黑曲霉嗜熱β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中的克隆表達及其魔芋降解產(chǎn)物分析

倪玉佳周旻昱歐陽嘉，3鄭兆娟勇強

（1.南京林業(yè)大學化學工程學院，南京 210037；2.南京林業(yè)大學森林資源與環(huán)境學院，南京 210037；3.江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學品重點實驗室，南京 210037）

黑曲霉嗜熱β-甘露聚糖酶在畢赤酵母中的克隆表達及其魔芋降解產(chǎn)物分析

倪玉佳1周旻昱2歐陽嘉1，3鄭兆娟1勇強1

（1.南京林業(yè)大學化學工程學院，南京 210037；2.南京林業(yè)大學森林資源與環(huán)境學院，南京 210037；3.江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學品重點實驗室，南京 210037）

根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化設計合成一段來自黑曲霉BK01的嗜熱β-甘露聚糖酶基因，通過構(gòu)建表達載體pPICZαA-man線性化后電轉(zhuǎn)化入不同的畢赤酵母宿主，獲得最佳重組菌KM71-MAN，其發(fā)酵罐發(fā)酵酶活最高達2 318.85 IU/mL。表達產(chǎn)物純化后的分子量約為40 kD，最適反應溫度為80℃，最適pH為5.0。該酶在70℃（pH5.0）保溫44 h仍能保留43%的酶活力且在pH3.0-7.0范圍內(nèi)保溫70 h（50℃）酶活力仍能保留85%以上。利用發(fā)酵罐所產(chǎn)重組酶酶解魔芋膠制備甘露低聚糖，產(chǎn)物以甘露二糖和甘露六糖為主，甘露低聚糖得率為55.6%。該重組β-甘露聚糖酶具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，在魔芋制備甘露低聚糖中具有較好的應用潛能。

β-甘露聚糖酶 密碼子偏好性 畢赤酵母 酶學性質(zhì) 低聚甘露糖

β-甘露聚糖酶是一類半纖維素水解酶，能夠水解含有甘露糖苷鍵的甘露聚糖（包括異甘露聚糖）［1］，廣泛存在于動植物和微生物中，在造紙、紡織印染、洗滌、食品、飼料、醫(yī)藥和石油開采等工業(yè)中有著廣闊的應用前景［2］。該酶水解獲得的產(chǎn)物甘露低聚糖具有促進人和動物腸道內(nèi)以雙歧桿菌為代表的有

益菌的增殖、改善腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)等功能性低聚糖共同的理化特性［3］，同時也有清除自由基、增強機體抗氧化性的能力［4］，若將甘露低聚糖作為功能性食品添加劑應用于工業(yè)開發(fā)，應用前景十分廣闊。

我國魔芋資源豐富，主要分布在我國西南部山區(qū)，目前主要作為一種粗纖維糧食或食品添加劑使用，附加值比較低［5］，魔芋膠酶法降解為高附加值的甘露低聚糖可獲得較大的經(jīng)濟效益，對于魔芋資源下游產(chǎn)業(yè)的拓寬和提高魔芋附加價值具有重要意義?；诖耍狙芯恐荚陂_發(fā)制備可應用于低聚甘露聚糖生產(chǎn)的嗜熱性甘露聚糖酶，優(yōu)化設計合成黑曲霉嗜熱β-甘露聚糖酶基因，并在畢赤酵母中實現(xiàn)高效表達，研究分析重組酶的酶學性質(zhì)，為甘露聚糖酶在酶法制備甘露低聚糖奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 含有man基因片段的重組質(zhì)粒載體pGH購自上海捷瑞生物工程有限公司；大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α購自南京天為生物科技有限公司；畢赤酵母表達載體pPICZαA購自Invitrogen公司；畢赤酵母GS115、KM71H、SMD1168、X-33為本實驗室保存。

1.1.2 工具酶和生化試劑 質(zhì)粒提取試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ、T4連接酶、DNA 相對分子質(zhì)量標準、凝膠回收試盒購自寶生物工程有限公司（大連）；線性化酶SacⅠ購自Fermentas公司；博來霉素購自Invitrogen公司；洋槐豆膠、牛血清蛋白、考馬斯亮藍R-250 購自Sigma公司；Yeast extract、Peptone、Tryptone購自Oxoid公司。魔芋購自云南市場。其他生化試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB、LLB培養(yǎng)基用于大腸桿菌的培養(yǎng)，YPD、YDPS、BMGY和BMMY用于畢赤酵母增殖培養(yǎng)、篩選和表達，發(fā)酵基礎培養(yǎng)基BMS用于高密度發(fā)酵，具體配方見 Invitrogen公司的畢赤酵母操作手冊。

