費爾干豬毛菜病程相關蛋白基因SfPR-1的表達規(guī)律和植物表達載體構建

費爾干豬毛菜病程相關蛋白基因SfPR-1的表達規(guī)律和植物表達載體構建

王艷 陳西 周蓮潔 楊中敏
（新疆大學生命科學與技術學院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

采用RT-PCR技術探究鹽生植物費爾干豬毛菜病程相關蛋白基因SfPR-1（GenBank登錄號：JQ670917）在不同發(fā)育時期、組織部位、植物激素、非生物脅迫及生物脅迫處理下的表達規(guī)律，以揭示該基因在費爾干豬毛菜生長發(fā)育和逆境脅迫下的作用。結果表明，不同組織（根、莖、葉）中，SfPR-1在根中表達量最高，預示該基因可能在根防御中發(fā)揮主要作用；SfPR-1在不同發(fā)育階段（種子、種子萌發(fā)20 d幼苗、種子萌發(fā)30 d幼苗、種子萌發(fā)40 d幼苗）的表達特性顯示，種子萌發(fā)30 d幼苗時，其表達差異最顯著，表明其可能在植株后期生長發(fā)育中具有重要作用；SfPR-1對不同植物激素（水楊酸SA、茉莉酸JA、脫落酸ABA、乙烯合成前體ACC）均產生了響應，表明該基因在幾條主要的抗病防御通路中均發(fā)揮作用。非生物脅迫（H2O2、鹽、旱、冷）都能夠誘導SfPR-1基因的表達，其中對鹽響應程度最高。以植源性意大利青霉（Penicillium italicum）進行生物脅迫時，SfPR-1表達呈持續(xù)上升趨勢。以上結果表明費爾干豬毛菜病程相關蛋白基因SfPR-1是生物與非生物逆境脅迫下均響應的基因，推測其在植物抵御逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。

費爾干豬毛菜 SfPR-1基因 RT-PCR 表達模式 植物表達載體構建

植物往往暴露于各種各樣的脅迫環(huán)境中，如病原體和食草動物的侵襲、不利的光照、水分、溫度、營養(yǎng)或鹽分脅迫。由于它們的固著生活方式，因而必須建立一種快速高效的適應機制［1］。脅迫信

號通常會導致植物體內合成一種或多種主要的次級信號分子如茉莉酸酯JAs［2-4］、乙烯ET［5，6］、水楊酸SA［7］和過氧化氫H2O2［8］。植物通過這些激素介導的信號轉導網(wǎng)絡促使大量防御相關基因表達引發(fā)一系列生理代謝活動從而應對外界脅迫，而其中許多基因在不同的信號通路中表達既有重疊也有差異，因而植物在響應不同刺激脅迫時可能具有相同的信號轉導機制［9-11］。

病程相關蛋白（Pathogenesis-Related proteins，PRs）是植物受生物或非生物脅迫后誘導產生并積累的一類蛋白質總稱，是植物防衛(wèi)體系的重要組成部分，與過敏性壞死反應（Hypersensitive response，HR）及系統(tǒng)獲得性抗性（Systematic acquired resistance，SAR）密切相關，它的誘導表達常作為SAR建立的標志［12］。病程相關蛋白在植物產生系統(tǒng)抗性、阻止病原物侵染、抵御疾病、響應外界壓力以及適應不良環(huán)境等方面發(fā)揮著重要作用，已成為近年來抗性研究熱點之一［13］。根據(jù)血清學和序列分析將植物病程關蛋白PRs分為兩個亞類［14］（酸性病程相關蛋白和堿性病程相關蛋白）和17個基因家族成員［15］。PR-1作為病程相關蛋白的重要家族成員，自1970年首次發(fā)現(xiàn)以來，越來越多的試驗表明PR-1蛋白是PRs蛋白家族中獨特且保守的一類成員［16］。

