• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    香山黃櫨葉片內(nèi)生細菌的分離與鑒定

    2014-03-17 11:46:51左山,劉洋,周肖紅
    生物技術通報 2014年1期
    關鍵詞:黃櫨桿菌屬香山

    香山黃櫨葉片內(nèi)生細菌的分離與鑒定

    左山1劉洋2周肖紅3沈悅1李哲1彭程1陳亮3程池2
    (1. 北京市廣渠門中學,北京 100062;2. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,北京 100027;3. 北京市香山公園管理處,北京 100093)

    通過微生物培養(yǎng)方法對北京香山黃櫨葉片內(nèi)生細菌進行分離及篩選,共得到81株內(nèi)生細菌,經(jīng)形態(tài)學觀察、16S rDNA擴增及系統(tǒng)發(fā)育分析,將其歸為變形菌門(Proteobacteria)中的歐文氏菌屬(Erwinia)和志賀氏菌屬(Shigella);厚壁菌門(Firmicutes)中的芽孢桿菌屬(Bacillus)、柯恩氏菌屬(Cohnella)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)和葡萄球菌屬(Staphylococcus);放線菌門(Actinobacteria)中的短小桿菌屬(Curtobacterium)。這是國內(nèi)外首次利用培養(yǎng)方法針對黃櫨葉片內(nèi)生細菌進行研究的報道。

    黃櫨 葉 內(nèi)生細菌 培養(yǎng)方法

    植物內(nèi)生細菌是指能定殖在健康植物組織內(nèi),并與植物建立和諧聯(lián)合關系的一類微生物,它們可以通過生物防治、植物促生和內(nèi)生固氮等作用直接或者間接影響植物的生長發(fā)育,是植物維持自身健康生長與適應環(huán)境的重要因素之一[1]。目前認為,植物內(nèi)生細菌與植物生長發(fā)育、抗病害能力、功效性成分產(chǎn)生以及生境生態(tài)平衡穩(wěn)定都具有重要作用,成為當前微生物生態(tài)學研究的一個熱點領域[1]。

    黃櫨是優(yōu)良的秋季紅葉樹種,也是我國長江流域、華北、華中地區(qū)常見的荒山綠化樹種,具有生長強健及耐貧瘠等特性。黃櫨(Cotinus coggygriavar.cinerea)是構(gòu)成香山紅葉景觀的主體樹種,香山

    1 材料與方法

    1.1 材料

    黃櫨葉片于2013年7月采集自北京市香山公園,

    具體位置為東經(jīng)116.19°,北緯39.99°,海拔181 m。采集所得樣品于4℃保存。

    1.2 方法

    1.2.1 培養(yǎng)基及試劑 LB及R2A成品培養(yǎng)基,購自北京陸橋公司;細菌基因組DNA提取試劑盒及PCR相關試劑購自TIANGEN公司;PCR引物由北京諾賽生物公司合成。

    1.2.2 樣品表面滅菌 稱取1 g葉片樣品,并用無菌水沖洗,之后依次用70%乙醇,次氯酸鈉溶液(2.5%有效Cl-),70%乙醇浸泡3 min,5 min,30 s,再用無菌水淋洗6次,并于無菌條件下晾干;同時取最后一次淋洗水120 μL涂于LB固體培養(yǎng)基平板上,28℃培養(yǎng)72 h,以檢測表面滅菌效果[3]。

    1.2.3 內(nèi)生細菌的分離與純化 采用劉琳等[4]方法進行。將表面滅菌處理的黃櫨葉片置于無菌研缽中研磨成粉末,然后依次用無菌水稀釋成濃度為10-1、10-2和10-3懸液。分別取200 μL涂布于R2A和LB平板上,每個處理3個平行。28℃培養(yǎng)2-3 d。根據(jù)菌落形態(tài)(大小、形狀、顏色、表面光澤度、邊緣整齊度、透明度等),隨機挑取平板上具有差異的代表性菌落,純化后將其接種于斜面培養(yǎng)基,并4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.4 內(nèi)生細菌的16S rDNA序列分析 采用細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)提取菌株基因組DNA作為PCR反應的模板。采用細菌通用引物27F(5'-AGAGTTTCATCTGGCTCAG-3') 和1 492R(5'-GGTTACCTTGTTACGAC-TT-3')[5]對菌株16S rDNA片段進行PCR擴增。PCR反應體系(50 μL):10×buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)4 μL、引物27F(10 mmol/L)1 μL、引物1 492R(10 mmol/L)1 μL、Taq酶(5 U/L)0.25 μL、DNA模板3 μL、ddH2O補足至50 μL。PCR反應程序:94℃ 5 min;94℃ 1 min,55℃ 1 min,72℃ 1 min,30個循環(huán);72℃ 10min。1%瓊脂糖檢測凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

