先天性腎盂輸尿管連接部狹窄中C-kit蛋白及其配體干細(xì)胞因子的表達(dá)

夏慧，夏麗娜

先天性腎盂輸尿管連接部狹窄中C-kit蛋白及其配體干細(xì)胞因子的表達(dá)

夏慧，夏麗娜

目的檢測(cè)先天性腎盂輸尿管連接部狹窄（UPJO）患兒病變組織中C-kit蛋白及其配體干細(xì)胞因子（SCF）的表達(dá)水平和分布情況。方法收集80例UPJO患兒手術(shù)切除標(biāo)本的存檔蠟塊，以8例相應(yīng)年齡段腎母細(xì)胞瘤患兒無腫瘤累及的腎盂輸尿管連接處組織作為對(duì)照，全部病例采用免疫組織化學(xué)EliVision法進(jìn)行C-kit和SCF的檢測(cè)。結(jié)果病變組織中C-kit和SCF表達(dá)水平顯著降低，SCF在觀察組中的表達(dá)呈陰性，在對(duì)照組中的表達(dá)呈陽(yáng)性，兩組C-kit陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及平均吸光密度值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＜0.05）。結(jié)論先天性腎盂輸尿管連接部狹窄繼發(fā)腎積水的發(fā)生可能與C-kit蛋白及其配體SCF的表達(dá)異常有關(guān)。

先天性腎盂輸尿管連接部狹窄；C-kit蛋白；干細(xì)胞因子

先天性腎盂輸尿管連接部狹窄（UPJO）是小兒上尿路梗阻最常見的原因，也是先天性腎積水的主要病因[1]，發(fā)病率0.13%～0.16%[2]，若不及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理可能導(dǎo)致嚴(yán)重的腎積水甚至腎功能不全，嚴(yán)重影響患兒的身體健康。近年來研究發(fā)現(xiàn)，泌尿系中存在一種間質(zhì)細(xì)胞，類似于胃腸道的Cajal間質(zhì)細(xì)胞（ICC），具有電起搏的功能，被稱為泌尿系ICC[3-4]。ICC能產(chǎn)生起搏信號(hào)并將其傳遞給相鄰的平滑肌細(xì)胞，從而使輸尿管發(fā)生蠕動(dòng)并將尿液向下輸送，因此在泌尿系的正常功能中具有重要作用。ICC表達(dá)一種原癌基因的產(chǎn)物C-kit蛋白，其配體為干細(xì)胞因子（SCF），SCF/C-kit信號(hào)傳遞系統(tǒng)對(duì)ICC的發(fā)育起至關(guān)重要的作用[5]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)ICC的改變與多種先天性胃腸道疾病有關(guān)[6-7]，因此筆者推測(cè)，ICC可能在UPJO發(fā)生過程中出現(xiàn)病變并參與腎積水的發(fā)生、發(fā)展過程。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化染色研究UPJO患兒病變輸尿管中C-kit和SCF的表達(dá)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2009年1月至2013年12月浙江省湖州市第一人民醫(yī)院和溫州醫(yī)科大學(xué)育英兒童醫(yī)院手術(shù)治療的80例先天性腎盂輸尿管連接部狹窄患兒為觀察組，年齡1個(gè)月至15歲，＜1歲48例，1～7歲21例，7～15歲11例；男女比例63∶17；左58例，右21例，雙側(cè)1例。均由于重度腎積水而行離斷性腎盂成形術(shù)，以8例相應(yīng)年齡段腎母細(xì)胞

瘤患兒無腫瘤累及的腎盂輸尿管連接處組織患兒為對(duì)照組，切除的組織經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟切片。該研究已通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并得到家長(zhǎng)知情同意。

1.2 試劑和方法采用HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)，免疫組織化學(xué)EliVision法檢測(cè)C-kit蛋白和SCF，DAB染色，陰性對(duì)照用PBS代替一抗。C-kit抗體及DAB顯色試劑盒購(gòu)于福州邁新公司，SCF抗體購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)公司。

1.3 結(jié)果判定用光鏡觀察，呈現(xiàn)清晰的棕黃色反應(yīng)為陽(yáng)性表達(dá)，C-kit陽(yáng)性定位于細(xì)胞膜或胞漿，胞質(zhì)有突起的梭形細(xì)胞即ICC，每張切片隨機(jī)取10個(gè)高倍視野（10×400高倍視野，每個(gè)視野0.152mm2），計(jì)算每個(gè)高倍視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。SCF陽(yáng)性表達(dá)定位于胞漿，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件(美國(guó)MediaCybernetics公司)測(cè)定陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物的平均吸光密度值（A），A值代表染色強(qiáng)度，反映SCF的相對(duì)含量。1.4統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對(duì)照組肌層中可見較多呈棕黃色反應(yīng)的細(xì)胞，這些細(xì)胞呈多角形，有突起，胞膜或胞漿內(nèi)可見棕黃色顆粒樣物質(zhì)（封三彩圖1），平均每個(gè)高倍視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為（11.00±3.63）個(gè)；而觀察組肌層僅見少數(shù)有同樣染色反應(yīng)的陽(yáng)性細(xì)胞（封三彩圖2），平均每個(gè)高倍視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為（2.66±1.66）個(gè)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=6.47，＜0.05）。SCF在對(duì)照組中的表達(dá)呈陽(yáng)性（封三彩圖3），A值為（286.34±43.20）；而在病例組中的表達(dá)呈陰性（封三彩圖4），A值為（44.25±10.53），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=15.82，＜0.05）。