盡管大多數(shù)PR蛋白表現(xiàn)出抗病原菌的生物活性，然而有一些PR蛋白是受發(fā)育和植物特定組織器官調控，另一些則受環(huán)境刺激因素如機械損傷或冷脅迫等誘導表達。在擬南芥中過表達5種PR蛋白顯示，過表達PR-1的植株顯示出了對活體營養(yǎng)型和死體營養(yǎng)型兩種病原菌的高水平抗性［17］，而分別過表達PR-2，3，4，5的植株則與對照無顯著性差異，從蘋果中分離獲得的類似PR-1的基因在受歐文氏菌感染或刺激劑誘導時也均未響應［18］，因而目前對PR-1的生物學功能尚不明確［17］。

費爾干豬毛菜（Salsola ferganica）屬C4藜科雙子葉一年生草本鹽生植物，生長于中亞荒漠地區(qū)，是適應鹽堿生境為數(shù)不多的先鋒植物之一，作為鹽堿地的“生物脫鹽器”，它可以在收獲時將鹽帶走，降低土壤含鹽量，具有重要的經濟和生態(tài)價值［19］。課題組前期結合抑制差減雜交［20］和RACE技術［21］克隆獲得了費爾干豬毛菜鹽響應病程相關蛋白基因SfPR-1（GenBank登錄號：JQ670917），本試驗擬通過半定量RT-PCR技術探究該基因在不同組織部位、發(fā)育時期、植物激素、不同非生物脅迫和生物脅迫下的表達模式，同時構建該基因的植物過表達載體和亞細胞定位載體，將對闡述SfPR-1的生物學功能和作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 費爾干豬毛菜種子（Salsola ferganicaDrob.）采自新疆103團通古特沙漠，種子播翅后經0.1%升汞表面消毒8 min，滅菌水反復沖洗5-6遍后，于MS培養(yǎng)基中萌發(fā)生長。平均培養(yǎng)溫度25℃，光照時間16 h/ d，相對濕度40%。除不同發(fā)育時期外，其他脅迫材料均取自生長20 d左右的費爾干豬毛菜，以互生葉前四節(jié)莖葉作為總RNA提取的材料。

1.1.2 主要試劑和儀器 大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 感受態(tài)細胞購于北京全式金生物技術有限公司；植物總RNA提取試劑盒RNAprep pure、RNAFree DNase I和DNA回收試劑盒購自TIANGEN公司；M-MLV 逆轉錄酶、Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性內切酶BamH I、PstI、NcoI、XohI和DL15 000+ 2 000 DNA Marker購自TaKaRa公司；茉莉酸JA、水楊酸SA、脫落酸ABA和卡那霉素購自Sigma-Aldrich公司；乙烯合成前體ACC購自Calbiochem公司；PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。試驗使用的儀器有 PCR 擴增儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、臺式離心機、超凈工作臺等。DNA序列測定委托華大有限公司北京分公司完成。

1.2 方法

1.2.1 植物材料的處理 將無菌培養(yǎng)20 d的費爾干豬毛菜幼苗移至含有終濃度為500 μmol/L SA、50 μmol/L ABA、50 μmol/L ACC、100 μmol/L JA和600 mmol/L NaCl的MS固體培養(yǎng)基上進行脅迫處理；200 μmol/L H2O2則通過噴灑方式對植株脅迫并以只噴灑蒸餾水的植株作為對照，以上脅迫分別在1 h、6 h、24 h取莖葉混合樣品。將無菌苗置于4℃進行1 d、3 d低溫脅迫處理；將植株移到濾紙上作為干旱處理，脅迫1 h、6 h取莖葉混合樣品。

用植源性真菌意大利青霉（Penicillium italicum）作為病原體，在馬鈴薯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，噴灑在植物葉片邊緣，處理時間分別為6 h、24 h、48 h，以只噴灑培養(yǎng)基的植株作為對照。

不同發(fā)育時期及不同組織部位的植株均以在相同培養(yǎng)條件下的無菌苗為材料，植物種子去翅。以上試驗樣品取0.1 g左右用錫箔紙包好后液氮速凍，存于-80℃冰箱用于總RNA的提取。每個取樣點設3個技術重復，試驗共設3次生物學重復。

