VD3羥基化酶的定向研究進(jìn)展

VD3羥基化酶的定向研究進(jìn)展

劉苗 汪永輝 陸群
（西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031）

維生素 D3羥基化酶（Vdh）作為細(xì)胞色素酶P450s（CYP）蛋白家族成員，催化VD3形成有生物活性的1α，25（OH）2VD3。但是，由于VD3并不是Vdh的天然底物，Vdh羥基化活性較低。采用定向構(gòu)建Vdh重組質(zhì)粒的方法對Vdh催化活性位點(diǎn)給予優(yōu)化，從而提高其羥基化能力。就目前對Vdh的結(jié)構(gòu)特性和定向研究進(jìn)行綜述。

Vdh 異源表達(dá) 氧化還原蛋白 定向突變 25（OH）VD31α，25（OH）2VD3

VD3是一種脂溶性的激素原，它主要是經(jīng)紫外線照射從皮膚內(nèi)的7-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)化而來，或是從食物當(dāng)中獲?。?，2］。在哺乳動物中，VD3沒有生物活性，因此必須利用細(xì)胞色素酶P450s（CYPs）對VD3進(jìn)行羥基化，轉(zhuǎn)化成有生物活性形式的VD3，即25-OHVD3，1α，25-（OH）2VD3。在人體內(nèi)，首先是由肝臟中的CYP27A1催化形成25-OHVD3，然后再由腎臟中的CYP2R1催化形成1α，25-（OH）2VD3，通過這兩步反應(yīng)完成了VD3-1α，25（OH）2VD3的轉(zhuǎn)化過程?；钚?α，25（OH）2VD3在體內(nèi)與維生素D受體結(jié)合（VDH）可以調(diào)節(jié)鈣磷代謝，以及調(diào)控多種細(xì)胞應(yīng)答，如細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖等。1α，25（OH）2VD3及其衍生物在臨床上已經(jīng)被用于治療慢性腎功能衰竭、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、骨質(zhì)疏松以及銀屑病等疾?。?，4］。雖然從膽固醇到1α，25-（OH）2VD3的化學(xué)合成路線已經(jīng)成熟，但是其總產(chǎn)率卻不到1%。工業(yè)上，一般采用生物合成的方法，只需要一步就能實(shí)現(xiàn)VD3的轉(zhuǎn)化過程，且成本低，對環(huán)境的污染小。而實(shí)現(xiàn)這種生物催化反應(yīng)，關(guān)鍵在于反應(yīng)所使用的微生物菌株以及VD3羥基化酶（Vdh）的手性和特異性結(jié)構(gòu)域［2］。

大多數(shù)的細(xì)菌、真菌及放線菌如假諾卡氏菌屬自養(yǎng)菌株，鏈霉菌屬等微生物都能將無生物活性VD3轉(zhuǎn)化成有生物活性的1α，25（OH）2VD3［2］。在工業(yè)上一般采用環(huán)糊精作為底物載體，但是運(yùn)用這種方法酶的轉(zhuǎn)化能力較弱，且副反應(yīng)多，轉(zhuǎn)化菌株的生長速度低。因此為了提高Vdh的反應(yīng)活性，有必要對VD3羥基化酶的特性以及定向研究進(jìn)行概述和分析。

Vdh屬于CYP107蛋白家族成員。CYP107酶是一個超家族，其共同特點(diǎn)是含有一非共價鍵結(jié)合的血紅素，是一個內(nèi)膜蛋白，牢固地結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)膜

上，需要NADPH的還原等價物和氧分子來氧化底物，NADPH提供的電子需要氧化還原伴侶蛋白將其傳遞到細(xì)胞色素酶P450酶上。天然的P450s大多為脂溶性的，其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平比較低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。為了擴(kuò)大P450s的應(yīng)用以及增加其利用度，因此有必要提高P450s包括底物作用域、區(qū)域選擇和立體選擇性、催化活性、抑制作用及聯(lián)合表達(dá)等在內(nèi)的催化活性。

