黑曲霉（AS0006）產(chǎn)纖維素酶的純化研究

張歡曹焱鑫蔣林王曉明劉齊董曉瑩寇巍

（1.遼寧省能源研究所，營口 115003；2.營口市疾病預(yù)防控制中心，營口 115003）

黑曲霉（AS0006）產(chǎn)纖維素酶的純化研究

張歡1曹焱鑫1蔣林2王曉明1劉齊1董曉瑩1寇巍1

（1.遼寧省能源研究所，營口 115003；2.營口市疾病預(yù)防控制中心，營口 115003）

利用實驗室中黑曲霉菌株AS0006進行粗酶發(fā)酵，對產(chǎn)出的纖維素酶液進行不同飽和度（NH4）2SO4的分級沉淀，經(jīng)過Sephadex G-25、Sephadex G-100分離純化后，得到兩種內(nèi)切酶（EG）組分、一種外切酶（CBH）組分。通過酶活性及電泳檢測發(fā)現(xiàn)，兩種EG酶組分的相對分子質(zhì)量分別為29.63 kD、37.49 kD，CBH酶組分相對分子質(zhì)量為56.51 kD。相較原始粗酶液，EG回收率可達18.07%、純化倍數(shù)為3.46，CBH回收率可達12.96%、純化倍數(shù)為4.14，β-葡萄糖苷酶（CB）回收率可達22.37%、純化倍數(shù)為3.58。

黑曲霉 纖維素酶 分離純化

黑曲霉作為一種重要的產(chǎn)纖維素酶菌種，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)。相對于常用的綠色木霉和里氏木霉等菌株，黑曲霉具有安全無毒素，胞外分泌纖維素酶便于提純，β-葡萄糖苷酶糖化能力較強等優(yōu)點，成為產(chǎn)酶菌種的重要研究對象［1-3］。目前，國內(nèi)外學(xué)者對于黑曲霉的研究多集中在培育條件的優(yōu)化、分離提純、固定化以及基因遺傳操作等方面，但在產(chǎn)出酶的相互作用關(guān)系和酶解機制方面研究進展緩慢，成為制約纖維素酶菌種應(yīng)用的瓶頸［4-6］。纖維素酶是一組起協(xié)同作用的復(fù)合酶系，菌種來源不同，所產(chǎn)生的纖維素酶系組分亦不相同，而即使同一來源的纖維素酶組分也會隨菌株生長培養(yǎng)條件的不同而有所差異，對單一的酶組分的純化研究可實現(xiàn)對其性質(zhì)及其它酶組分之間相互作用關(guān)系的了解，分析纖維素酶的酶解機制，從而為獲得針對秸稈等不同纖維原料復(fù)合酶制劑提供理論依據(jù)，因此在纖維素酶的分離純化技術(shù)和研究方法上取得突破至關(guān)重要［7-9］。針對上述問題，本試驗選用課題組自行篩選出的一株產(chǎn)纖維素酶的黑曲霉菌株AS0006，并對其所產(chǎn)酶系進行分離純化。純化過程采用不同飽和度（NH4）2SO4分級沉淀、Sephadex G-25除鹽、Sephadex G-100分離提純、SDS-PAGE電泳檢測。并詳細計算了各酶組分比活力、純化倍數(shù)及回收率等重要參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 黑曲霉菌株AS0006篩選自黑龍江省伊春金山屯林區(qū)土壤，因篩選出的6株產(chǎn)纖維素酶菌株中，其各協(xié)同酶組分活力及濾紙酶活力均達到最大（內(nèi)切葡聚糖酶活力為60.88 U/mL，外切葡聚糖酶活力為14.94 U/mL，β-葡萄糖苷酶活力為65.08 U/mL，濾紙酶活力為76.72 U/mL），故選用黑曲霉AS0006所產(chǎn)的纖維素酶作為分離純化的研究對象。