1.2.2 總RNA的提取與第一鏈cDNA的合成 按照天根生化科技有限公司植物組織試劑盒（RNAprep pure Tissue Kit）的操作說明并結合該公司的RNAFree DNase I試劑提取植物總RNA，RNA的濃度和純度用Nano DropTM分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。根據(jù)TaKaRa公司M-MLV Reverse Transcriptase反轉錄的要求合成cDNA第一鏈（所有樣品起始總RNA均為1 μg）。

1.2.3 半定量RT-PCR分析SfPR-1基因的表達模式 針對SfPR-1設計特異引物SfPR-1P1（5'-ATGGCTTTATCAAAAAAGT-3'）和SfPR-1P2（5'- TTAGTAAGGTTTTTGGCCA -3'），內參采用費爾干豬毛菜βactin（上游引物β-actinP1：5'-AAGATCTGGCACCACACCTTC-3'；下游引物β-actinP2：5'-CACACCATCACCAGAATCGA- 3'）。以鹽脅迫下處理24 h的cDNA為模板對β-actin基因和SfPR-1基因進行不同循環(huán)數(shù)的PCR擴增，確定適宜的循環(huán)數(shù)。采用20 μL擴增體系：上下游引物（10 U/μL）各0.5 μL，dNTP（2.5 mmol/μL）2 μL， 模 板cDNA 1 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，10×buffer（含Mg2+）2 μL，ddH2O 17 μL。擴增程序為：95℃預變性3 min；95℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 40 s，循環(huán)次數(shù)依次為23、26、28、30、33和36個循環(huán)；72℃延伸7 min，分別取6 μL擴增產物于1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，選擇SfPR-1和內參基因β-actin半定量RT-PCR處于對數(shù)期的循環(huán)數(shù)。

以各時期、各處理總RNA合成的cDNA為模板進行費爾干豬毛菜SfPR-1基因的半定量RT-PCR表達模式分析。所用引物同上，通過調整內參基因β-actin的亮度確定半定量RT-PCR各處理模板的cDNA用量。2 0 μL反應體系中包括：經內參調整適宜體積的cDNA模板，10×buffer（含Mg2+）2 μL，dNTP 2 μL，SfPR-1P1 0.3 μL，SfPR-1P2 0.3 μL，TaqDNA polymerase 0.3 μL，ddH2O補齊至20 μL，反應程序為：95℃預變性3 min；95℃ 30 s，55℃40 s，72℃ 40 s，共30個循環(huán)；72℃延伸7 min，擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)進行成像。

用相關半定量軟件Quantity one圖像系統(tǒng)分析半定量結果中各條帶的灰度得出灰度值，再用Excel軟件求出目的基因條帶灰度與內參基因灰度之間的比值。

1.2.4 植物表達載體的構建 用BamH I和PstI雙酶切含有這兩個酶切位點的SfPR-1PCR產物，將回收的酶切產物與經相同內切酶回收的植物表達載體pCAMIA1301-1連接，使其上游連有花椰菜花葉病毒35S啟動子，下游連有NOS終止子，構建成植物表達載體pCAMIA1301-1- SfPR-1，連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，在含有Kan（50 mg/L）的LB培養(yǎng)基上進行篩選，挑取單菌落提取質粒，進行BamH I和PstI雙酶切鑒定。

為使SfPR-1基因融合于GFP的N端，在SfPR-1基因上下游引物中分別添加了NcoI酶切位點（下游引物去除密碼子）。PCR產物用NcoI酶切后，連接到以相同酶切含有GFP基因的pCAMBIA1302載體上，構建成SfPR-1目的基因C端連有mGFP的融合表達載體pCAMBIA1302- SfPR-1-mGFP。連接產物的轉化和篩選同上，挑取單菌落提取質粒，進行NcoI酶切鑒定，同時再以NocI和XohI對重組質粒pCAMIBA1302-SfPR-1-mGFP進行雙酶切，鑒定正向插入的克隆。以上酶切正確的克隆送華大有限公司北京分公司進行測序。采用凍融法將pCAMIA1301-1- SfPR-1導入農桿菌EHAl05，為后續(xù)花序侵染擬南芥奠定基礎。

