大豆轉(zhuǎn)錄因子GmERF5啟動(dòng)子的克隆及活性分析

大豆轉(zhuǎn)錄因子GmERF5啟動(dòng)子的克隆及活性分析

翟瑩1張軍2趙艷1孫天國1姚雅男3楊曉杰1
（1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院 遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，齊齊哈爾 161006；3.長春農(nóng)業(yè)博覽園，長春 130117）

乙烯響應(yīng)因子（Ethylene-responsive factors，ERFs）廣泛參與植物對生物和非生物脅迫的應(yīng)答。從大豆吉林32的基因組DNA中分離到GmERF5的啟動(dòng)子片段，全長1 924 bp。該區(qū)段含有9種與逆境相關(guān)的順式作用元件，即G-box、GT-1、LTRE-1、W-box、TL1、DPBF、MYB、MYC和BIHD10S。將該啟動(dòng)子構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301上與葡萄糖苷酸酶（GUS）基因融合，注射法轉(zhuǎn)化煙草葉片，并進(jìn)行干旱、高鹽和低溫處理，通過GUS組織化學(xué)染色和GUS熒光值的測定分析啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性。結(jié)果表明，在未處理?xiàng)l件下，該啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)下游GUS基因的表達(dá)。干旱和低溫處理10 h能明顯增強(qiáng)GmERF5P的啟動(dòng)活性。

大豆 GmERF5 GUS活性 啟動(dòng)子 逆境誘導(dǎo)

當(dāng)植物處于不利的環(huán)境中時(shí)會(huì)迅速激活相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［1］，合成大量逆境相關(guān)的基因產(chǎn)物，包括酶、分子伴侶、離子通道蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)體等［2］，使植物更好的適應(yīng)各種生物和非生物脅迫。其中，逆境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子由于可以和啟動(dòng)子中特定的元件結(jié)合，通過調(diào)節(jié)自身的改變從而調(diào)控下游多個(gè)目的基因的表達(dá)而在植物適應(yīng)不利環(huán)境條件方面發(fā)揮重要作用［3］。乙烯響應(yīng)因子（Ethylene-responsive factors，ERFs）是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與植物對生物和非生物脅迫的應(yīng)答。自O(shè)hme-Takagi和Shinshi［4］首次從煙草中分離出4個(gè)ERF基因以來，已從擬南芥、番茄、水稻、小麥、玉米等不同植物中相繼獲得大量ERF基因。近年來，將擬南芥中的ERF轉(zhuǎn)錄因子HARDY在三葉草中異位表達(dá)，降低了轉(zhuǎn)基因植物的蒸騰作用和對鈉離子的攝入量，從而提高了轉(zhuǎn)基因三葉草的抗旱性和抗鹽性［5］。超表達(dá)SlERF1的轉(zhuǎn)基因番茄與野生型相比含有更高的相對含水量、脯氨酸含量和可溶性糖含量，提高了轉(zhuǎn)基因番茄的抗鹽性［6］。另外，將番茄中的另一個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子TSRF1在煙草和番茄中過表達(dá)，通過GCC-box激活抗病基因的表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因植物的抗病性，而將其在水稻中過表達(dá)則可以通過調(diào)控脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)來提高轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱性［7］。從擬南芥中分離出一個(gè)受低氧、高鹽、ABA和紫外

輻射誘導(dǎo)的AtERF71/HRE2，將其在擬南芥中超表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對高鹽、水淹和紫外輻射的抗性［8］。由此可見，ERF轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)用是提高農(nóng)作物綜合抗逆能力的有效策略。

植物基因的啟動(dòng)子位于基因5'端上游區(qū)域，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄起始和頻率，使基因在不同的組織器官、不同的發(fā)育時(shí)期以及不同環(huán)境條件下表達(dá)［9］。啟動(dòng)子序列除含有基本元件TATA-box和CAAT-box外，還存在一些特異性的順式作用元件，它們可以與轉(zhuǎn)錄因子蛋白等調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)協(xié)同作用［10］。研究轉(zhuǎn)錄因子基因的啟動(dòng)子有助于理解該基因的逆境脅迫調(diào)控機(jī)制及信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。然而，到目前為止關(guān)于ERF基因啟動(dòng)子及其表達(dá)調(diào)控的研究報(bào)道并不多。

