MTHFR基因多態(tài)性、Hcy、B12、葉酸與胚胎停止發(fā)育的相關(guān)性

蔡麗梅，朱珍珍，虞如芬

MTHFR基因多態(tài)性、Hcy、B12、葉酸與胚胎停止發(fā)育的相關(guān)性

蔡麗梅，朱珍珍，虞如芬

目的探討MTHFR基因多態(tài)性、血清同型半胱氨酸（Hcy）、維生素B12及葉酸與胚胎停止發(fā)育的相關(guān)性。方法選擇胚胎停止發(fā)育孕婦（胚胎停止組）76例，正常孕婦(正常胚胎組)50例，同齡育齡期婦女（正常育齡組）50例，抽空腹靜脈血10m l，苯酚/氯仿法提基因組DNA，PCR擴(kuò)增、聚合酶反應(yīng)檢測(cè)其基因類型，采用雙試劑循環(huán)酶法測(cè)定血漿總Hcy水平，微粒子酶免分析法測(cè)定血漿葉酸、維生素B12水平；觀察比較3組和各基因類型頻率、Hcy、、B12、葉酸值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果胚胎停止組TT基因型和T等位基因所占比率均明顯高于正常胚胎組（均＜0.05），CT、CC基因型、C等位基因明顯小于正常胚胎組（均＜0.05）；兩組內(nèi)各基因型Hcy值比較均為TT＞TC＞CC（均＜0.05），B12、葉酸值比較均為TT＜TC＜CC（均＜0.05）；兩組間TT、TC的Hcy值比較均為胚胎停止組〉正常胚胎組（均＜0.05），B12、葉酸值比較均為胚胎停止組＜正常胚胎組（均＜0.05），兩組CC基因型間Hcy、B12、葉酸值比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)論MTHFR基因表現(xiàn)為多態(tài)性，胚胎停止發(fā)育可能與TT基因突變、血清Hcy升高、B12和葉酸值下降有關(guān)。

胚胎；停止發(fā)育；MTHFR基因；多態(tài)性；血清同型半胱氨酸

胚胎停止發(fā)育是指妊娠早期因某種原因所致胚胎停止發(fā)育，即妊娠早期(受精5周或妊娠7周)后見胚芽而無原始心管搏動(dòng)，孕囊枯萎或B超圖像僅見孕囊而未見胚芽[1]。胚胎停止發(fā)育有逐年上升的趨勢(shì)，它的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，除感染、子宮畸形、內(nèi)分泌異常及染色體異常等因素外，還有60%～70%的原因不明[2]。筆者收集了胚胎停止發(fā)育孕婦（胚胎停止組）76例，正常孕婦(正常孕婦組) 50例對(duì)MTHFR基因類型及各基因類型的血清同型半胱氨酸（Hcy）、維生素B12、葉酸值，分析MTHFR基因多態(tài)性、Hcy、B12、葉酸與胚胎停止發(fā)育的相關(guān)性，現(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象收集2012年6月至2013年6月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院就診的孕婦胚胎停止發(fā)育孕婦（胚胎停止組）76例，正常同期孕周孕婦（正常胚胎組）50例。胚胎停止組年齡24～34歲，平均（28.5±2.7）歲；產(chǎn)次1～2次，平均（1.3±0.2）次；孕周7～11周，平均（8.7±1.3）周。正常胚胎組年齡24～34歲，平均（28.3±2.6）歲；產(chǎn)次1～2次，平均（1.3±0.1）次；孕周7～11周，平均（8.6±1.2）周。兩組一般資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＞0.05）。所有入選患者均簽置入選知情同意書。

1.2 胚胎停止發(fā)育和正常妊娠診斷標(biāo)準(zhǔn)（1）胚胎停止發(fā)育：頭臀長(zhǎng)度≥7 mm且無心跳；孕囊平均直徑≥25mm且無胚胎；無卵黃囊的孕囊2周后不見有心跳的胚胎；有卵黃囊的孕囊11 d后無心跳。（2）正常早孕：月經(jīng)停止，人絨毛膜促性腺激素（HCG）升高，超聲下見妊娠囊內(nèi)胚芽和胎心搏動(dòng)。排除標(biāo)準(zhǔn)：隨訪過程中出現(xiàn)胚胎停止發(fā)育者出現(xiàn)流產(chǎn)；高血壓、內(nèi)分泌疾病、急性感染和其他重要臟器疾病。