1 vdh異源細(xì)胞表達(dá)

由于游離的Vdh活性不高，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，體外反應(yīng)常表現(xiàn)出廣譜底物活性。所以研究者一般采用異源表達(dá)系統(tǒng)即宿主-載體系統(tǒng)表達(dá)Vdh基因（vdh）。大腸桿菌、酵母等作為宿主系統(tǒng)具有生長快，容易操作等優(yōu)點(diǎn)。放線菌基因組中含有許多P450酶的基因，具有穩(wěn)定的氧化還原反應(yīng)環(huán)境。因此放線菌如鏈霉菌、假諾卡氏菌、紅平紅球菌等均可作為良好的Vdh宿主菌株。Sakaki等［5］成功利用大腸桿菌（E.coli）表達(dá)小鼠25（OH）VD31α-羥基化酶。Kawauchi等［6］從自養(yǎng)無枝酸菌桿菌FEM BP-1573中分離出P450VD25（CYP105A2），成功地在變鉛鏈霉菌（S.lividans）中表達(dá)。Fujii等［2］以放線菌屬紅平紅球菌（Rhodococcus erythropolis）為宿主細(xì)胞建立了CYP107（Vdh）的表達(dá)系統(tǒng)，使CYP107的羥基化能力特異性增強(qiáng)。酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能識別線粒體和微粒體P450酶的靶向信號序列。由此相關(guān)學(xué)者從人類細(xì)胞組織中分離出CYP2R1基因，轉(zhuǎn)入大腸桿菌或釀酒酵母菌（S.cerevisiae）中表達(dá)，其CYP2R1的表達(dá)水平顯著增加。該研究發(fā)現(xiàn)重組的酵母細(xì)胞具有單氧合酶的活性，能在細(xì)胞溶質(zhì)和細(xì)胞膜上形成電子傳遞鏈［7］。刪除人CYP2R1（維生素D325-羥基化酶）與老鼠CYP2J3（維生素D325-羥基化酶）疏水性區(qū)域的氨基酸殘基后，導(dǎo)入大腸桿菌中表達(dá)，25（OH）VD31α羥基化活性特異性增加。重組的酵母細(xì)胞功能性地表達(dá)人CYP2R1，加入底物后，能將VD3催化形成25（OH）VD3［8，9］。不同的Vdh在不同的異源表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)水平不同。因此表達(dá)不同的vdh時應(yīng)選擇合適的宿主細(xì)菌。合適的異源細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)不僅能實(shí)現(xiàn)維生素D3的羥基化過程，還能合成新的代謝產(chǎn)物，并且在野生型和突變型羥基化酶的對比研究中發(fā)揮中至關(guān)重要的作用［9］。圖1和圖2分別為各種細(xì)菌和哺乳動物中VD325-和25（OH）VD31α-羥基化酶以及它們的異源表達(dá)系統(tǒng)。