    1.2.5 核糖體DNA擴增片段限制性內(nèi)切酶分型(Amplifed ribosomal DNA restriction analysis,ARDRA) 用HaeIII(TaKaRa)和Hin6I(TaKaRa)兩種內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進行酶切分型,兩種酶帶型完全一致則認為是同一種或同一類型的細菌[4]。酶切反應體系為 0.4 μL內(nèi)切酶HaeIII(或Hin6I),1.5 μL酶切緩沖液,400 ng PCR產(chǎn)物,最后加滅菌水至15 μL。37℃ 酶切4 h,1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段,100 V電泳60 min。比較各菌株的酶切圖譜并歸類。

    1.2.6 細菌16S rDNA序列測定與同源性比對 經(jīng)ARDRA 初步分型,選取代表菌株進行16S rDNA 全長片段進行擴增(引物及方法同上)。PCR擴增產(chǎn)物約1.5 kb,采用ABI 3730型DNA測序儀測序,將序列信息提交至NCBI,并將測序得到的結(jié)果在EzTaxon server 2.1進行比對[6],確定與已知序列的同源關系。

    2 結(jié)果

    2.1 黃櫨葉片內(nèi)生細菌分離及基因組DNA提取

    通過傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng),共獲得黃櫨葉片內(nèi)生細菌81株。利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取黃櫨葉片內(nèi)生細菌基因組DNA,1%凝膠電泳結(jié)果(圖1)顯示總DNA大小約為23 kb。

    圖1 部分黃櫨葉片內(nèi)生細菌的基因組DNA

    2.2 黃櫨葉片內(nèi)生細菌16S rDNA PCR擴增及ARDRA 分型

    采用細菌通用引物27F和1492R對黃櫨葉片內(nèi)生細菌16S rDNA 進行PCR擴增,得到長度約1 500 bp的擴增片段,圖2為部分細菌的16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖譜。將擴增的 PCR 產(chǎn)物用HaeIII和Hin6I兩種內(nèi)切酶進行酶切分型(ARDRA分型),將兩個酶切圖譜類型完全相同的細菌劃分為一個操作分類

    單元(Operational taxonomy unit,OTU)(圖3)。每種OTU選定1-2個代表菌株再次進行16S rDNA PCR擴增以備用測序。

    圖2 部分黃櫨內(nèi)生細菌的16S rDNA片段擴增結(jié)果

    圖3 部分黃櫨內(nèi)生細菌的ARDRA酶切分型結(jié)果

    2.3 黃櫨葉片內(nèi)生細菌多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析

    黃櫨葉片內(nèi)生細菌的16S rDNA序列比對及其群落多樣性分析結(jié)果如表1所示。經(jīng)16S rDNA序列比對及其系統(tǒng)發(fā)育分析(圖4),內(nèi)生細菌群落共包含11個OTU,分屬變形菌門(Proteobacteria)中的歐文氏菌屬(Erwinia)和志賀氏菌屬(Shigella);厚壁菌門(Firmicutes)中的芽孢桿菌屬(Bacillus)、柯恩氏菌屬(Cohnella)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)和葡萄球菌屬(Staphylococcus);放線菌門(Actinobacteria)中的短小桿菌屬(Curtobacterium)。在所分離的得到的81株內(nèi)生細菌中,厚壁菌門(Firmicutes)為優(yōu)勢菌門;芽孢桿菌屬(Bacillus)及葡萄球菌屬(Staphylococcus)為優(yōu)勢菌屬,豐度分別為53.09%和30.86%。其中,R-54所代表的OTU為該黃櫨葉片內(nèi)生細菌群落中的第一優(yōu)勢種群;L-20所代表的OTU為該黃櫨葉片內(nèi)生細菌群落中的第二優(yōu)勢種群(表1)。