3 討論

UPJO患兒可能與胚胎發(fā)育中腎盂輸尿管連接異常有關(guān)，大部分為足月產(chǎn)，出生體質(zhì)量正常，僅6例為早產(chǎn)兒或低出生體質(zhì)量?jī)??；純褐饕捎隗w檢發(fā)現(xiàn)腎積水或腹部腫塊而就診，其中26例于胎兒期即發(fā)現(xiàn)腎積水，B超檢查對(duì)于發(fā)現(xiàn)胎兒及患兒腎積水具有非常重要的價(jià)值。

UPJO最主要的危害就是引起尿液積聚導(dǎo)致腎盂積水，嚴(yán)重者影響腎功能，目前以外科手術(shù)治療為主。然而，由于患兒腎臟處于發(fā)育過程中，單純的手術(shù)解除梗阻未必能排除疾病對(duì)患兒腎功能的遠(yuǎn)期影響[8]。有關(guān)UPJO引起腎積水的研究觀點(diǎn)主要有兩類：一是機(jī)械性梗阻，管腔狹窄引起尿液通過受阻，狹窄部位平滑肌明顯增厚，排列紊亂，纖維組織增生，結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致平滑肌收縮功能異常，管腔蠕動(dòng)減弱，加重尿液積聚。另一個(gè)是動(dòng)力性梗阻，即狹窄并不顯著，但卻出現(xiàn)明顯的腎積水，有學(xué)者認(rèn)為神經(jīng)分布異常[9]及肌肉發(fā)育不全[10]是造成動(dòng)力性梗阻的原因，這些異?？煞恋K輸尿管道正常蠕動(dòng)波的傳遞，使尿液輸送困難，從而發(fā)生腎積水。然而，這些研究并不能完全解釋病因。

目前，國(guó)內(nèi)外已有較多研究證實(shí)ICC在泌尿系中的重要作用，它可產(chǎn)生起搏信號(hào)，傳遞給鄰近的平滑肌細(xì)胞，使平滑肌收縮，從而使輸尿管發(fā)生自發(fā)性蠕動(dòng)，將尿液從上往下輸送[4-5,11]。丁礪蠡等[12]使用透射電鏡在膀胱的Cajal樣細(xì)胞和逼尿肌細(xì)胞之間發(fā)現(xiàn)了電突觸的縫隙連接結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步證實(shí)泌尿系ICC能產(chǎn)生慢波并將其傳遞給平滑肌細(xì)胞。ICC特異性表達(dá)C-kit基因，其配體為干細(xì)胞因子SCF，ICC的發(fā)育和分化以及表型維持均依賴于SCF/C-kit信號(hào)傳遞系統(tǒng)，持續(xù)接受信號(hào)刺激的前體細(xì)胞發(fā)育成ICC并在信號(hào)的維持下保持穩(wěn)定，Tong等[5]認(rèn)為缺乏SCF/C-kit信號(hào)刺激的前體細(xì)胞上調(diào)表達(dá)更多的肌原蛋白，從而發(fā)育成平滑肌細(xì)胞。另有體外培養(yǎng)ICC的研究證明，SCF的局部提呈在ICC的培養(yǎng)中具有重要作用，ICC的體外培養(yǎng)環(huán)境中必需加入SCF才有助于ICC的生長(zhǎng)、發(fā)育及表型維持[13]。Nakahara等[14]亦有研究證實(shí)，SCF能促進(jìn)ICC的發(fā)育，并且具有劑量依賴性，一旦去除SCF，則ICC明顯減少?？梢姡珻-kit以及SCF的正常表達(dá)對(duì)ICC的正常發(fā)育及維持缺一不可。

本研究中，觀察組C-kit蛋白及SCF表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，C-kit蛋白及SCF表達(dá)水平降低使SCF/C-kit信號(hào)減弱或缺失，導(dǎo)致ICC發(fā)育異常，ICC數(shù)目減少，電起搏功能及信號(hào)傳遞功能發(fā)生障礙，引起相鄰的平滑肌細(xì)胞收縮障礙以及平滑肌結(jié)構(gòu)紊亂，纖維組織增生，從而使病變部位輸尿管蠕動(dòng)異常，進(jìn)而導(dǎo)致病變以上管腔尿液積聚，引起腎積水

的發(fā)生。由此推測(cè)，先天性腎盂輸尿管連接部狹窄繼發(fā)腎積水的發(fā)生可能與C-kit蛋白及其配體SCF的表達(dá)異常有關(guān)。

[1]黃澄如.實(shí)用小兒泌尿外科學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006: 48.