表1 VD325-羥基化酶及其異源表達(dá)系統(tǒng)［1-9］

表2 25（OH）VD31α-羥基化酶及其異源表達(dá)系統(tǒng)［6-9］

2 Vdh與氧化還原伴侶蛋白協(xié)同表達(dá)

大多數(shù)天然的Vdh如果單一的在宿主細(xì)胞中表達(dá)，那么它的羥基化能力較弱。因此，Vdh在宿主細(xì)胞表達(dá)的同時需要氧化還原蛋白作為分子伴侶協(xié)同表達(dá)，提高酶表達(dá)量。常用的分子伴侶為鐵氧還原蛋白，如ThcD、AciC、Fdx、Fdr和AciB等［2，10］。Vdh是一類微粒體P450酶，能夠接受NADPH-細(xì)胞色素P450s 還原酶提供的電子。鐵氧還原蛋白酶將NADH供體提供的電子轉(zhuǎn)移到Vdh的血紅素結(jié)構(gòu)域。Fujii等［2］發(fā)現(xiàn)Vdh基因若單獨(dú)在宿主細(xì)胞當(dāng)中表達(dá)，VD3的C-25位羥基化活性較低（20.2 mmol/ min/mol），然而氧化還原伴侶蛋白ThcC/ThcD-VDh重組基因在宿主細(xì)胞當(dāng)中聯(lián)合表達(dá)后，Vdh的C-25的羥基化活性增加了近6倍（119.2 mmol/min/mol）。這些數(shù)據(jù)說明盡管內(nèi)源性的氧化還原分子同時在宿主細(xì)胞當(dāng)中表達(dá)，Vdh-氧化還原伴侶蛋白的聯(lián)合表達(dá)也能增強(qiáng)該酶的羥基化活性。Sawada等［11］成功地構(gòu)建了人的CYP27B1和牛的ADX，ADR的表達(dá)質(zhì)粒，然后導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)。CYP27B1羥基化活性特異性增加。這就說明了電子通過ADX和ADR

從NADPH成功地轉(zhuǎn)移到了CYP27B1，形成電子傳遞鏈。Strushkevish等［12］發(fā)現(xiàn)人類CYP2R1與分子伴侶蛋白GroEL/ES在大腸桿菌中協(xié)同表達(dá)，發(fā)酵培養(yǎng)物中25（OH）VD3，1α，25-（OH）2VD3的產(chǎn)量顯著增加［12］。CYP27B1是25（OH）VD3的1α羥基化酶，催化1α，25-（OH）2VD3的形成。Uchidaa等［13］將小鼠體內(nèi)的CYP271-GroEL/ES重組基因?qū)氲酱竽c桿菌中過量表達(dá)，CYP27B1的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于野生型。而缺少GroEL/ES分子伴侶蛋白時，CYP27B1酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生折疊導(dǎo)致表達(dá)水平降低。放線菌類菌株含有穩(wěn)定的Vdh，并且具有電子轉(zhuǎn)移蛋白酶，提供了氧化還原反應(yīng)的環(huán)境。因此，放線菌常用來作為工業(yè)上進(jìn)行羥基化反應(yīng)的宿主菌株。目前將氧化還原蛋白融合到Vdh的表達(dá)質(zhì)粒中協(xié)同表達(dá)是提高Vdh的25-和1α-羥基化活性一種有效的基因重組方法。

3 誘導(dǎo)表達(dá)重組質(zhì)粒

構(gòu)建Vdh表達(dá)質(zhì)粒的試驗中，研究者發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒在大腸桿菌（E.coli）/鏈霉菌（Streptomyces）中的表達(dá)水平較低，因此他們在試驗過程中加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)重組質(zhì)粒的表達(dá)，提高Vdh的表達(dá)水平。常用的誘導(dǎo)劑為丙酮、硫鏈絲菌素等。Fujii等［14］構(gòu)建了PTAOR3-VDh-boxAB重組質(zhì)粒，導(dǎo)入到P. autotrophica中表達(dá)，細(xì)胞提取物利用SDS-PAGE和CO差譜分析法（CDSA）測定其Vdh的活性。分析發(fā)現(xiàn)在加入丙酮的細(xì)胞提取物中，CDSA在P450 nm處有顯著的吸收峰，而沒有加入丙酮的細(xì)胞提取物中，CDSA在P450 nm處沒有明顯的吸收峰。SDSPAGE數(shù)據(jù)也顯示丙酮能誘導(dǎo)PTAOR3-VDh-boxAB的表達(dá)。分析結(jié)果表明丙酮能作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分子伴侶蛋白boxAB和VDh 活性的表達(dá)。同樣地，相關(guān)學(xué)者在構(gòu)建VDh-Fdx-Fdr的表達(dá)基因的同時，采用硫鏈絲菌素作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)重組質(zhì)粒在紅平紅球菌中表達(dá)。結(jié)果在紅平紅球菌的培養(yǎng)中檢測到大量的VD3的活性形式［15］。這些數(shù)據(jù)說明宿主細(xì)胞在表達(dá)Vdh和氧化還原伴侶蛋白的重組基因時，都需要加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)其表達(dá)。