    表1 黃櫨葉片內(nèi)生細菌多樣性統(tǒng)計

    3 討論

    植物內(nèi)生細菌[7-11]存在于植物的根、莖、葉、花果實及種子中[12,13],其中不乏一些能夠?qū)χ参锷L和健康起到直接或者間接促進作用的細菌種類,已有很多關于這些有益內(nèi)生細菌生態(tài)功能的報道,其中對植物的直接促生作用主要包括生物固氮[14,15]、分泌和誘導產(chǎn)生植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)[16,17]、改善植物對礦物質(zhì)的利用率[18]及改變宿主植物對霜凍等有害環(huán)境條件的敏感性等[19,20]。對植物具有間接促生作用有益內(nèi)生細菌的生態(tài)功能主要是植物內(nèi)生細菌的生防作用,到目前為止已從眾多植物體中分離得到了具有良好抑制效果的植物內(nèi)生細菌[12,15,21,22]。

    本研究自北京香山紅葉景觀的主體樹種—黃櫨葉片中分離培養(yǎng)得到7個內(nèi)生細菌菌屬,其中以芽孢桿菌屬(Bacillus)最為優(yōu)勢,該屬中許多細菌種類是常見的植物促生細菌[23]。本研究分離得到的菌株L-21所對應的最近緣菌種Bacillus aryabhattai是拮抗煙草黑脛?。≒hytophthora parasiticavar.nicotianae)的生防菌[24];R-15所對應的最近緣菌種蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)是目前世界上產(chǎn)量最大、使用最廣的生物殺蟲劑,對鱗翅目、鞘翅

    目、雙翅目、膜翅目和同翅目等昆蟲,以及動植物線蟲、蜱螨等節(jié)肢動物都有特異性的毒殺活性,而對非目標生物具有較高的安全性,因此在國內(nèi)外植物保護相關領域的科研與實踐中備受人們關注[25]。此外,菌株R-22所對應的最近緣菌種解木聚糖類芽孢桿菌(Paenibacillus xylanilyticus)對由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)所引起的棉花黃萎病具有明顯的拮抗作用,可用于棉花黃萎病的生物防治[26]。類芽孢桿菌屬中不乏具有生防促生作用的細菌種類,宋未等(2007)自水稻根際分離得到多黏類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)WY110,該菌對水稻的三種主要病原菌——稻瘟病、水稻紋枯病及水稻白葉枯病均具有很高的體外特異性拮抗活性,且拮抗譜較寬,并兼具固氮活性及生產(chǎn)生長素作用,在溫室實驗中表現(xiàn)較好的植株防病效果,普遍達到50%以上,具有良好的研究與應用價值[27]。宋順華等[28]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)多黏類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)WY110對西瓜枯萎病亦有良好的防治作用。本課題組新近自諾尼(Morinda citrifoliaL.)植物中分離獲得類芽孢桿菌CICC 10580,其對小麥根腐病、稻瘟病菌及棉花黃萎病等多種病原真菌具有明顯的拮抗作用(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。

    圖4 鄰接法(N-J)構(gòu)建黃櫨葉片內(nèi)生細菌16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

    由此可見,香山黃櫨葉片內(nèi)生細菌群落中存在有益細菌資源。因此,利用多種培養(yǎng)條件進一步分離篩選其內(nèi)生細菌,以獲得種類更為豐富的內(nèi)生菌資源,為進一步研究其中的有益功能菌種與黃櫨植物的生長健康及其景觀效果之間的相關性奠定了微生物資源基礎。

    4 結(jié)論

    國內(nèi)外首次利用微生物培養(yǎng)方法分離篩選黃櫨葉片的內(nèi)生細菌,分屬變形菌門中的歐文氏菌屬和志賀氏菌屬,厚壁菌門中的芽孢桿菌屬、柯恩氏菌屬、類芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬,放線菌門中的短小桿菌屬,其中包含植物生防促生細菌種類。

    [1] 劉洋, 左山, 鄒媛媛, 等. 雜交玉米農(nóng)大108及其親本種子內(nèi)生細菌群落多樣性的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2011, 44(23):4763-4771.

    [2] 宋立洲, 杜萬光, 李維維. 香山公園黃櫨枯萎病防治技術研究[J]. 北京園林, 2011, 27(96):51-56.

    [3] Liu Y, Zuo S, Zou YY, et al. Investigation on diversity and population succession dynamics of endophytic bacteria from seeds of maize(Zea mays L., Nongda108)at different growth stages[J]. Annals

    of Microbiology, 2013, 63:71-79.