本研究前期從大豆品種吉林32中分離出一個(gè)可以被逆境脅迫所調(diào)控的ERF轉(zhuǎn)錄因子GmERF5（GenBank登錄號為JN416600）［11］。為研究GmERF5的表達(dá)調(diào)控模式及其在大豆脅迫響應(yīng)中的調(diào)控功能，本研究分離出GmERF5的啟動(dòng)子片段，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草葉片，分析該啟動(dòng)子對干旱、高鹽和低溫的應(yīng)答反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試大豆（Glycine maxL.）吉林32由吉林大學(xué)植物種質(zhì)資源與利用研究室提供；煙草（Nicotiana tabacumL.）NC89由本實(shí)驗(yàn)室保存；載體pCAMBIA-1301、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α及根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1GmERF5基因啟動(dòng)子的克隆和序列分析 利用已克隆到的大豆GmERF5轉(zhuǎn)錄因子cDNA序列搜索大豆基因組數(shù)據(jù)庫GmGDB（http：//www.plantgdb. org/GmGDB/），獲得其上游大概2 000 bp的啟動(dòng)子序列。利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5設(shè)計(jì)引物，在其兩邊，引物序列如下（下劃線部分為EcoRI 和NcoI酶切位點(diǎn)）F：5'-GGGAATTCGCTATTCCCCTAAACTTTG-3'；R：5'-GGCCATGGGTTTCTTCTTCAGAACTTGAG-3'。以大豆吉林32葉片DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序?yàn)?4℃ 8 min；94℃ 40 s，60℃ 40 s，72℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后連接至pMD18-T載體，將篩選獲得陽性質(zhì)粒命名為pMD18-T-GmERF5P，并送華大基因進(jìn)行測序。測序結(jié)果利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對，PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）數(shù)據(jù)庫用于啟動(dòng)子順式作用元件的預(yù)測分析。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建 將測序正確的pMD18-TGmERF5P質(zhì)粒和pCAMBIA1301質(zhì)粒分別用EcoR I 和NcoI 雙酶切后經(jīng)T4連接酶過夜連接，以菌液PCR和雙酶切鑒定陽性克隆。利用凍融法將表達(dá)載體pCAMBIA1301-GmERF5P和pCAMBIA1301分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。

1.2.3 煙草葉片的轉(zhuǎn)化及脅迫處理 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片的轉(zhuǎn)化參照Yang等［12］的方法并加以改進(jìn)。煙草苗采用盆栽，于溫室中培養(yǎng)6周后開始進(jìn)行處理。將分別含有pCAMBIA1301-GmERF5P載體和pCAMBIA1301空載體的農(nóng)桿菌菌液于YEP培養(yǎng)基中，28℃，120 r/min（搖床），振蕩培養(yǎng)至OD600大約為0.6時(shí)，2 000×g離心15 min收集菌體，用MS液體培養(yǎng)基（附加10 mmol/L MES和100 μmol/L AS）重懸菌體至OD600大約為0.8。用1 mL注射器，分別抽取1 mL重懸后的菌體和對照MS重懸液注入到煙草植株幼嫩葉片的葉脈間，做好標(biāo)記，覆膜保濕培養(yǎng)40 h后對煙草整株進(jìn)行各種脅迫處理。將注射后的煙草苗分別置于含10 % PEG8000和200 mmol/L NaCl的水溶液中進(jìn)行干旱和高鹽處理；于4℃培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫處理。處理后10 h取樣進(jìn)行GUS基因表達(dá)的檢測。

1.2.4GUS基因表達(dá)的檢測 參照J(rèn)efferson［13］的方法對GUS報(bào)告基因的表達(dá)進(jìn)行檢測。將處理后的煙草葉片剪下進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色：加入GUS染色液［14］，于37℃溫育過夜，用75 %的乙醇脫色至底色完全消失。另將0.1 g處理后的煙草葉片在液氮中研磨成粉末，加入600 μL酶提取緩沖液，4℃離心，用Bradford法［15］測定上清液中的蛋白濃度。取出部分上清液加GUS反應(yīng)底物4-MUG，于37℃反應(yīng)10 min，在熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行GUS熒光值的測定。試驗(yàn)設(shè)置3次生物重復(fù)，用獲得的熒光值除以蛋白濃度和時(shí)間得到GUS相對活性。

2 結(jié)果

2.1GmERF5啟動(dòng)子的擴(kuò)增

將已獲得的逆境誘導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GmERF5的cDNA序列輸入大豆基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，獲得該序列上游大概2 000 bp的DNA序列。進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物，通過PCR從大豆吉林32的葉片DNA中擴(kuò)增得到1 924 bp的GmERF5啟動(dòng)子序列，命名為Gm-ERF5P。經(jīng)分析該序列富含A/T（含量達(dá)73.1 %），這是植物啟動(dòng)子序列的主要特征之一。