1.1.2 培養(yǎng)基 利用Design-Expert正交設(shè)計軟件得到黑曲霉AS0006優(yōu)化培養(yǎng)基為稻草粉9.47 g/L，麩皮49.33 g/L，（NH4）2SO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，蒸餾水3 L，pH6.0。121℃滅菌20 min。

1.1.3 試驗儀器 CXG-A電腦恒溫層析柜（上海精科公司）；HL-2恒流泵，HD-2000紫外檢測儀，BSZ-100自動部分收集器，HD-A電腦層析采集儀（上海嘉鵬公司）；DZF-6020濃縮真空干燥箱（上海博迅公司）；DYY-10C電泳系統(tǒng)（北京六一儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 纖維素酶活力的測定 纖維素各協(xié)同酶組分活力測定參照Horikoshi方法［10］，酶活力單位定義參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB2583-2003。蛋白質(zhì)含量測定按考馬斯亮藍（Bradford）染色法［11］，以A595牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 （NH4）2SO4鹽析分級沉淀 將經(jīng)離心抽濾后得到的酶清液依次用30%、60%、70%、90%飽和度的（NH4）2SO4進行分級沉淀，8 000 r/min、4℃離心20 min，收集蛋白沉淀，分別溶于量檸檬酸-磷酸（pH 5.0）緩沖液中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 Sephadex G-25凝膠過濾除鹽 本試驗采用Sephadex G-25凝膠過濾技術(shù)對（NH4）2SO4分級沉淀后所得的各蛋白酶液除鹽，5 mL蛋白上樣量至1.0 cm×20 cm層析柱中，以pH 5.0的檸檬酸-磷酸緩沖液平衡并洗脫，洗脫速度1 mL/min，收集對應(yīng)各峰的蛋白酶液進行酶活性及蛋白含量的測定。

1.2.4 酶液的濃縮 將酶液至于30℃條件下，0.08 MPa恒壓真空干燥。干燥后的酶蛋白用檸檬酸-磷酸（pH5.0）緩沖液定溶至5 mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 Sephadex G-100分子篩凝膠過濾層析 將去鹽濃縮后的5 mL蛋白清液上樣于經(jīng)檸檬酸-磷酸（pH5.0）平衡好的Sephadex G-100凝膠層析柱（1.6 cm×80 cm），以平衡緩沖液洗脫，洗脫速度0.5 mL/min，收集所有出峰酶液，對其進行酶活性及蛋白含量的測定。

1.2.6 SDS-PAGE蛋白電泳 采用SDS-PAGE不連續(xù)垂直凝膠電泳，電極液采用Tris-甘氨酸緩沖體系，分離膠緩沖液pH8.8，濃度為10%，濃縮膠緩沖液pH6.8，濃度為5%，70 V恒壓電泳2.5 h［12］。

2 結(jié)果

2.1 Sephadex G-25凝膠過濾脫鹽效果分析

圖1 60%（NH4）2SO4沉淀蛋白脫鹽層析圖

圖2 70%（NH4）2SO4沉淀蛋白脫鹽層析圖

圖3 90%（NH4）2SO4沉淀蛋白脫鹽層析圖

圖1 -圖3分別為3種不同飽和度（60%、70%、90%）（NH4）2SO4沉淀出的蛋白經(jīng)過Sephadex G-25凝膠過濾后的層析譜圖，其中30%飽和度析出的為雜蛋白，故忽略不計。經(jīng)分析得知各圖中對應(yīng)的第1個峰均為蛋白活性峰，第2個是無機鹽和小分子蛋白峰。這是因為在分子篩層析脫鹽的過程中蛋白質(zhì)相對分子量和鹽的相對分子量差異巨大，蛋白酶液中小分子鹽會隨著溶劑進入凝膠顆粒的網(wǎng)孔中，使其保留時間變長、遷移速率變慢。而相對分子量較大的蛋白質(zhì)卻不能隨著溶劑進入到凝膠網(wǎng)孔中，因此可以先于小分子鹽從層析柱中流出，從而實現(xiàn)除鹽效果。經(jīng)過研究分析后，將各圖中對應(yīng)第一個峰中的蛋白清液分別收集起來，進行酶活力及蛋白含量測定試驗。