2 結果

2.1SfPR-1基因在不同組織和發(fā)育時期的表達特性SfPR-1在不同組織根、莖、葉中均有表達，其中根中的表達量最高（圖1）。以不同發(fā)育時期的植株為研究對象，分析SfPR-1是否參與植株的發(fā)育過程。圖1顯示，該基因在種子中表達量最低，萌發(fā)

20 d表達量雖有上升但與種子中的表達量并未有顯著差異；當植株生長約30 d時，SfPR-1基因表達量出現(xiàn)急劇增加，而當植株長至40 d時，其表達又急劇下降。

圖1 SfPR-1在不同組織和發(fā)育時期的表達規(guī)律

2.2 SfPR-1在植物激素處理下的表達模式

圖2顯示，病程相關蛋白SfPR-1對4種植物激素處理均能產生一定程度的響應。50 μmol/L ABA處理時，呈現(xiàn)早期（1 h）響應后下調再上升的趨勢，在24 h時表達量達到最高；SfPR-1對ACC和JA的響應都在6 h出現(xiàn)最大值，后期脅迫過程中表達量有所下降但仍高于對照。在所有激素脅迫處理中，只有SfPR-1對SA響應呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，且在24 h時表達量最高。

2.3SfPR-1在非生物脅迫下的表達模式

對費爾干豬毛菜進行了4種非生物脅迫，圖3顯示，其中SfPR-1對鹽的響應最為強烈。盡管其他3種脅迫下SfPR-1的響應強度非常近似，但表達模式有所不同。干旱脅迫時SfPR-1呈現(xiàn)持續(xù)上調表達；冷脅迫1 d時該基因響應程度達到最大并在處理3 d時下降到正常水平，與之相似的是在H2O2脅迫下，SfPR-1呈現(xiàn)早期響應，在1 h時與對照組出現(xiàn)顯著差異，隨后一直處于正常表達水平。

2.4 SfPR-1在生物脅迫下的表達模式

生物脅迫處理下，SfPR-1的表達呈持續(xù)上升的模式，48 h表達量最高（圖4）。

2.5 植物表達載體pCAMBIA1301-1-SfPR-1和

pCAMBIA1302-SfPR-mGFP的構建

將SfPR-1構建至植物表達載體pCAMBIA1301-1中，酶切鑒定片段大小正確（圖5），構建成植物表達載體pCAMBIA1301-1-SfPR-1（圖6-A），經測序SfPR-1讀碼框正確。通過設計特異性引物擴增SfPR-1基因，使其融合于GFP的N端構建成融合表達載體pCAMBIA1302-SfPR-1-mGFP（圖6-B），酶切鑒定片段大小正確。為進一步確定目的基因連接方向的正確性，采用限制性內切酶XohI和NocI切出了與預計大小一致的目的片段（圖5）。

3 討論

SAR在植物防御外來病原生物入侵中起著關鍵作用，其中主要通過PRs和植保素完成。在各種PRs中，主要存在于植物組織細胞間隙的PR-1功能尤為突出，因而常常把它作為SAR中重要的標志分子［22，23］。

SfPR-1是從藜科豬毛菜屬鹽生植物費爾干豬毛菜中分離得到的鹽響應病程相關蛋白基因［21］。根據(jù)SfPR-1的組織表達特異性，其在根中的表達量最高。由于根與病原體數(shù)量最多的土壤接觸最為密切，推

測SfPR-1蛋白在根的防御中發(fā)揮重要作用。而在不同發(fā)育時期SfPR-1表達量并無明顯變化，主要在中后期（種子萌發(fā)30 d）時有急劇增加，有文獻報道病程相關蛋白可能通過酶促反應產生信號分子，在植物形態(tài)發(fā)育中起內源激發(fā)子的作用［24］，表明該基因可能與植株發(fā)育相關。