2.2GmERF5P的序列分析

利用數(shù)據(jù)庫PLACE對獲得的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，結(jié)果（圖1）表明，GmERF5P除含有基本啟動(dòng)子特征元件TATA-box和CAAT-box外，還含有與逆境相關(guān)的9種順式作用元件，即：3個(gè)與脫水響應(yīng)相關(guān)的G-box元件、11個(gè)病原體和鹽誘導(dǎo)響應(yīng)相關(guān)的GT-1元件、1個(gè)低溫響應(yīng)相關(guān)的LTRE-1原件、1個(gè)傷害響應(yīng)相關(guān)的W-box元件、1個(gè)抗病相關(guān)的TL1元件、1個(gè)ABA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子DPBF的結(jié)合位點(diǎn)、4個(gè)脫水響應(yīng)相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)、5個(gè)脫水和冷誘導(dǎo)相關(guān)的MYC轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)和2個(gè)抗病相關(guān)的OsBIHD1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)BIHD10S。

圖1 GmERF5P DNA序列的生物信息學(xué)分析

2.3GmERF5P的逆境誘導(dǎo)瞬時(shí)表達(dá)

煙草葉片的GUS染色結(jié)果（圖2）表明，僅注射對照重懸液的煙草葉片都沒有被X-Gluc溶液染成藍(lán)色，而轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301空載體的煙草葉片在未處理和3種逆境處理?xiàng)l件下都可以被X-Gluc溶液染成較一致的深藍(lán)色，說明GUS報(bào)告基因在煙草葉片中能夠被pCAMBIA1301載體上的煙草花葉病毒

35S（CaMV35S）組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)，且基本不受以上3種逆境處理的調(diào)節(jié)。在未處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301-GmERF5P的煙草葉片被X-Gluc溶液染成淺藍(lán)色，表明在正常條件下GmERF5P本身具有啟動(dòng)活性，但與CaMV35S相比，其啟動(dòng)活性較弱。經(jīng)過干旱和低溫處理后，煙草葉片呈現(xiàn)出的藍(lán)色比未處理時(shí)的藍(lán)色深，表明GmERF5P的啟動(dòng)活性在處理10 h時(shí)能被干旱和低溫所誘導(dǎo)，使下游目的基因的表達(dá)量增高。但高鹽處理10 h對GmERF5P的啟動(dòng)活性影響不大。

圖2 逆境誘導(dǎo)后煙草葉片GUS組織化學(xué)染色

煙草葉片的GUS熒光值檢測結(jié)果與GUS染色結(jié)果相符合。如圖3所示，干旱和低溫處理10 h均能使GmERF5P的啟動(dòng)活性有不同程度的增強(qiáng)，而高鹽處理則沒有提高GmERF5P的啟動(dòng)活性。

圖3 逆境誘導(dǎo)后煙草葉片GUS活性分析

3 討論

影響外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的因素有很多，其中以啟動(dòng)子的調(diào)控最為關(guān)鍵。逆境誘導(dǎo)啟動(dòng)子僅在植物遭受逆境脅迫時(shí)才大量啟動(dòng)下游抗逆基因的表達(dá)，可以避免外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中持續(xù)表達(dá)所造成諸多負(fù)面影響［16，17］。因此，逆境誘導(dǎo)啟動(dòng)子的使用對植物應(yīng)對逆境環(huán)境具有重要的意義。