1.2 方法

1.2.1 重組畢赤酵母表達載體的構(gòu)建 將含有目的基因的pGH-man質(zhì)粒模板經(jīng)EcoR I和XbaI雙酶切后獲得目的基因片段man，繼而構(gòu)建到帶有高效甲醇誘導啟動子AOX 的畢赤酵母表達載體pPICZαA上，命名為pPICZαA-man。

1.2.2 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化 重組質(zhì)粒pPICZαA-man經(jīng)SacI線性化后，分別電轉(zhuǎn)化入GS115、KM71H、SMD1168、X-33酵母感受態(tài)細胞。電轉(zhuǎn)化參數(shù)為：1 500 V，25 μF，200 Ω。電轉(zhuǎn)化后取 200 μL涂布于含有100 μg/mL博來霉素的YPDS平板上，30℃條件下培養(yǎng)直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。同時取200 μL的感受態(tài)細胞作為參照。

1.2.3 重組畢赤酵母工程菌株的誘導表達 將陽性轉(zhuǎn)化子接種于含 25 mL BMGY 培養(yǎng)基中的 250 mL的搖瓶中，30℃下 220 r/min搖床培養(yǎng)至OD600=2-6。室溫離心收集菌體，輕輕倒出上清液，用BMMY液體培養(yǎng)基將細胞重懸至OD600為1.0以誘導表達（加入約100-200 mL液體培養(yǎng)基）。28℃，220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)，每 24 h補加適量100%甲醇至終濃度為 1%。每 12 h取樣，離心收集上清液，即為粗酶液。

1.2.4 重組畢赤酵母高密度發(fā)酵 整個發(fā)酵過程分為初始甘油生長階段，甘油流加階段及甲醇誘導培養(yǎng)3個階段。種子液于30℃下 220 r/min搖床培養(yǎng)至OD600=2-6，以體積分數(shù)10%的接種量接種于甘油含量為40 g/L的BMS（4.35 mL PTM1 /L）培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐中，初始裝液量1.5 L。全程采用NBS Bioflo110 3 L發(fā)酵罐自動調(diào)控溫度為30℃、pH為5.0（28%的氨水調(diào)控）下培養(yǎng)。重組酵母在發(fā)酵罐培養(yǎng)24 h左右后，當甘油耗盡（表現(xiàn)為溶氧 DO 突然反彈），濕重在90-150 g/L后，繼而以18.15 mL（h·L）的速度流加甘油4 h。停止流加甘油至DO再次反彈后饑餓培養(yǎng)1 h，當細胞濕量達到180-220 g/L后，開始流加甲醇誘導培養(yǎng)基。

1.2.5 重組β-甘露聚糖酶的純化 將發(fā)酵罐所產(chǎn)β-甘露聚糖酶粗酶液采用快速蛋白液相層析系統(tǒng)（?KTA Explorer，GE 公司）進行凝膠過濾純化。層析柱：柱長30 cm，直徑1 cm；層析介質(zhì)：Superdex 75 PrepGrade 凝膠過濾填料，購于GE 公司；流動壓力：0.3 MPa；流速：0.3 mL/min；流動相：100 mmol/L pH 5.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液；上樣量為0.5 mL，系統(tǒng)采用Unicorn 5.0 控制軟件。

1.2.6 重組畢赤酵母表達產(chǎn)物酶活測定 采用 DNS

定糖法測定甘露聚糖酶的活性［6］。將0.9 mL 5.0 g/L洋槐豆膠底物溶液（pH5.0 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液），加入0.1 mL經(jīng)適當稀釋的酶液80℃反應10 min。立即在試管中加入3.0 mL DNS試劑，煮沸7 min，冷卻后定容至25 mL，搖勻。在540 nm處以蒸餾水空白測定樣液吸光度。甘露聚糖酶活力單位定義為每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μmol的甘露糖所需的酶量定義為一個活力單位（1 IU）。