2.2 脫鹽酶液酶活性檢測分析

圖4中每組柱形圖分別表示經(jīng)過不同飽和度（60%、70%、 90%）（NH4）2SO4分級沉淀除鹽后，蛋白酶液中各協(xié)同酶組分活力參數(shù)的比較。在每組飽和度情形下，柱形圖從左至右的順序依次為內(nèi)切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CBH）和β-葡萄糖苷酶（CB）活力。

圖4 不同飽和度（NH4）2SO4沉淀脫鹽后酶活力測定

由圖4可知，經(jīng)過60%飽和度（NH4）2SO4沉淀脫鹽后的蛋白酶液中CBH和CB酶活力很低，幾乎沒有；EG酶活力低于70%、90%飽和度（NH4）2SO4脫鹽酶液中的酶活性。經(jīng)90%飽和度（NH4）2SO4沉淀脫鹽酶液中，雖然含有的CB要高于70%飽和度的脫鹽酶液，但其不存在CBH，且EG活力要低于70%飽和度的脫鹽酶液，所以綜合考慮到各單一酶活力及協(xié)同效應(yīng)。本試驗選取經(jīng)70%飽和度（NH4）2SO4沉淀后的脫鹽蛋白酶液作為進一步分離純化的研究對象。測試分析后，經(jīng)70%飽和度（NH4）2SO4沉淀除鹽后的蛋白酶液中EG酶活力可達180.21 U/mL，CBH酶活力可達41.53 U/mL，CB酶活力為217.35 U/mL，蛋白質(zhì)含量為596.75 μg/mL。

2.3 Sephadex G-100層析

將脫鹽濃縮后的5 mL蛋白酶液用Sephadex G-100葡聚糖凝膠分離提純，層析結(jié)果如圖5所示。

圖5 Sephadex G-100純化蛋白層析圖

從圖5凝膠層析譜圖中可以看出，脫鹽酶液經(jīng)過Sephadex G-100進一步分離純化后，出現(xiàn)了5個主要的蛋白活性峰。通過對各協(xié)同酶組分活力參數(shù)的分析發(fā)現(xiàn)EG酶主要集中在主峰Ⅴ中，CBH主要集中在Ⅲ峰中，而CB酶則主要集中在Ⅰ峰內(nèi)。

2.4 純化回收率的計算

對比分析各分離純化步驟中單一酶組分的比活力、回收率及純化倍數(shù)，其結(jié)果見表1-表3所示。

分析表中數(shù)據(jù)可知，Sephadex G-25脫鹽雖會造成部分蛋白酶的損失，但卻存在一定分離提純的效果。經(jīng)Sephadex G-25脫鹽后各協(xié)同酶組分純化倍數(shù)分別為1.59、3.12、1.36。經(jīng)Sephadex G-100分離純化后各組分酶比活力得到顯著提高，其數(shù)值分別為1 031.43 U/mg、274.73 U/mg、1 280.18 U/mg，純化倍數(shù)分別為3.46、4.14、3.58。

表1 EG酶的純化效果

表2 CBH酶的純化效果

表3 CB酶的純化效果

2.5 SDS-PAGE蛋白電泳檢測

經(jīng)上述研究發(fā)現(xiàn)，分離純化后3種協(xié)同酶組分主要集中在3個不同的主峰中，分別收集3個峰對應(yīng)的蛋白酶液，通過SDS-PAGE電泳檢測（圖6），計算出現(xiàn)的單一條帶酶組分的相對分子質(zhì)量。