    [4] 劉琳, 劉洋, 宋未. 雜交水稻種子固有細菌群落多樣性探究[J]. 生物技術通報, 2009(1):95-99.

    [5] Liu Y, Liu L, Qiu FB, et al. Paenibacillus hunanensis sp. nov., isolated from rice seeds[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2010, 60:1266-1270.

    [6] Chun J, Lee JH, Jung Y, et al. EzTaxon:a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences[J]. In J Syst Evol Microbiol, 2007, 57:2259-2261.

    [7] 陳聲明, 林海萍, 張立欽. 微生物生態(tài)學導論[J]. 北京:高等教育出版社, 2007:4-5.

    [8] 康白. 正常微生物生態(tài)學研究進展[J].大連醫(yī)科大學學報, 1984, 6:116-126.

    [9] 蔡元呈. 植物微生態(tài)學與植物微生態(tài)制劑的應用[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報, 2002, 10(2):106-108.

    [10] 梅汝鴻. 植物微生態(tài)學的定義[J]. 中國微生態(tài)學雜志, 1991, 3(2):94-96.

    [11] Beattie GA. Survey, molecular phylogeny, genomics and recent advances[M]// Gnanamanickam SS. Plant-associated bacteria. Dordrecht:Spring, 2006:1-56.

    [12] Sturz AV, Christie BR, Nowak J. Bacterial endophytes:potential role in developing sustainable systems of cropproduction[J]. Crit Rev Plant Sci, 2000, 19(1):1-30.

    [13] 鮑敏, 康明浩. 植物內(nèi)生菌研究發(fā)展現(xiàn)狀[J]. 青海草業(yè), 2011, 20(1):21-25.

    [14] Azevedo JL, Water MJ, Jose OP, et al. Endophytic microorganisms:a review on insect control and recent advances on tropical plants[J]. Electronic J Biotechnol, 2000, 3(1):40-65.

    [15] 何紅, 邱思鑫, 胡方平, 等. 植物內(nèi)生細菌生物學作用研究進展[J]. 微生物學雜志, 2004, 24(3):40-45.

    [16] Pan B, Vessey JK. Response of the endophytic diazotroph Gluconacetobacter diazotrophicus on solid media to changes in atmospheric partial O2pressure[J]. Appl Environ Microbiol, 2001, 67(10):4694-4700.

    [17] Lazarovits G, Nowak J. Rhizobacteria for improvement of plant growth and establishment[J]. Hortscience, 1997, 32:188-192.

    [18] Murty MG, Ladha JK. Influence of Azospirillum inoculation on the mineral uptake and growth of rice under hytroponic conditions[J]. Plant Soil, 1988, 108:281-285.

    [19] Xu H, Griffith M, Patten CL, et al. Isolation and characterization of an antifreeze protein with ice nucleation activity from the plant growth promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2[J]. Can J Microbiol, 1998, 44:64-73.

    [20] 蔡學清, 林彩萍, 何紅, 等. 內(nèi)生枯草芽孢桿菌BS-2對水稻苗生長的效應[J]. 福建農(nóng)林大學學報:自然科學版, 2005, 34(2):189-194.

    [21] Zehnder GW, Murphy JF, Sikora EJ, et al. Application of rhzobacteria for induced resistance[J]. Eur J Plant Pathol, 2001, 107:39-50.

    [22] 楊海蓮, 孫曉璐, 宋未. 植物根際促生細菌和內(nèi)生細菌的誘導抗病性的研究進展[J]. 植物病理學, 2000, 30(2):106-110.

    [23] Lucy M, Reed E, Glick BR. Applications of free living plant growthpromoting rhizobacteria[J]. Antonie Van Leeuwenhoke, 2004, 86:1-25.

    [24] 馮云利, 奚家勤, 馬莉, 等. 烤煙品種NC297內(nèi)生細菌中拮抗煙草黑脛病的生防菌篩選及種群組成分析[J]. 云南大學學報:自然科學版, 2011, 33(4):488-496.

    [25] 喻子牛, 王階平, 何進. 蘇云金芽孢桿菌基因組研究[J]. 微生物學雜志, 2013, 33(2):1-6.

    [26] 周燚, 楊廷憲, 王斌先, 等. 棉花內(nèi)生拮抗菌Paenibacillus xylanilyticus YUPP-1抗黃萎病研究[J]. 棉花學報, 2012, 24(1):71-77.