4 定向構(gòu)建Vdh的突變體

由于VD3并不是Vdh的天然底物，所以研究者們采用定向誘變Vdh基因，改變底物識別域的結(jié)合位點(diǎn)來獲得更高酶活性的Vdh［16］。Fujii等［2］先從假諾卡氏屬自養(yǎng)無枝酸菌 NPRC12473分離得到Vdh基因，經(jīng)隨機(jī)突變，將其突變基因克隆到載體PET-aciBC上，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)，從1 000個轉(zhuǎn)化物中分離得到8個高活性突變體，得到4個最佳氨基酸置換，構(gòu)建出Vdh-K1的突變體。同樣地，定點(diǎn)突變也檢測到了這個8個活性位點(diǎn)。在這8個活性位點(diǎn)中，F(xiàn)ujii分析出4個最佳氨基酸置換點(diǎn)（T70R，V156S，E216A，E384R）。相對于野生型基因表達(dá)活性而言，其中每一個突變體在大腸桿菌中Vdh表達(dá)活性都提高了2-3倍。這4個突變基因同時在大腸桿菌中表達(dá)，Vdh的羥基化的活性會提高7.9倍。Fujii將這4個最佳的基因置換組合整合到前面所得到的Vdh-K1的突變菌株中表達(dá)，得到光譜數(shù)據(jù)顯示Vdh 25-羥基化的活性提高12倍，25（OH）VD3的1α-羥基化活性提高近22倍（相對于野生型Vdh-WT）［1，2，16］。文獻(xiàn)報道在Vdh-K1的培養(yǎng)物中，科學(xué)家們不僅發(fā)現(xiàn)25（OH）VD3，1α，25（OH）2VD3的含量明顯增加，還檢測到少量的26（OH）VD3，但并沒有檢測到1α（OH）VD3分子［1，17，18］。晶體結(jié)構(gòu)分析［1］表明Vdh-K1的4個氨基酸替換不是位于酶的底物結(jié)合位點(diǎn)上，而是在酶結(jié)構(gòu)呈分散排列。不管有無底物的結(jié)合，突變型Vdh-K1呈封閉的分子構(gòu)象，末端的血紅素囊狀結(jié)構(gòu)暴露在溶劑中；野生型Vdh-WT卻呈現(xiàn)開放式的分子構(gòu)象。這些結(jié)果表明通過4個氨基酸替換（T70R、V156S、E216A和E384R）使得Vdh分子構(gòu)象平衡從開放式向封閉式構(gòu)象移動［1］。Hayashi等［19］通過對細(xì)胞色素酶P450（CYP）105A1基因定向誘變，獲得R73V/R84V雙突變體，該突變體能實(shí)現(xiàn)VD3-1α，25（OH）2VD3過程的高轉(zhuǎn)化。突變點(diǎn)R73V/R84V位于CYP105A1基因中底物識別域上，具有25（OH）VD31α-高羥基化能力［16］。他們在變鉛青鏈霉菌TK23進(jìn)行重組表達(dá)，并且在該鏈霉菌的培養(yǎng)物當(dāng)檢測到大量的1α，25（OH）2VD3，除此之外，還檢測到新的代謝產(chǎn)物1α，25（R），26（OH）3D3和1α，25（S），26（OH）3D3

［16，20］。這兩種新的代謝產(chǎn)物同樣也具有抗增殖活性和低血鈣活性，但二者的轉(zhuǎn)化率不高。通過晶體結(jié)構(gòu)分析和Docking 軟件模擬底物結(jié)合方法，