1.2.7 重組畢赤酵母表達產(chǎn)物蛋白濃度測定及SDSPAGE 利用Bradford 法測定蛋白含量，以牛血清蛋白作為標準蛋白繪制標準曲線；分別取不含重組質(zhì)粒和含重組質(zhì)粒的酵母發(fā)酵上清液10 μL，進行10%的SDS-PAGE電泳，分析重組蛋白的表達情況。

1.2.8 重組β-甘露聚糖酶酶解魔芋制備甘露低聚糖 以50 g/L魔芋精粉（葡甘聚糖含量為：74%）為底物（pH5.0 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液），30 mL體系中包括50 U/g粗酶液，80℃下于恒溫水浴鍋振蕩酶解2 h。反應結(jié)束后100℃下10 min滅酶活。混合液12 000 r/min離心10 min，收集上清，利用離子色譜對產(chǎn)物組分進行分析。儀器：DIONEX ICS 3000；分析柱：CarboPacTMPA 200；流速：0.25 mL/min；柱溫：30℃；流動相：100 mmol/L NaOH；檢測器：標準四電化學檢測器；進樣量：10 μL；時間：40 min。

低聚糖得率（%）=C2、C3、C4、C5、C6/C×74%× 100%

其中，C2、C3、C4、C5：酶解液中甘露二、三、四、五、六糖的濃度（g/L）；C：魔芋精粉濃度（g/L）；74%：葡甘聚糖含量。

2 結(jié)果

2.1 畢赤酵母重組表達載體的構(gòu)建

按照畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化合成設計一段來自黑曲霉BK01 β-甘露聚糖酶的基因（FJ268574），優(yōu)化密碼子修改率達37.5%。優(yōu)化后的基因長為1 035 bp，編碼345個氨基酸。將此含有目的基因的pGH-man質(zhì)粒模板經(jīng)EcoR I和XbaI酶切后獲得目的基因片段man，與pPICZαA 載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶切得到的約 3.5 kb載體片段連接，得到重組表達載體pPICZαA-man。其中目的基因大小為1 035 bp，EcoR I和XbaI雙酶切片段長度為1 035 bp，雙酶切后條帶在圖1中1 000 bp左右相符。重組質(zhì)粒大小約為4.5 kb，經(jīng)過SacI線性化后，電泳結(jié)果與理論值相符。

圖1 重組質(zhì)粒pPICZαA-man的酶切驗證

2.2 重組β-甘露聚糖酶的誘導表達及其純化

2.2.1 畢赤酵母宿主優(yōu)化 將得到的線性化pPICZαA-man質(zhì)粒導入不同的巴斯德畢赤酵母宿主（GS115、KM71H、SMD1168、X-33），在Zeocin 100 μg/mL的YPDS平板上得到轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過搖瓶篩選，如圖2所示，宿主為GS115和SMD1168時，菌株發(fā)酵活力偏低；而KM71H和X-33作為宿主發(fā)酵能力較佳，甲醇緩慢利用型的KM71H宿主更為突出。本試驗得到的重組酵母KM71-MAN在搖瓶中甲醇誘導96 h后菌株發(fā)酵活力達到251.45 IU/mL，因此最佳宿主為KM71H。

圖2 不同畢赤酵母宿主對重組β-甘露聚糖酶生產(chǎn)的影響

2.2.2 重組畢赤酵母KM71-MAN高密度發(fā)酵 將篩選到最佳重組酵母菌KM71-MAN在3 L發(fā)酵罐中放大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為裝液量1.5 L、接種量10%、

30℃、pH5.0。如圖3所示，隨著時間的推移，菌株所產(chǎn)酶量穩(wěn)步增加，兩者近似呈現(xiàn)出線性關系。甲醇誘導96 h后菌株發(fā)酵活力達到2 318.85 IU/mL，蛋白濃度達2.82 g/L，在國內(nèi)處于較高的水平。

圖3 重組β-甘露聚糖酶3L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶歷程

2.2.3 重組β-甘露聚糖酶的純化 用發(fā)酵所得粗酶液經(jīng)一步Superdex 75 PrepGrade凝膠過濾，得到電泳純β-甘露聚糖酶（圖4）。純化后酶活力回收率為93.3%，酶比活由822.29 IU/mg 提高到了1 167.65 IU/mg，純化倍數(shù)為1.42。而本試驗電泳分析結(jié)果表明，表達的產(chǎn)物分子量約為40 kD，與理論值相符。

圖4 重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖

2.3 重組β-甘露聚糖酶的酶學性質(zhì)