    [27] 王云山, 韓繼剛, 楊海蓮, 等. 水稻生防新菌株多粘類芽孢桿菌WY110的分離篩選和鑒定[M]//朱昌雄.農(nóng)業(yè)生物資源與環(huán)境調(diào)控. 北京:中國農(nóng)業(yè)科學技術出版社, 2007:271-281.

    [28] 宋順華, 吳萍, 邢寶田, 等. 多粘類芽孢桿菌WY110對西瓜枯萎病的控制作用[J]. 植物保護學報, 2011, 38(6):571-572.

    (責任編輯 狄艷紅)

    Isolation and Identification of Endophytic Bacteria in Leaf from Xiangshan Smoke Tree( Cotinus coggygria var. cinerea)

    Zuo Shan1Liu Yang2Zhou Xiaohong3Shen Yue1Li Zhe1Peng Cheng1Chen Liang3Cheng Chi2
    (1. Beijing Guang Qumen Middle School,Beijing 100062;2. China Center of Industrial Culture Collection,China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100027;3. Beijing Xiangshan Park Management Office,Beijing 100093)

    The endophytic bacteria in leaf of Xiangshan smoke tree were isolated, screened and identified by the microbial culturedependent method combing with morphological observation, 16S rDNA amplification and phylogenetic analysis, indicated that the total 81 strains from the leaves were clustered into 7 genus:Erwinia and Shigella, Bacillus, Cohnella, Paenibacillus and Staphylococcus, and Curtobacterium belonging to Proteobacteria, Firmicutes and Actinobacteria, respectively. This is the first report about investigation on the endophytic bacteria in leaf of Xiangshan smoke tree using culture-dependent method.

    Smoke tree Leaf Endophytic bacteria Culture-dependent method公園面積約160 hm2,黃櫨數(shù)量約10萬余株,主要分布于香山馬蹄形山坳的西南部[2]。近年來,香山紅葉的培育和病害防治引起廣泛關注。本項目首次以香山黃櫨葉片為研究對象,采用微生物培養(yǎng)方法和分子生物學技術對其內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性進行分析,為進一步研究這些內(nèi)生細菌菌種的生物學功能,以及香山紅葉植物的生長健康與病害防治奠定微生物資源基礎。

    2013-09-04

    北京市青少年科學探索專項資金項目,中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院科技發(fā)展基金(博士基金)項目(2012KJFZ-BS-01)