圖2 SfPR-1在不同激素處理及不同處理時間下的表達規(guī)律

費爾干豬毛菜SfPR-1在不同植物激素、不同非生物脅迫和生物脅迫下的表達模式可歸為4類。在冷、H2O2脅迫下，SfPR-1表達呈現(xiàn)早期顯著響應的趨勢，分別在處理早期1 d和1 h時表達量最高，隨著處理時間的延長，其表達量逐漸下降到正常水平。而ACC、JA及NaCl處理下SfPR-1在1-6 h內表達量持續(xù)升高并達到最大值，當脅迫到24 h時，SfPR-1表達量有所下降但仍高于對照組。第3種模式是隨著脅迫時間的延長SfPR-1表達量逐步升高，這種模式出現(xiàn)在SfPR-1對旱、SA和真菌的脅迫響應中，三者分別在6 h、24 h和48 h達到最大值。所有脅迫處理中只有ABA組中表現(xiàn)為早期（1 h）響應后下調再上升的趨勢，6 h雖表達量較低但仍顯著高于對照組，并在24 h時達到最高峰。

SA、JA、ACC、ABA和H2O2能夠誘導植物防御和脅迫相關基因的表達，在植物系統(tǒng)獲得性抗性SAR和非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用［25］。水楊酸SA是廣泛存在于植物體內的一種簡單酚類物質，作為植物抗病反應的重要信號分子，激活植物抗逆反應相關的防御機制，在植物信號傳導中起著關鍵作用［26，27］，因此被廣泛地應用于植物抗性研究。茉莉酸類物質JAs是與抗性密切相關的植物生長類物質，它作為內源信號分子參與植物在機械傷害、病蟲害、干旱、鹽脅迫、低溫等條件下的抗逆反應［28］。當植物受到傷害時，植物體內茉莉酸及其衍生物的含量顯著增加，進而誘導一系列與抗逆有關的基因表達。ABA與JA往往具有相似的結構，它們的生理作用也很相似，之間存在協(xié)同或者拮抗作用［29］。SfPR-1

在以上植物激素脅迫響應中，基因表達均發(fā)生顯著增高，提示SfPR-1參與多種激素介導的植物抗病抗逆過程。H2O2是氧化脅迫下產生的一種活性氧物質。植物受到逆境或者傷害時會引起體內H2O2濃度的升高，從而調節(jié)PRs等防御相關基因表達，直接殺死入侵病原體或導致生理生化的改變做出植物的早期防御反應［30-32］。本試驗中SfPR-1受H2O2早期誘導表達，說明該基因屬于H2O2介導的下游響應基因。

圖3 SfPR-1在不同非生物脅迫處理及不同處理時間下的表達規(guī)律

圖4 SfPR-1在生物脅迫處理不同時間下的表達規(guī)律

圖5 SfPR-1植物表達載體的酶切鑒定

植物通過SA、JA、ACC和H2O2介導的防御信號通路以響應食草動物和病原體的傷害［33，34］，這些通路彼此相互聯(lián)系，能夠以協(xié)同或相反的方式發(fā)揮

作用［35］。在一些關鍵信號結點（如PR-1等），可以通過信號通路優(yōu)先利用最有效的系統(tǒng)對侵襲者進行防御［36］。除此之外，防御途徑還與脫落酸ABA、生長素等信號通路相互聯(lián)系共同作用以加強防御反應的范圍和效果［37］。

圖6 SfPR-1植物表達載體pCAMBIA1301-SfPR-1（A）和pCAMIBA1302-SfPR-1-mGFP（B）構建示意圖

SfPR-1在植源性真菌意大利青霉的脅迫下，表達量表現(xiàn)為持續(xù)上升并在脅迫后期（48 h）達到最大值，該結果直接證明了SfPR-1能夠響應病原體侵襲，推測其在抗病過程中發(fā)揮著重要作用。