圖6 Sephadex G-100純化后各酶組分的電泳檢測結(jié)果

從圖6泳道1中可以看出有兩條單一的蛋白電泳條帶存在，說明分離純化出兩種EG酶組分，分析原因可能是因為在Sephadex G-100層析圖譜主峰Ⅴ旁出現(xiàn)一個較小的肩峰，但因相對分子質(zhì)量太過接近，出峰時間太快，未能使得EG酶組分得到較好的分離，根據(jù)標(biāo)記蛋白分子量及其相對遷移率，計算出兩種EG酶組分相對分子量分別為29.63 kD、 37.49 kD。CBH酶在泳道2中呈現(xiàn)出一條單一蛋白電泳條帶，表明已達到電泳純程度，計算其相對分子量為56.51 kD。CB酶在泳道3中基本為單條帶，但稍有拖帶現(xiàn)象出現(xiàn)，說明樣品的純度不夠，使得雜質(zhì)蛋白成為CB酶蛋白的干擾項，這與在Sephadex G-100層析圖譜中看出的，且在CB酶純化的過程中形成一個相對較寬的譜峰（Ⅰ）結(jié)論相吻合，雖然未能達到電泳純程度，但可知其相對分子量范圍在115.74 -168.33 kD之間。可見，通過上述純化步驟，已基本實現(xiàn)了不同種類纖維素酶的純化工作。

3 討論

綜合考慮除鹽后各單一酶組分活性及協(xié)同效應(yīng)，本試驗選取經(jīng)70%飽和度（NH4）2SO4沉淀后的除鹽酶液進行后續(xù)分離純化的工作，經(jīng)Sephadex G-100分子篩凝膠過濾后發(fā)現(xiàn)，與粗酶液相比，其EG酶的比活力由298.04 U/mg提高到1 031.43 U/mg，回收率達到18.07%、純化倍數(shù)達到3.46，CBH酶的比活力由66.37 U/mg升高到274.73 U/mg，回收率為12.96%、純化倍數(shù)為4.14，而CB酶的比活力由原來的357.67 U/mg提高到1 280.18 U/mg，回收率可達22.37%、純化倍數(shù)達到3.58。單一酶組分的回收率均較低下，其原因可能是由于純化過程操作步驟較繁瑣，導(dǎo)致纖維素酶部分失活所致［13，15］。通過SDS-PAGE電泳檢測分析可知，純化出的兩種EG酶

組分相對分子質(zhì)量分別為29.63 kD、37.49 kD，CBH酶相對分子量為56.51 kD，至于CB酶蛋白因為一些干擾項的存在，沒有達到電泳純程度，可確定其相對分子量范圍在115.74 -168.33 kD之間［16，17］。

4 結(jié)論

本試驗選用黑曲霉菌株AS0006產(chǎn)生的纖維素酶系進行純化特性分析，為纖維素酶在酶解機理方面的研究奠定了理論基礎(chǔ)，使其對纖維素復(fù)合酶制劑的開發(fā)具有一定指導(dǎo)意義，以達到能夠獲得高活性纖維素復(fù)合酶制劑的目的。

［1］ 閆會平, 陳士華, 吳興泉.黑曲霉 β-葡萄糖苷酶的研究進展［J］.纖維素科學(xué)與技術(shù), 2007, 15（1）：59-63.

［2］ 蔡鳳. 黑曲霉產(chǎn)纖維素酶的分離純化及性質(zhì)研究［D］.南京：南京理工大學(xué), 2006.

［3］ 梁翠誼, 許敬亮, 袁振宏, 等. β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株及其應(yīng)用研究［J］.中山大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2013（1）：118-122.

［4］ 郭艷梅, 鄭平, 孫際賓.黑曲霉作為細胞工廠：知識準(zhǔn)備與技術(shù)基礎(chǔ)［J］.生物工程學(xué)報, 2010, 26（10）：1410-1418.