    左山,女,碩士,研究方向:植物微生物生態(tài)學,E-mail:zuoshanwork@163.com;劉洋同為本文第一作者

    程池,男,教授級高工,博士生導師,研究方向:微生物學;E-mail:cheng100027@163.com

    猜你喜歡
    黃櫨桿菌屬香山
    北京香山
    東方少年(2022年28期)2022-11-23 07:10:02
    潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道菌群分布特征分析
    游香山
    香山名字的由來
    它曾是皇帝的御用染料
    大美石景山 仙氣十足的黃櫨花步道帶你穿越
    養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床芽胞桿菌空間生態(tài)位特性
    香山峰會的新期待
    商周刊(2018年15期)2018-07-27 01:41:14
    香山二老
    中華奇石(2014年2期)2014-07-09 18:23:15
    類芽孢桿菌屬β-葡萄糖苷酶在大腸桿菌中可溶性重組表達的優(yōu)化
    a级毛片黄视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 丁香六月欧美| 黄色怎么调成土黄色| 国产激情久久老熟女| 成人影院久久| xxxhd国产人妻xxx| 国产99久久九九免费精品| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 看片在线看免费视频| 黄色成人免费大全| 一a级毛片在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 丝袜美足系列| 国产深夜福利视频在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久性视频一级片| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 午夜两性在线视频| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲av熟女| 性欧美人与动物交配| 9191精品国产免费久久| 色在线成人网| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产极品粉嫩免费观看在线| xxx96com| 老司机在亚洲福利影院| 欧美黑人精品巨大| a在线观看视频网站| 午夜久久久在线观看| www日本在线高清视频| 国产三级在线视频| 在线永久观看黄色视频| 免费观看人在逋| 两人在一起打扑克的视频| 91精品国产国语对白视频| 国产99白浆流出| 精品乱码久久久久久99久播| 99在线视频只有这里精品首页| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产av一区在线观看免费| 欧美不卡视频在线免费观看 | 久久影院123| 国产精品免费视频内射| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 欧美色视频一区免费| 人人澡人人妻人| 一区二区三区激情视频| 啦啦啦 在线观看视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产精品电影一区二区三区| 999久久久精品免费观看国产| 欧美黄色片欧美黄色片| 精品熟女少妇八av免费久了| 色综合婷婷激情| www.自偷自拍.com| 免费观看人在逋| 成年女人毛片免费观看观看9| 美国免费a级毛片| 欧美+亚洲+日韩+国产| 视频区欧美日本亚洲| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美乱色亚洲激情| 一区福利在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 精品久久久久久久毛片微露脸| 性少妇av在线| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产精品 国内视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 国产黄色免费在线视频| 国产精品电影一区二区三区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美成人午夜精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 老司机午夜十八禁免费视频| 757午夜福利合集在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲色图综合在线观看| www.自偷自拍.com| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 最新美女视频免费是黄的| 天堂俺去俺来也www色官网| 欧美黑人欧美精品刺激| 后天国语完整版免费观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 99久久综合精品五月天人人| 手机成人av网站| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 狂野欧美激情性xxxx| 老司机亚洲免费影院| avwww免费| 1024视频免费在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲av熟女| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美成人午夜精品| 国产成人精品在线电影| 首页视频小说图片口味搜索| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久精品影院6| 人人妻人人澡人人看| 日韩免费高清中文字幕av| 一a级毛片在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 后天国语完整版免费观看| 亚洲avbb在线观看| 亚洲午夜理论影院| 国产1区2区3区精品| 女性被躁到高潮视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 欧美在线一区亚洲| 99香蕉大伊视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美日韩av久久| 亚洲 国产 在线| avwww免费| 露出奶头的视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 午夜两性在线视频| 精品电影一区二区在线| 一区福利在线观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 一级毛片高清免费大全| 国产av一区二区精品久久| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美国产精品va在线观看不卡| 免费av毛片视频| 男人操女人黄网站| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产又爽黄色视频| 超色免费av| 国产激情欧美一区二区| 久久狼人影院| 久久九九热精品免费| 窝窝影院91人妻| 在线视频色国产色| tocl精华| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲片人在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 在线观看舔阴道视频| 日本 av在线| 国产精品成人在线| 色综合婷婷激情| av在线播放免费不卡| 91国产中文字幕| 亚洲性夜色夜夜综合| 少妇的丰满在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 久久中文看片网| 一进一出抽搐动态| 激情在线观看视频在线高清| 色综合站精品国产| 一级片'在线观看视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 午夜福利在线免费观看网站| 高清在线国产一区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产精品久久视频播放| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 日韩欧美一区视频在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 欧美不卡视频在线免费观看 | 