進一步考察pH對酶活力的影響，結(jié)果如圖5-A所示，重組甘露聚糖酶最適pH值為5.0，當pH處于4-6之間時，該酶均有大于95%的相對酶活。pH穩(wěn)定性結(jié)果如圖5-B，pH 在3-7之間時，酶液在50℃下是非常穩(wěn)定的，在70 h內(nèi)酶活力能保存在85%以上，說明該酶在較寬的pH范圍內(nèi)具有較好的pH穩(wěn)定性，而且酸耐受性非常好。

圖5 重組β-甘露聚糖酶的最適pH（80℃）（A）和pH穩(wěn)定性（50℃）（B）

溫度對酶活力的影響結(jié)果如圖6-A所示，酶的最適反應溫度為80℃，70℃時的酶活力還保持在87.27%的相對酶活，90℃時仍然具有高達76.78%的相對酶活，甚至在100℃下仍然沒有失去活力，可見該酶是一種耐高溫的酶。溫度穩(wěn)定性結(jié)果如圖6-B，在溫度為50℃時穩(wěn)定性最佳，70 h內(nèi)保持了95%以上的相對穩(wěn)定性，且60℃時70 h內(nèi)仍然保持89%以上的酶活力，在70℃下44 h時也保持43%相對活力，說明該酶具有較高的溫度穩(wěn)定性，而且耐受性非常好。

2.4 重組β-甘露聚糖酶的降解產(chǎn)物分析

本試驗以50 g/L的魔芋精粉為底物，在pH 5.0下80℃酶解2 h，其甘露低聚糖得率為55.6%。魔芋精粉降解后產(chǎn)物成分含量如圖7所示，其中以甘露二糖最多含量為45.5%；甘露六糖次之，達到了34.3%；而甘露一糖、三糖、四糖含量分別為7.5%，8.8%，3.4%；甘露五糖極少。本試驗獲得了大量的甘露低聚糖，而單糖很少，在后續(xù)制備低聚糖成品中極具優(yōu)勢。

圖6 重組β-甘露聚糖酶的最適溫度（pH5.0）（A）和溫度穩(wěn)定性（pH5.0）（B）

圖7 甘露聚糖酶酶解魔芋降解產(chǎn)物的離子色譜圖

3 討論

隨著功能性食品在實際生產(chǎn)生活中越來越受歡迎，低聚糖的生產(chǎn)應用研究也隨之持續(xù)升溫。近年來關于利用β-甘露聚糖酶酶法制備甘露低聚糖的研究較多，到目前為止已經(jīng)有多種不同生物來源的β-甘露聚糖酶基因得到克隆和表達。

畢赤酵母是目前應用最為廣泛和成功的外源蛋白表達系統(tǒng)，有研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型的畢赤酵母作為宿主有時會顯著影響基因的表達量［7，8］。本試驗在不同的巴斯德畢赤酵母宿主（GS115、KM71H、SMD1168、X-33）中成功獲得β-甘露聚糖酶的分泌表達，同時也確定了KM71H為最佳宿主。在某些情況下，菌株緩慢生長更有利于蛋白質(zhì)的折疊［9］，如Cos等［10］利用甲醇緩慢利用型和快速利用型分別表達米根霉脂肪酶，發(fā)現(xiàn)在外源表達時緩慢利用型擁有更高的效率，其發(fā)酵酶比活是快速利用型的1.4倍。

高密度發(fā)酵能夠在線調(diào)控某些參數(shù)，使得菌體在最佳條件下生長，獲得高的表達量，如來源于里氏木霉RUT-C30的內(nèi)切β-甘露聚糖酶在5 L發(fā)酵罐中誘導120 h酶活力達470 IU/mL，蛋白濃度達1.5 g/L［11］。本試驗通過3 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)篩選得到的最佳重組菌KM71-MAN，甲醇誘導96 h后菌株發(fā)酵活力達到2 318.85 IU/mL，蛋白濃度達2.82 g/L，在國內(nèi)處于較高的水平。畢赤酵母含有許多翻譯后修飾功能，如蛋白質(zhì)折疊，糖基化等，但不同的畢赤酵母在分泌重組蛋白時糖基化程度不均一，本試驗在畢赤酵母KM71H中分泌的重組β-甘露聚糖酶電泳圖表明為非糖基化的形式存在于發(fā)酵液中。