［5］ 張瑩瑩, 張會, 李杰.構(gòu)建β-甘露聚糖酶的黑曲霉工程菌［J］.生物技術(shù), 2013, 23（3）：31-36.

［6］ 劉玲玲, 朱松, 朱婷, 等.重組β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)龍膽低聚糖的工藝條件優(yōu)化［J］.微生物學(xué)報, 2009, 49（5）：597-602.

［7］ 劉家英, 唐芳, 張林波, 等.擔(dān)子菌纖維素酶的分離與純化［J］.吉林農(nóng)業(yè), 2010, 5：30-31

［8］ Hanhui M, Janel RM, Lucy FC, et al. A highly efficient multifunctional tandem affinity purification approach applicable to diverse organisms［J］. Mol Cell Proteomics, 2012, 11：501-511.

［9］ Rabinovich ML, Melink MS, Bolobova AV. Cellulases from microorganisms［J］. Prikl Biokhim Microbiol, 2002, 38（4）：355-373.

［10］ Mesut T, Gani ET, Umit I. Citric acid production from Aspergillus nigerMT-4 using hydrolysate extract of the insectLocusta migratoria［J］. Toxicology and Industrial Health, 2013, 29：426-434.

［11］ Kimran H, Malcolm S, David BA. Structural features of sugars that trigger or support conidial germination in the filamentous fungusAspergillus niger［J］. Appl Envir Microbiol, 2013, 79：6924-6931.

［12］ Lintao B, Mark RN, Michael RS, et al. Product binding varies dramatically between processive and nonprocessive cellulase enzymes［J］. J Biol Chem, 2012, 287：24807 - 24813

［13］ 王希國. 梅林青霉對纖維素降解特性及機制的研究［D］.哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2007.

［14］ 孫憲昀. 斜臥青霉木質(zhì)纖維素酶系的合成調(diào)控研究［D］.濟南：山東大學(xué), 2007.

［15］ Mun KC, Krupakar P, Hui YY, et al. Optimized sequential purification protocol forin vivosite-specific biotinylated full-length dengue virus capsid protein［J］. Protein Eng Des Sel, 2013, 26：377-387.

［16］ 燕紅. 兩株芽胞桿菌纖維素酶誘導(dǎo)產(chǎn)生機制及其作用的研究［D］.哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2007.

［17］ Miguel R, Najla V, Dongli G, et al. Engineering split intein DnaE fromNostocpunctiforme for rapid protein purification［J］. Protein Eng Des Sel, 2013, 26：215-223.

（責(zé)任編輯 李楠）

Study on Purification of Cellulase from Aspergillus niger AS0006

Zhang Huan1Cao Yanxin1Jiang Lin2Wang Xiaoming1Liu Qi1Dong Xiaoying1Kou Wei1
（1. Liaoning Institute of Energy Resources，Yingkou 115003；2. Yingkou Center for Disease Control and Prevention，Yingkou 115003）

Two endoglucanases（EG）components and a cellobiohydrolase（CBH）from Aspergillus niger AS0006 were separated and purified by（NH4）2SO4fractional precipitation, Sephadex G-25 and Sephadex G-100 chromatography. According to cellulase activity and electrophoresis detection found that the molecular weight of two EG components were 29.63 kD and 37.49 kD, respectively, the molecular weight of CBH component was 56.51 kD. Compared to the crude enzyme, the recovery rate of EG components could reach 18.07%, the purification fold was 3.46, the recovery rate of CBH component could reach 12.96%, the purification fold was 4.14, the recovery rate of β-glucosidase（CB）could reach 22.37% and the purification fold was 3.58.

Aspergillus niger Cellulase Purification

2013-11-03

國家“863”課題（2013AA050701）

張歡，女，助理研究員，研究方向：木質(zhì)纖維素燃料乙醇技術(shù)；E-mail：zhanghuan032987@163.com

寇巍，E-mail：kouwei6@126.com