亚洲一区二区三区不卡视频| 午夜a级毛片| 久久香蕉激情| 欧美不卡视频在线免费观看 | 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲精品一二三| 69精品国产乱码久久久| 午夜激情av网站| 在线天堂中文资源库| 女人被狂操c到高潮| 成人特级黄色片久久久久久久| 极品教师在线免费播放| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美日本亚洲视频在线播放| 男人操女人黄网站| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲精品一二三| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 日本免费a在线| 久久热在线av| 欧美日本亚洲视频在线播放| 麻豆国产av国片精品| 不卡av一区二区三区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 一级片'在线观看视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 交换朋友夫妻互换小说| 99国产精品99久久久久| 在线永久观看黄色视频| 大码成人一级视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产黄色免费在线视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 一二三四社区在线视频社区8| 在线av久久热| 男人舔女人的私密视频| 国产精品偷伦视频观看了| 精品久久久精品久久久| 亚洲男人天堂网一区| www国产在线视频色| 麻豆久久精品国产亚洲av | 亚洲一区二区三区色噜噜 | 热re99久久国产66热| 午夜a级毛片| 99久久国产精品久久久| 999精品在线视频| 亚洲av熟女| 一级毛片高清免费大全| 另类亚洲欧美激情| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产成人影院久久av| 咕卡用的链子| 国产三级黄色录像| 两个人看的免费小视频| 啦啦啦免费观看视频1| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 91精品三级在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 色哟哟哟哟哟哟| 交换朋友夫妻互换小说| 99国产精品一区二区三区| 在线天堂中文资源库| 色尼玛亚洲综合影院| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产精华一区二区三区| 国产精品1区2区在线观看.| 黄色视频,在线免费观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 欧美午夜高清在线| 99riav亚洲国产免费| 欧美大码av| 一区二区三区国产精品乱码| 一级黄色大片毛片| 久久99一区二区三区| 看黄色毛片网站| 亚洲av美国av| 久久久国产成人精品二区 | 老司机午夜福利在线观看视频| 久久久久久人人人人人| 18美女黄网站色大片免费观看| 午夜91福利影院| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 欧美激情极品国产一区二区三区| 人人澡人人妻人| 国产主播在线观看一区二区| 久久久国产一区二区| 亚洲少妇的诱惑av| 黄色片一级片一级黄色片| 在线观看www视频免费| av网站免费在线观看视频| 久久精品国产综合久久久| 久久精品影院6| www.熟女人妻精品国产| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 午夜精品在线福利| 亚洲精品在线美女| 桃红色精品国产亚洲av| 色老头精品视频在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 日日夜夜操网爽| 宅男免费午夜| 国产亚洲欧美精品永久| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 精品乱码久久久久久99久播| 超色免费av| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 欧美黄色片欧美黄色片| 性少妇av在线| 超碰成人久久| 日本黄色日本黄色录像| 99久久国产精品久久久| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 大型黄色视频在线免费观看| 国产欧美日韩一区二区三| 波多野结衣一区麻豆| 在线国产一区二区在线| 久久中文看片网| 自线自在国产av| 麻豆av在线久日| 香蕉久久夜色| 亚洲,欧美精品.| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品日韩av在线免费观看 | 国产一区二区三区在线臀色熟女 | av欧美777| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久精品影院6| 狂野欧美激情性xxxx| 在线观看www视频免费| 最近最新中文字幕大全免费视频| 日韩大尺度精品在线看网址 | 久久天堂一区二区三区四区| 很黄的视频免费| 午夜两性在线视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 精品第一国产精品| 成人三级黄色视频| 操出白浆在线播放| 色婷婷久久久亚洲欧美| 1024香蕉在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 真人做人爱边吃奶动态| 精品国产美女av久久久久小说| bbb黄色大片| 少妇 在线观看| 99国产综合亚洲精品| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 男女午夜视频在线观看| 久久九九热精品免费| netflix在线观看网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产麻豆69| 欧美精品亚洲一区二区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 99香蕉大伊视频| 男男h啪啪无遮挡| 精品国产美女av久久久久小说| 国产成人欧美在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 高清毛片免费观看视频网站 | 亚洲少妇的诱惑av| 国产成人影院久久av| 无限看片的www在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| www.熟女人妻精品国产| 国产xxxxx性猛交| 日本一区二区免费在线视频| 午夜91福利影院| 亚洲,欧美精品.| 中出人妻视频一区二区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 成人亚洲精品av一区二区 | 国产极品粉嫩免费观看在线| 不卡av一区二区三区| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产主播在线观看一区二区| 中文字幕人妻熟女乱码| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久中文看片网| 人人妻人人澡人人看| 水蜜桃什么品种好| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 三上悠亚av全集在线观看| 黄频高清免费视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 日韩精品青青久久久久久| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 日日夜夜操网爽| 亚洲精品在线观看二区| 国产精华一区二区三区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| av有码第一页| 伦理电影免费视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 久久午夜亚洲精品久久| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 窝窝影院91人妻| 午夜免费观看网址| 两人在一起打扑克的视频| 动漫黄色视频在线观看| 在线天堂中文资源库| 性少妇av在线| 日韩精品中文字幕看吧| 午夜免费观看网址| 欧美日韩一级在线毛片| 91九色精品人成在线观看| 