明BPM（BTB/POZMATH）蛋白可以與乙烯的反應因子家族作用，這或許代表著另外一種轉(zhuǎn)錄機制。香蕉MaBTB基因在不同處理中的不同表達結(jié)果可能與不同的調(diào)控機制有關(guān)，這需要進一步的研究證明。

利用洋蔥表皮進行亞細胞定位觀察基因的定位情況是一種公認的試驗方法［20，21］。綠色熒光蛋白GFP在原核或真核細胞中表達后，可在藍光或紫光的激發(fā)下產(chǎn)生明亮的綠色熒光。本研究以基因槍轟擊的方式將構(gòu)建好的重組表達載體導入洋蔥表皮細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MaBTB-GFP融合蛋白在洋蔥細胞核內(nèi)表達。這表明MaBTB基因編碼的蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄因子在細胞內(nèi)直接或間接參與一些功能基因的啟動表達。

本研究通過初步探究MaBTB基因的表達與乙烯的生物合成的關(guān)系，可以為進一步研究該基因功能提供線索和思路。然而對于該基因的具體功能的闡述則需要進行更深入的研究。

4 結(jié)論

本研究利用熒光定量PCR方法對在自然成熟，乙烯處理和1-MCP處理等條件下的香蕉采后果實中的MaBTB基因進行表達分析，結(jié)果表明MaBTB基因在香蕉采后果實中是受乙烯誘導表達的。亞細胞定位分析，表明MaBTB基因是定位在細胞核上。

［1］ Zollman S, Godt D, Prive GG, et al. The BTB domain, found primarily in zinc finger proteins, defines an evolutionarily conserved family that includes several developmentally regulated genes in Drosophila［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91（22）：10717-10721.

［2］ Harriison SD, Travers AA. The tramtrack gene encodes a Drosophila finger protein that interacts with the ftz transcriptional regulatory region and shows a novel embryonic expression pattern［J］. EMBO J, 1990, 9（1）：207-216.

［3］ DiBello PR, Withers DA, Bayer CA, et al. The Drosophila Broadcomplex encodes a family of related proteins containing zinc fingers［J］. Genetics, 1991, 129（2）：385-397.

［4］ Kelly KF, Otchere AA, Graham M, et al. Nuclear import of the BTB /POZ transcriptional regulator［J］. Kaiso J Cell Sci, 2004, 117（Pt25）：6143-6152.

［5］ Li X, Peng H, Schulzt DC, et al. Structure-function studies of the BTB /POZ transcriptional repression domain from the Promyelocytic leukemia zinc finger oncoprotein［J］. Cancer Res, 1999, 59（20）：5275-5282.

［6］ Phan RT, Dalla-Favera R. The BCL6 proto-oncogene suppresses p53 expression in germinal-centre B cells［J］. Nature, 2004, 432：635-639.

［7］ Takenga M, Hatano M, Takamori M, et al. Bcl6-dependent transcriptional repression by BAZF［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 303（2）：600-608.

［8］ Albagli O, Dhordain P, Deweindt C, et al. The BTB /POZ domain：a new protein interaction motif common to DNA-and actin-binding proteins［J］. Cell Growth Differ, 1995, 6（9）：1193-1198.

［9］ Chen LY, Lee JH, Weber H, et al. Arabidopsis BPM proteins function as substrate adaptors to a cullin3-based E3 ligase to affect fatty acid metabolism in plants［J］. Plant Cell, 2013, 25：2253-2264.

［10］ Wu Y, Zhang D, Chu JY, et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid［J］. Cell Reports, 2012, 1：639-647.

［11］ Jurani? M, Srilunchang KO, Krohn NG, et al. Germline-specific MATH-BTB substrate adaptor MAB1 regulates spindle length and nuclei identity in maize［J］. Plant Cell, 2012, 24：4974-4991.

［12］ Lechner E, Leonhardt N, Eisler H, et al. MATH/BTB CRL3 receptors target the homeodomain-leucine zipper ATHB6 to modulate abscisic acid signaling［J］. Developmental Cell, 2011, 21：1116-1128.

［13］ Christians MJ, Gingerich DJ, Hua ZH, et al. The light-response BTB1 and BTB2 proteins assemble nuclear ubiquitin ligases that modify phytochrome B and D signaling in Arabidopsis［J］. Plant Physiology, 2012, 160：118-134.

［14］ Liu X, Shiomi S, Nakatsuka A, et al. Characterization of ethylene biosynthesis associated with ripening in banana fruit［J］. Plant

Physiol, 1999, 121：1257-1265.

［15］ Xu B, Su W, Liu J, et al. Differentially expressed cDNAs at the early stage of banana ripening identified by suppression subtractive hybridization and cDNA microarray［J］. Planta, 2007, 226：529-539.

［16］ 胡位榮, 朱西儒, 王正詢.香蕉果實采后及貯藏的效應及其生理研究進展［J］.廣州大學學報, 2003（3）：228-234.

［17］ Asif MH, Dhawan P, Nath P. A simple procedure for the isolation of high quality RNA from ripening banana fruit［J］. Plant Mol Biol Rep, 2000, 18：18（2）：109-115.

［18］ Inaba A, Liu X, Yokotani N, et al. Differential feedback regulation of ethylene biosynthesis in pulp and peel tissues of banana fruit［J］. J Exp Bot, 2007, 58：1047-1057.

［19］ Weber H, Hellmann H. Arabidopsis thaliana BTB/POZ-MATH proteins interact with members of the ERF/AP2 transcription factor family［J］. FEBS J, 2009, 276：6624-6635.

［20］ Hanson MR, K?hler RH. GFP imaging：methodology and application to investigate cellular compartmentation in plants［J］. J Exp Bot, 2001, 52：529-538.

［21］ Wang C, Yang Q, Wang C. Isolation and functional characterization of ZmDBP2 encoding a dehydration-responsive element-binding protein in Zea mays［J］. Plant Mol Biol Rep, 2011, 29：60-68.

（責任編輯 狄艷紅）

Expression Analysis and Subcellular Localization of the MaBTB Gene in Banana

Chai Wenlong1Jin Zhiqiang3Jia Caihong2Liu Juhua2Miao Hongxia2Zhang Jianbin2Xu Biyu2
（1. Department of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228；2. Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops，Ministry of Agriculture，Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101；3. Haikou Experimental Station，Institute of Banana，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 570102）

Real-time quantitative PCR of postharvest banana revealed that MaBTB exhibited differential expression patterns that are associated with ethylene biosynthesis. In naturally ripened bananas, expression of MaBTB was in accordance with ethylene biosynthesis. In contrast, for 1-methylcyclopropene-treated bananas, MaBTB expression levels remained constant. Following treatment with ethylene, MaBTB expression in banana fruit significantly increased with ethylene biosynthesis and peaked 3 d after harvest, which was 11 d earlier than that for naturally ripened banana fruits. These results suggested that MaBTB expression was induced by ethylene for regulation of postharvest banana ripening. Finally, subcellular localization assays showed that the MaBTB protein localizes to the nucleus.

Banana（Musa acuminata L. AAA group） MaBTB gene Expression analysis Subcelluar localization

2013-09-23

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務專項（ITBB110216），海南省重大科技項目子課題（ZDZX2013023-1）

柴文龍，男，碩士研究生，研究方向：作物遺傳育種；E-mail：chaiwl2012@163.com

徐碧玉，女，研究員，博士生導師，研究方向：香蕉生物技術(shù)；E-mail：biyuxu@126.com