GmERF5是從大豆吉林32中分離到的一個(gè)編碼ERF轉(zhuǎn)錄因子基因，能夠被多種生物及非生物脅迫所誘導(dǎo)［11］。長度為1 924 bp的GmERF5基因啟動(dòng)子片段能夠在干旱和低溫處理10 h后明顯提高下游報(bào)告基因的表達(dá)量，具有一定的逆境誘導(dǎo)活性。此結(jié)果與前期研究結(jié)果相符，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明大豆中GmERF5基因在干旱和低溫處理10 h后表達(dá)量上升明顯，而高鹽處理10 h后基因表達(dá)量變化不大［11］。利用生物信息學(xué)方法對GmERF5P上的順式作用原件進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其含有多個(gè)與脫水、高鹽、低溫、病原物和傷害等逆境相關(guān)的順式作用元件，由此推測各種逆境環(huán)境可能就是通過這些順式作用元件來調(diào)節(jié)GmERF5基因的表達(dá)，進(jìn)而再通過GmERF5所介導(dǎo)的信號路徑調(diào)控大豆對生物及非生物脅迫的響應(yīng)，從而表現(xiàn)出復(fù)雜的調(diào)控方式。逆境處理10 h，GmERF5P對干旱處理的響應(yīng)最為明顯，序列分析結(jié)果表明GmERF5P上存在3個(gè)脫水響應(yīng)元件G-box；其次是對低溫的響應(yīng)，GmERF5P序列僅存在1個(gè)低溫響應(yīng)元件LTRE-1；盡管GmERF5P序列上存在11個(gè)鹽誘導(dǎo)響應(yīng)元件GT-1，但其對高鹽處理的響應(yīng)不明顯。由此表明啟動(dòng)子的逆境誘導(dǎo)活性不僅只取決于逆境誘導(dǎo)元件的個(gè)數(shù)，還應(yīng)該由元件的種類及相對位置等共同決定［18］。另外GmERF5基因的表達(dá)還可能受到MYB轉(zhuǎn)錄因子、MYC轉(zhuǎn)錄因子等逆境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控［19］。但是，具體是哪些元件在GmERF5P中發(fā)揮關(guān)鍵作用，尚需要進(jìn)一步的研究。

啟動(dòng)子序列中的A/T含量與啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性呈正相關(guān)，這些序列的功能很可能是與植物細(xì)胞核內(nèi)的A/T豐富序列結(jié)合蛋白相作用，從而對基因的表達(dá)起調(diào)控作用［20，21］。GmERF5P序列中含有大量A/T序列，推測其可能具有較高的啟動(dòng)效率。通過

GUS組織化學(xué)染色和GUS熒光值的測定，證明了GmERF5P即使在未誘導(dǎo)條件下也能有效地啟動(dòng)下游GUS報(bào)告基因的表達(dá)。但GmERF5P啟動(dòng)子無論在未處理還是在逆境處理10 h后其啟動(dòng)強(qiáng)度都明顯低于CaMV35S啟動(dòng)子，這可能是由于GmERF5P序列相對較長，遠(yuǎn)端可能存在負(fù)調(diào)控元件，也可能與逆境處理時(shí)間有關(guān)，這方面仍需做啟動(dòng)子缺失和逆境誘導(dǎo)時(shí)間相關(guān)試驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證［19］。

4 結(jié)論

本研究首次克隆了大豆轉(zhuǎn)錄因子GmERF5基因的啟動(dòng)子序列，該區(qū)段含有9種與逆境相關(guān)的順式作用元件。將該啟動(dòng)子構(gòu)建植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草葉片。在未處理?xiàng)l件下，該啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)下游GUS基因的表達(dá)，干旱和低溫處理10 h能明顯增強(qiáng)Gm-ERF5P的啟動(dòng)活性。

［1］ Zhu JK. Salt and drought stress signal transduction in plants［J］. Annu Rev Plant Biol, 2002, 53：247-273.

［2］ Kizis D, Pages M. Maize DRE-binding proteins DBF1 and DBF2 are involved in rab17 regulation through the drought-responsive element in an ABA-dependent pathway［J］. Plant J, 2002, 30（6）：679-689.

［3］ Schenk PM, Kazan K, Wilson I, et al. Coordinated plant defense responses in Arabidopsis revealed by microarray analysis［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97（21）：11655-11660.

［4］ Ohme-Takagi M, Shinshi H. Ethylene-inducible DNA binding proteins that interact with an ethylene-responsive element［J］. Plant Cell, 1995, 7（2）：173-182.

［5］ Abgadallah GM, Nada RM, et al. Overexpression of HARDY, an AP2/ERF gene from Arabidopsis, improves drought and salt tolerance by reducing transpiration and sodium uptake in transgenic Trifolium alexandrinum L［J］. Planta, 2011, 233（6）：1265-1276.

［6］ Lu CW, Shao Y, Li L, et al. Overexpression of SlERF1 tomato gene encoding an ERF-type transcription activator enhances salt tolerance［J］. Russ J Plant Physiol, 2011, 58（1）：118-125.

［7］ Quan RD, Hu SJ, Zhang ZL, et al. Overexpression of an ERF transcription factor TSRF1 improves rice drought tolerance［J］. Plant Biotech J, 2010, 8（4）：476-488.