多數(shù)PR基因在植物受到病原體感染和昆蟲啃食時表達會發(fā)生改變且在轉基因植物中顯示出對病原體的抗性［38］，部分PR-1表現(xiàn)出不明確的受發(fā)育和環(huán)境的調控的生物學功能［15］，如葉片衰老、花粉成熟及冷、滲透和光脅迫［39-41］。除此之外，近年來報道PR-1，PR-2和PR-5蛋白在過冬單子葉植物中大量合成表現(xiàn)出一定的抗凍活性［39，42］，有些PR基因甚至能在植物離體組織中持續(xù)表達［43］。且高鹽脅迫也會影響擬南芥PR-1，PR-2和PR-3的表達，但轉基因擬南芥中僅過表達PR-3的植株在種子萌發(fā)階段表現(xiàn)出對鹽的抗性［44］。本研究結果顯示SfPR-1在不同非生物脅迫如鹽、旱、和冷處理下均被誘導表達，推測可能是由于外界刺激使植物內源激素積累從而引起了PR蛋白轉錄本的積累。

以上結果提示SfPR-1可能處于費爾干豬毛菜體內防御信號的結點位置，這種不同信號分子間的交叉和各個網(wǎng)絡間的彼此聯(lián)系，有助于植物更好地響應和調節(jié)各種不利脅迫條件［45，46］，暗示其在植物抵御生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。

目前尚無有關鹽生植物費爾干豬毛菜病程相關蛋白基因的詳細報道，本課題組對SfPR-1基因在不同組織、發(fā)育時期及植物激素、不同非生物脅迫和生物脅迫下的表達規(guī)律進行研究，根據(jù)試驗結果，推測費爾干豬毛菜病程相關蛋白基因SfPR-1是生物脅迫與非生物脅迫下交叉響應的基因，但其如何在逆境下發(fā)揮作用還有待于進一步深入研究。SfPR-1植物表達載體的構建為該基因的生物學功能鑒定奠定了基礎，以上研究不僅對解析鹽生植物費爾干豬毛菜耐鹽機理和闡明植物適應其他生物逆境的機制有重要作用，也將為培育同時具有抗鹽和抗病作物提供重要的候選基因。

4 結論

鹽生植物費爾干豬毛菜病程相關蛋白基因sfPR-1在種子萌發(fā)30 d的幼苗中表達量增加；不同組織部位中根的表達量最大；該基因對防御信號通路中的幾種主要激素和非生物脅迫及生物脅迫均響應。鹽生植物費爾干豬毛菜病程相關蛋白基因sfPR-1是生物脅迫與非生物脅迫下交叉響應的基因。

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（責任編輯 李楠）

Expression Profiles of Pathogen-related Protein Gene（ SfPR-1）from Salsola ferganica and Construction of Plant Expression Vectors

Wang Yan Chen Xi Zhou Lianjie Yang Zhongmin
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046）

To investigate the potential roles of SfPR-1 at different developmental stages, tissues, phytohormones treatment, different abiotic stresses and biotic stress treatment, semi-quantitative RT-PCR method was employed to explore the expression profiles of pathogenesisrelated protein gene SfPR-1（GenBank accession number：JQ670917）from halophytes Salsola ferganica. The results displayed that SfPR-1 gene was mainly expressed in root tissue with low expression in the stem and leaves, suggesting that the gene may play a major role in the root defense. The expression characteristic of SfPR-1 at different developmental stages（seed, 20 d shoots after seed germination, 30 d shoots after seed germination, 40 d shoots after seed germination）showed the highest level was in 30 d shoots after seed germination, indicating that may play an important role in the plant late growth. The expression of SfPR-1 generated with the application of phytohormones including salicylic acid（SA）, jasmonate（JA）, 1-aminocyclopropane-1-carboxylate（ACC）, and abscisic acid（ABA）. This response can also be induced by abiotic stresses including H2O2, salt, drought, cold, and biotic stresses such as Penicillium italicum infection. The transcript levels of SfPR-1 substantially increased during biotic stress during 48 h treatment. These results suggested that SfPR-1was a key gene to the biotic and abiotic response and may play an important role in host plant defense and environmental stress.

Salsola ferganica SfPR-1 gene RT-PCR Expression profiles Construction of plant expression vectors

2013-07-19

“973”計劃前期研究專項（2012CB722204），新疆自治區(qū)青年自然科學基金項目（2012211B06）

王艷，女，博士，副教授，研究方向：植物抗逆的生理生化與分子機制；E-mail：wangyanxju@126.com