[2]Nguyen HT,Kogan BA.Upper urinary tructobstruction:experimentaland clinicalaspects[J].Br JUrol,1998,Supp l2:13-21.

[3]LammersW J,Ahmad HR,A rafat K.Spatial and temporalvariations in pacemaking and conduction in the iso-lated renal pelvis[J]. Am JPhysiol,1996,270(4 Pt2):F567-574.

[4]Lang RJ,Zoltkow ski BZ,Hammer JM,et al.Electrical characterizationof interstitiaIcellsof Cajal-likecellsand smoothmuscle cells isolated from themouse ureteropelvic junction[J].JUroI,2007, 177(4):1573-1580.

[5]TongW,JiaH,Zhang L,etal.Exogenousstem cellfactorimproves interstitialcellsof Cajal restoration afterblockadeof c-kitsignaling pathway[J].Scand JGastroenterol,2010,45(7-8):844-851.

[6]Rolle U,Piaseczna-Piotrow ska A,Puri P.Interstitial cells of Cajal in thenormalgutand in interstitialmotility disordersof childhood[J]. PediatrSurg Int,2007,23(12):1139-1152．

[7]夏麗娜,王志強(qiáng),王宗敏,等.C-kit和Cx43在新生兒自發(fā)性胃穿孔中的表達(dá)[J].中國(guó)當(dāng)代兒科雜志,2011,13(10):787-789.

[8]Julie K lein,Julien Gonzalez,Mathieu M iravete,et al.Congenital ureteropelvic junctionobstruction:human diseaseand animalmodels[J].Int JExp Pathol,2011,92(3):168-192.

[9]KajbafZadeh AM,payabvash S,Salmasi AH,etal.Smoothmuscle cellapoptosisand defective neuraldevelopment in congenitalureteropelvic junction obstruction[J].JUrol,2006,176(2):718-723.

[10]WilliamsB,Tareen B,Resnick MI.Pathophysiology and treatment ofureteropelvic junctionobstruction[J].CurrUrolRep,2007,8(2): 111-117.

[11]Teele ME,Lang RJ.Stretch-evoked inhibition of spontaneousmigrating contractionsinawholemountpreparation of theguinea-pig upper urinary tract[J].Br JPharmacol,1998,123(6):1143-1153.

[12]丁礪蠡,方強(qiáng),封建立,等.膀胱Cajal間質(zhì)細(xì)胞對(duì)膀胱逼尿肌細(xì)胞興奮調(diào)控的結(jié)構(gòu)和功能特征的初步研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,30(12):1118-1121.

[13]Rich A,Miller SM,Gibbons SJ,etal.Localpresentation of steel factor increasesexpression of c-kitimmunoreactive interstitialcellsofCajal in culture[J].Am JGastrointest LiverPhysiol,2003,284 (2):313-320.

[14]Nakahara M,Isozaki K,Vander w inden JM,etal.Dose-dependent and time-lim ited proliferation of culturedmurine interstitialcells of Cajal in response to stem cell factor[J].Life Sci,2002,70(20): 2367-2376.

ExpressionofC-kitanditsligandstemcellfactorincongenitalureteropelvicjunctionobstruction

Objective To study the expression and distribution of C-kitand its ligand stem cell factor（SCF）in tissue of childrenwithcongenitalureteropelvic junctionobstruction（UPJO）.Methods Thepathologicalspecimensof80 cases of UPJO and eightcasesofnephroblastomaw ithoutureteropelvic involved(thecontrolgroup)were collected.Immunohistochem ical staining(EliVision)was employed to examine the expression of c-kitand SCF in selected tissues. Results Expressionsof C-kitand SCFdecreased significantly in the UPJO group.SCFw asnegative in UPJO group and strongly positive in thecontrolgroup.Therewere significantdifferences ofpositivecellnumbersandmean OD staining density between the tw o groups(＜0.05).Conclusions Hydronephrosisin Congenitalureteropelvic junction obstruction isassociatedwith thedecreased expressionofC-kitand SCF.

Ureteropelvic junction obstruction;C-kitprotein;Stem cell factor

10.3969/j.issn.1671-0800.2014.05.005

R692

A

1671-0800(2014)05-0520-03

313000浙江省湖州，湖州市第一人民醫(yī)院（夏慧）；溫州醫(yī)科大學(xué)育英兒童醫(yī)院（夏麗娜）

夏慧，Email：xhxxjyy@126.com