1.3 方法

1.3.1 超聲檢查飛利浦HDI5000B超機(jī)，探頭頻率3.5MHz，取平臥位，行縱、橫、斜向掃查監(jiān)測(cè)胚胎，觀察胚胎心血管搏動(dòng)及孕囊的大小。

1.3.2 Hcy、葉酸、B12檢測(cè)抽取空腹靜脈血液3m l，高速離心取血清；用Abbott公司生產(chǎn)的IMX型自動(dòng)生化分析儀、配套Hcy試劑盒、雙試劑循環(huán)酶法檢測(cè)Hcy水平(正常值為5～15mmol/L)，用微粒子酶免分析法測(cè)定血漿葉酸、B12水平。

1.3.3 MTHFR基因型檢測(cè)（1）DNA提取：用含細(xì)胞保存液的真空管采血3m l，用轉(zhuǎn)速為10 000 r/min的高速離心機(jī)離心10 m in，棄上清液，用苯酚/氯仿法提基因DNA，試劑盒由Gibco公司提供。（2）MTHFR基因PCR擴(kuò)增：用美國(guó)ABI公司生產(chǎn)的PE9600型PCR DNA熱循環(huán)儀擴(kuò)增儀，劑盒有香港凱善公司提供；引物序列：5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’，5’-GGACGGTCCGGTGAGAGTG-3’；反應(yīng)體系：總體積25 L，其中ddH2O 18.5 l，10×緩沖液2.5 l，10mM的dNTPs 1 l，12.5 pmol/l的引物各1 l，DNA 1 l。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，溫度95℃30 s，62℃45 s，72℃50 s，10m in，共30個(gè)循環(huán)后72℃再延伸10 min，4℃保存，配制2%瓊脂糖凝膠(含0.5m l溴化乙錠)。擴(kuò)增結(jié)果觀察：取擴(kuò)增產(chǎn)物5 l，加10 l dd H2O及2 l溴酚蘭，混合后電泳(電壓

110 V，30m in)，在紫外燈下觀察擴(kuò)增片段大小198 bp，證實(shí)擴(kuò)增成功。(3)酶切反應(yīng)：擴(kuò)增產(chǎn)物中加入限制性內(nèi)切酶HinfⅠ酶切反應(yīng)體系20 l，該體系包括擴(kuò)增產(chǎn)物5 l、10倍緩沖液2 l、Hinfl10 l、ddH2O12 l。37℃消化24h，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳30m in。（4）MTHFR基因分型判讀：取酶解產(chǎn)物12%聚丙烯酰胺凝膠電泳3 h，以溴化乙錠染色，紫外燈下觀察、攝片。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-檢驗(yàn)；；兩組比較采用檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTHFR基因PCT-RFLP電泳結(jié)果CC野生型只有198 bp片段，CT雜合性有198 bp、175 bp、23 bp3條片段，TT純合突變型有175 bp、23 bp2條片段，2%瓊脂糖凝膠電泳后23 bp片段游出，見圖1。

2.2 胚胎停止組和正常胚胎組MTHFR基因型頻率比較胚胎停止組TT基因型、T等位基因所占比率明顯多于正常胚胎組（均P＜0.01），CT、CC基因型和C等位基因明顯小于正常胚胎組（均＜0.01）。見表1。

2.3 兩組不同MTHFR基因型孕婦血清Hcy、B12、葉酸值比較兩組內(nèi)3種基因型的Hcy值比較，TT＞TC＞CC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均＜0.05)；B12、葉酸值TT＜TC＜CC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。兩組間同基因型，TT、TC基因型Hcy值胚胎停止組＞正常胚胎組（9.20、6.68，均＜0.05），B12、葉酸值比較胚胎停止組＜正常胚胎組（=2.82，＜0.05）；兩組間CC基因型Hcy、B12、葉酸值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(≤0.28，均＞0.05)。見表2。