盡管一些耐熱的甘露聚糖酶已被研究，如來源于黑曲霉WM20-11的β-甘露聚糖酶，其最適溫度為70℃，但在70℃下保溫1 h后相對酶活就降至50%左右［12］；來源于枯草芽孢桿菌SA-22的β-甘露聚糖酶70℃的酶活半衰期僅為3 h［13］。本試驗構(gòu)建所獲的重組β-甘露聚糖酶，最適反應溫度為80℃，最適pH5.0，且該酶在70℃（pH5.0）保溫44 h仍能保留43%的酶活力，在pH 3.0-7.0范圍內(nèi)保溫70 h（50℃）酶活力仍能保留85%以上，展現(xiàn)了良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，具有較好的未來發(fā)展前景。

不同來源的β-甘露聚糖酶作用于不同的底物，其降解產(chǎn)物分布不同。喬宇等［14］以洋槐豆膠為底物進行酶水解，其主要產(chǎn)物為甘露一糖和甘露二糖。本試驗以魔芋為底物，產(chǎn)物以甘露二糖和甘露六糖為主，酶解魔芋膠制備甘露低聚糖得率為55.6%，非常適合于魔芋甘露低聚糖的制備工藝，未來發(fā)展前景不容小覷。

4 結(jié)論

首次將黑曲霉第5家族β-甘露聚糖酶基因

（FJ268574）進行密碼子優(yōu)化后成功在畢赤酵母中表達。篩選獲得的重組菌KM71-MAN在搖瓶和3 L發(fā)酵罐中誘導96 h后發(fā)酵活力分別為251.45 IU/mL和2 318.85 IU/mL，在國內(nèi)處于較高水平。酶學性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，該酶蛋白分子量大小與理論值相符，未發(fā)生糖基化現(xiàn)象，反應最適溫度為80℃，最適pH為5.0，具有優(yōu)良的耐熱性和寬的pH穩(wěn)定性，酶解產(chǎn)物以甘露二糖和甘露六糖為主，酶解魔芋膠制備甘露低聚糖得率為55.6%，非常適合于魔芋甘露低聚糖的制備工藝，具有極大的發(fā)展前景。

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（責任編輯 李楠）

Cloning，Expression of Thermostable β-mannanase and the Preparation of Mannooligosaccharide

Ni Yujia1Zhou Minyu2Ouyang Jia1，3Zheng Zhaojuan1Yong Qiang1
（1. College of Chemical Engineering，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037；2. College of Forest Resource & Environment，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037；3. Jiangsu Key Lab of Biomass-based Green Fuels and Chemicals，Nanjing 210037）

According to the Pichia pastoris’s codon preference, a DNA sequence encoding Aspergillus niger BK01 thermophilic β-mannanase gene was designed and synthesized. Firstly, it was inserted into pPICZαA and resulted in recombinant expression vector pPICZαA-man. Then, pPICZαA-man was linearized and transformed into different hosts by electrotransformation. An optimal recombinant stain KM71-MAN was obtained by screening activity. Using recombinant strain KM71-MAN, recombinant mannanase was overexpressed and its activity in the culture medium reached 2 318.85 IU/mL in a 3 L fermentor. Recombinant enzyme had an apparent molecular size of about 40 kD by SDSPAGE, and optimal activity at pH 5.0 and 80℃. It was highly thermostable, retaining 43% of enzyme activity after 44 h of exposure at 70℃and pH 5.0. Moreover, it remained over 85% activity from pH 3.0 to pH 7.0 after treating at 50℃ for 70 h. Using this crude enzyme, the main hydrolysis products yielded from konjak gum were mannobiose and mannohexaose and the yield of mannooligosaccharides was 55.6%. The recombinant enzyme exhibited good thermal and pH stability, which indicated that the recombinant yeast has potential value in preparation of konjac gum mannooligosaccharides.

β-mannanase Codon preference Pichia pastoris Enzymatic properties Mannooligosaccharide

2013-11-20

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（201404615），教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃（NCET-11-0988），江蘇省杰出青年基金（BK2012038），江蘇省高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目（PAPD）

倪玉佳，女，碩士研究生，研究方向：生物化工；E-mail：523869088@qq.com

歐陽嘉，女，教授，研究方向：植物纖維資源利用，基因工程和酶工程；E-mail：hgouyj@njfu.edu.cn