［8］ Park HY, Seok HY, et al. AtERF71/HRE2 transcription factor mediates osmotic stress response as well as hypoxia response in Arabidopsis［J］. Biochem Bioph Resys Commun, 2011, 414（1）：135-141.

［9］ 朱麗萍, 于壯, 鄒翠霞, 等. 植物逆境相關(guān)啟動(dòng)子及功能［J］.遺傳, 2010, 32（3）：229-234.

［10］ 劉強(qiáng), 張貴友, 陳受宜. 植物轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與調(diào)控作用［J］. 科學(xué)通報(bào), 2000, 45（14）：1465-1474.

［11］ 翟瑩 楊曉杰 孫天國, 等. 大豆轉(zhuǎn)錄因子GmERF5的克隆、表達(dá)及功能分析［J］. 植物學(xué)報(bào), 2013, 48（5）：498-506.

［12］ Yang YN, Li RG, Qi M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves［J］. Plant J, 2000, 22（6）：543-551.

［13］ Jefferson RA. Assaying chimeric genes in plants：the GUS gene fusion system［J］. Plant Mol Biol Rep, 1987, 5（4）：387-405.

［14］ 張慶林, 趙艷, 等. 大豆硬脂酸-ACP脫飽和酶基因啟動(dòng)子的克隆及其表達(dá)活性分析［J］. 作物學(xué)報(bào), 2011, 37（7）：1205-1211.

［15］ Brandford MM. A rapid and sensitivee method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding［J］. Anal Biochem, 1976, 72：248-254.

［16］ 李新玲, 楊傳平, 曲敏, 等. rd29A啟動(dòng)子的克隆及提高煙草抗逆性的研究［J］. 分子植物育種, 2007, 5（1）：37-42.

［17］ 朱麗萍, 于壯, 鄒翠霞, 等. 植物逆境相關(guān)啟動(dòng)子及功能［J］.遺傳, 2010, 32（3）：229-234.

［18］ 李杰, 張福城, 王文泉, 等. 高等植物啟動(dòng)子的研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通訊, 2006, 17（4）：658-661.

［19］ 孫嘯, 董建輝, 等. 大豆抗逆基因GmDREB3啟動(dòng)子的克隆及調(diào)控區(qū)段分析［J］. 作物學(xué)報(bào), 2008, 34（8）：1475-1479.

［20］ Bustos MM, Guiltinan MJ, Jordano J, et al. Regulation of beta-glucuronidase expression in transgenic tobacco plants by an A/T-rich, cisacting sequence found upstream of a French bean beta-phaseolin gene［J］. Plant Cell, 1989, 1（9）：839-853.

［21］ Tjaden G, Coruzzi GM. A novel AT-rich DNA binding protein that combines an HMG I-like DNA binding domain with a putative transcription domain［J］. Plant Cell, 1994, 6（1）：107-118.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Cloning and Activity Analysis of Soybean GmERF5Promoter

Zhai Ying1Zhang Jun2Zhao Yan1Sun Tianguo1Yao Yanan3Yang Xiaojie1
（1. College of Life Science and Agro-forestry，Qiqihaer Univesity，Key Laboratory of Genetics，Qiqihaer 161006；2. Heilongjiang Institute of Veterinary Science，Qiqihaer 161006；3. Changchun Agriculture Expo Garden，Changchun 130117）

ERF transcription factor family is extensively involved in the biotic and abiotic responses. The GmERF5 promoter（1 924 bp）was isolated from soybean genome using PCR. Sequence analysis indicated that GmERF5P contains several stress-induced elements：G-box, GT-1, LTRE-1, W-box, TL1, DPBF, MYB, MYC and BIHD10S. GmERF5P was subcloned into pCAMBIA1301 vector to drive the GUS gene to express in tobacco leaves by Agrobacterium-mediated injection transformation. The activity of GmERF5P was analyzed using histochemistry staining and GUS fluorescence intensity analysis. The results indicated that GmERF5P activated expression of GUS report gene under normal growing conditions. The activity of GmERF5P was up-regulated after the treatments of drought and low temperature for 10 h.

Soybean GmERF5P GUS activity Promoter Stress-induced

2013-09-06

齊齊哈爾大學(xué)青年教師科研啟動(dòng)支持計(jì)劃項(xiàng)目（2012k-M20）

翟瑩，女，博士，講師，研究方向：大豆分子育種；E-mail：fairy39809079@126.com