国产又爽黄色视频| 视频在线观看一区二区三区| netflix在线观看网站| 久久中文看片网| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲欧美激情在线| 国产有黄有色有爽视频| 成人影院久久| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲人成77777在线视频| 制服人妻中文乱码| 亚洲欧美激情在线| 亚洲七黄色美女视频| 在线观看免费高清a一片| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 制服诱惑二区| 亚洲专区字幕在线| 国产精品一区二区三区四区久久 | 欧美日韩av久久| 女性生殖器流出的白浆| 精品午夜福利视频在线观看一区| 日韩免费av在线播放| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久伊人香网站| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 人成视频在线观看免费观看| 黄色a级毛片大全视频| 午夜免费成人在线视频| 香蕉丝袜av| 正在播放国产对白刺激| 国产精品影院久久| 日韩欧美免费精品| 性欧美人与动物交配| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 日本 av在线| 国产成人影院久久av| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲欧美日韩无卡精品| 一进一出抽搐动态| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品一区二区三区四区久久 | 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久精品成人免费网站| av天堂在线播放| 无遮挡黄片免费观看| 免费看十八禁软件| 99国产精品99久久久久| 国产不卡一卡二| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产精品电影一区二区三区| 丁香欧美五月| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 欧美日韩乱码在线| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 无限看片的www在线观看| 精品人妻在线不人妻| 制服诱惑二区| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲av电影在线进入| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲精品美女久久av网站| 老司机福利观看| 999久久久国产精品视频| 亚洲五月天丁香| 9191精品国产免费久久| 日本黄色日本黄色录像| 9色porny在线观看| 亚洲成人免费av在线播放| 午夜老司机福利片| 免费在线观看影片大全网站| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲午夜理论影院| 久久久久久大精品| 国产成人免费无遮挡视频| 天堂动漫精品| 亚洲国产中文字幕在线视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产单亲对白刺激| 999久久久精品免费观看国产| 精品国产乱码久久久久久男人| 成人影院久久| 男女午夜视频在线观看| 超色免费av| 一本大道久久a久久精品| 1024香蕉在线观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久香蕉精品热| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 制服人妻中文乱码| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 午夜久久久在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲精华国产精华精| 91在线观看av| 深夜精品福利| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲 国产 在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产精品久久视频播放| 搡老熟女国产l中国老女人| 黄片小视频在线播放| 亚洲精品国产色婷婷电影| 宅男免费午夜| 制服人妻中文乱码| 亚洲,欧美精品.| 成人三级做爰电影| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 日韩高清综合在线| 国产精品久久久久成人av| 国产精品一区二区三区四区久久 | 亚洲专区字幕在线| 欧美日本中文国产一区发布| www.精华液| 亚洲美女黄片视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 老司机亚洲免费影院| videosex国产| 欧美久久黑人一区二区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 日韩免费av在线播放| 日韩大码丰满熟妇| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 女性生殖器流出的白浆| 欧美久久黑人一区二区| 久久狼人影院| 桃色一区二区三区在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 1024视频免费在线观看| 不卡av一区二区三区| 国产成人精品在线电影| xxxhd国产人妻xxx| 一进一出好大好爽视频| 91麻豆av在线| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 99香蕉大伊视频| 久久精品91蜜桃| av超薄肉色丝袜交足视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产黄a三级三级三级人| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲片人在线观看| 中文字幕色久视频| av天堂在线播放| 久99久视频精品免费| 超碰97精品在线观看| 久久久久国内视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产精品av久久久久免费| 看片在线看免费视频| 99国产精品免费福利视频| 精品日产1卡2卡| 久久久久亚洲av毛片大全| 操出白浆在线播放| 不卡一级毛片| 久久久久九九精品影院| 少妇 在线观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 757午夜福利合集在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 99精品在免费线老司机午夜| 国产成年人精品一区二区 | 久久狼人影院| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 波多野结衣高清无吗| 免费在线观看黄色视频的| 黄色 视频免费看| 一区二区三区精品91| 国产视频一区二区在线看| 最近最新免费中文字幕在线| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 日韩视频一区二区在线观看| 脱女人内裤的视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 在线免费观看的www视频| 国产高清国产精品国产三级| 在线观看免费视频网站a站| 91麻豆av在线| 99re在线观看精品视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 丁香欧美五月| 99久久综合精品五月天人人| 免费少妇av软件| 中出人妻视频一区二区| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产成年人精品一区二区 | 午夜a级毛片| 日本三级黄在线观看| av视频免费观看在线观看| 夫妻午夜视频| 亚洲视频免费观看视频| 国产亚洲欧美98| 亚洲精品中文字幕在线视频| 成年人黄色毛片网站| 女同久久另类99精品国产91| 久久中文字幕一级| 丁香六月欧美| 免费高清在线观看日韩| 精品国产国语对白av| 香蕉丝袜av| 岛国在线观看网站| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 麻豆av在线久日|