3 討論

3.1 胚胎停止孕婦和正常孕婦MTHFR基因多態(tài)性分析MTHFR是一種黃素蛋白，MTHFR基因定位在1號(hào)染色體，基因全長(zhǎng)2 220 bp，包含有11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子[3]。MTHFR基因多態(tài)性位點(diǎn)存在兩種等位基因，即野生型C與突變型T，組合為3種基因型：TT、CT和CC。唐儀等[4]認(rèn)為MTHFR基因多態(tài)性發(fā)現(xiàn)CT/TT基因型人群患原發(fā)性高血壓病(EH)的危險(xiǎn)性比CC基因型人群高。鄭苗苗等[5]對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病患兒MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)C677T位點(diǎn)：CC野生型27例(52%)，CT雜合型l6例(31%)，TT純合型9例(17%)。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)關(guān)于MTHFR基因個(gè)型分布頻率研究結(jié)果存在差異的可能原因包括：種族之間等位基因頻率的差異、基礎(chǔ)疾病、葉酸營(yíng)養(yǎng)狀況、飲食或同時(shí)服用的藥物等環(huán)境因素[6]。本組資料顯示胚胎停止組TT基因型和T等位基因所占的比率明顯高于正常胚胎組（＜0.05）；CT、CC基因型、C等位基因所占比率明顯小于正常胚胎組（＜0.05）因此，筆者認(rèn)為MTHFR基因多表現(xiàn)為態(tài)性，TT基因突變與胚胎停止發(fā)育可能存在相關(guān)性。

3.2 MTHFR基因多態(tài)性、Hcy、B12、葉酸值與胚胎停止發(fā)育的關(guān)系MTHFR基因有兩個(gè)不同的等位基因(C和T)，T是與酶的活性下降和同型半胱氨酸血癥的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[7]。兩組組內(nèi)各基因型Hcy值比較均為TT＞TC＞CC（＜0.05），兩組間TT、TC基因型同基因型的Hcy值比較均為胚胎停止組〉正常胚胎組（＜0.05）。兩組CC基因型Hcy值比較無顯著差異（＞0.05）。由此可見不同MTHFR基因型孕婦其血清同型半胱氨酸值不同，TT基因胚胎停止發(fā)育孕婦的其血清同型半胱胺酸值較高，CC基因型者血清同型半胱氨酸值相對(duì)較穩(wěn)定。因此，胚胎停止發(fā)育TT基因突變者血清Hcy值相對(duì)較高。Hcy多個(gè)方面影響血液的凝固性，如改變內(nèi)皮細(xì)胞抗血栓能力、增加纖維蛋白的形成及抑制纖溶酶的活性等從而提高血液的凝固性，降低纖溶性，促進(jìn)血栓形成[8]。Hcy的生理代謝處于再甲基化作用和轉(zhuǎn)硫化作用這兩個(gè)代謝途徑的交叉點(diǎn)，當(dāng)血液中Hcy濃度升高，可以造成人體血管堵塞、血管內(nèi)皮損傷，甚至血壓增高[9]。另外統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)兩組內(nèi)各基因型B12、葉酸值比較均為TT＜TC＜CC（＜0.05）；兩組間TT、TC的B12、葉酸值比較均為胚胎停止組〈正常胚胎組（＜0.05）；兩組CC基因型間B12、葉酸值比較均無顯著差異（＞0.05）。由此可見胚胎停止發(fā)育者TT基因者血清B12、葉酸值相對(duì)較低，CC基因型者血清B12、葉酸值較TT、TC型穩(wěn)定。血漿中Hcy濃度與遺傳因素及飲食因素有關(guān)，如果葉酸、維生素B12攝入不足，甲基化轉(zhuǎn)移障礙，Hcy再不能生成蛋氨酸，可導(dǎo)致血漿Hcy蓄積[10]。MTHFR活性降低使半胱氨酸合

成甲硫半胱氨酸減少，最終血Hcy濃度增加[11]?？傊?，THFR基因的多態(tài)性、血清Hcy、B12和葉酸值相互影響，MTHFR基因TT突變、血清Hcy值升高、B12和葉酸值的降低都會(huì)影響胚胎的正常發(fā)育，相互之間可能存在明顯的相關(guān)性。

表1 胚胎停止組和正常胚胎組MTHFR基因型頻率比較例（%）

表2 兩組不同MTHFR基因型孕婦血清Hcy、B12、葉酸值比較

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10.3969/j.issn.1671-0800.2014.05.054

R714.7

A

1671-0800(2014)05-0602-03

溫州市科技局科技項(xiàng)目（Y20120288）

325200浙江省溫州，溫州醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院（蔡麗梅、虞如芬）；瑞安市中醫(yī)院（朱珍珍）

蔡麗梅，Email：23747069 09@qq.com。