Hayashi等［19］證實(shí)了R73V/R84A突變體具有VD3C25，C1和C26（C27）的羥基化的能力。從淺灰鏈霉菌中提取出的P450酶系CYP105A1具有VD2和VD3的羥基化能力。Omer等［20］通過在CYP105A1（P450SU-1）N端添加靶向信號序列，成功地將其導(dǎo)入到高等植物中的葉綠體中表達(dá)。Sawada等［21］成功地將淺灰鏈霉菌的CUP105A1重組基因?qū)氲酱竽c桿菌中表達(dá)，提高了VD3 25-和25（OH）VD3 1α-羥基化活性。Seifert等［22，23］針對CYP102A1催化位點(diǎn)上F87和A328兩個氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得24種新的突變體。這些系列突變體能識別多種底物，產(chǎn)生廣泛而有效的環(huán)化和非環(huán)化的羥基化合物。

經(jīng)過定向誘變，獲得高活性Vdh突變體，突變體不僅具有更高酶的活性，并且對反應(yīng)活性位點(diǎn)具有高度選擇性。新的穩(wěn)定構(gòu)象通常具有不同的功能特異性，因而產(chǎn)生不同的區(qū)域選擇和立體選擇性，識別不同的VD3底物分子，得到新的具有抗增殖，低血鈣等生物學(xué)功能的VD3活性藥物。為臨床上治療維生素D類疾病提供有效的途徑。

5 展望

為了提高Vdh羥基化能力，研究人員采取異源表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)vdh，協(xié)同表達(dá)氧化還原分子伴侶蛋白提高Vdh重組質(zhì)粒的表達(dá)水平，加入誘導(dǎo)劑或啟動子啟動重組質(zhì)粒的表達(dá)，定點(diǎn)突變Vdh活性位點(diǎn)提高酶的羥基化能力。除此之外，在表達(dá)Vdh基因同時，有相關(guān)學(xué)者［10，19］采用添加抗生素例如乳鏈球菌素（nisin）等方法形成乳鏈球菌素-脂質(zhì)微孔復(fù)合物，形成VD3-PMCD復(fù)合物的離子通道，提高Vdh的羥基化活性。除了上述方法外，VD3-PMCD復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞機(jī)制的研究，以及Vdh-底物晶體結(jié)構(gòu)分析，相應(yīng)靶向信號蛋白序列的添加或抑制酶活性的氨基酸殘基的刪除，Vdh的區(qū)域和立體選擇性和有序羥基化反應(yīng)的分子機(jī)制的研究等蛋白工程方面都是未來獲取更高酶活性Vdh的研究重點(diǎn)，為 Vdh的定向研究提供新的方向和前景。相信隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，活性維生素D3藥物的生物制備將會得到新的突破。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Advances in Directed Research of VD3Hydroxylase

Liu Miao Wang Yonghui Lu Qun
（School of Life Science and Engineering of Southwest Jiaotong Uiversity，Chengdu 610031）

Vitamin D3 hydroxylase is a cytochrome P450（CYP）responsible for the biocatalytic conversion of vitamin D3 to 1α, 25-dihydroxyvitamin D3（1α, 25（OH）2VD3）。Since VD3 is not a natural substrate for Vdh, the hydroxylase of Vdh is quite low. Researchers construct a novel of recombination Vdh plasmid by directed evolution to optimize the active sites of catalytic structure, thereby improving the hydroxylase ability. This article reviewed Vdh structure properties and development of directed evolution.

Vdh Heterologous expression Redox partner protein Directed evolution 25-hydroxyvitaminD3 1α 25-dihyroxyvitamin D3

2013-08-09

劉苗，女，碩士研究生，研究方向：生物轉(zhuǎn)化；E-mail：920946828@qq.com

陸群，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：微生物藥學(xué)、生物催化與降解、反應(yīng)器與生化工藝學(xué)原理；E-mail：luqun1125@126.com