多指標(biāo)綜合評價優(yōu)選丹參提取工藝

趙 輝 王麗萍 陳 琳 張華潭 李春花 黃秀英

1.河北省保定市第一醫(yī)院，河北保定071000；2.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北石家莊050091；3.河北醫(yī)科大學(xué)中藥藥劑教研室，河北石家莊050091；4.河北省保定市第四醫(yī)院，河北保定071000）

多指標(biāo)綜合評價優(yōu)選丹參提取工藝

趙 輝1王麗萍1陳 琳2張華潭2李春花3黃秀英4

1.河北省保定市第一醫(yī)院，河北保定071000；2.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北石家莊050091；3.河北醫(yī)科大學(xué)中藥藥劑教研室，河北石家莊050091；4.河北省保定市第四醫(yī)院，河北保定071000）

目的優(yōu)選丹參脂溶性及水溶性成分最佳提取工藝。方法采用正交設(shè)計，以丹參酮ⅡA、丹酚酸B為測定指標(biāo)，用高效液相色譜法測定其含量，并以二者含量為綜合指標(biāo)，加權(quán)評分，優(yōu)選最佳提取工藝。結(jié)果最佳提取工藝為：6倍量70%乙醇，提取3次，每次2.5 h。結(jié)論優(yōu)選的提取工藝合理、可行。

丹參；提取工藝；正交試驗；丹參酮ⅡA；丹酚酸B

人參強(qiáng)心滴丸由人參、丹參、生地黃、蟾酥四味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰，活血強(qiáng)心的功效。丹參是其主要組成藥味，含有二萜醌類脂溶性及酚酸類水溶性成分。脂溶性成分具有活血化瘀、抗菌、抗急性缺氧、抗心律失常、改善血管平滑肌、抗心肌肥厚、抗血小板聚集等作用；水溶性成分具有抗血小板聚集、抗凝血和抗血栓形成、抑制細(xì)胞內(nèi)源性膽固醇合成、防止脂質(zhì)沉積及動脈粥樣硬化斑塊等作用[1-2]。目前，對丹參提取研究往往側(cè)重于一類成分，同時考慮到兩類成分的研究較少，本研究為提高人參強(qiáng)心滴丸的臨床療效，兼顧丹參脂溶性及水溶性兩類有效成分，以丹參酮ⅡA和丹酚酸B含量為考察指標(biāo)，對丹參的提取工藝進(jìn)行全面優(yōu)選。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司），VWD紫外檢測器（美國安捷倫科技公司），Agilent Chemstation System色譜工作站（美國安捷倫科技公司），安捷倫柱溫箱（美國安捷倫科技公司，型號：G1316A），METTLER十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試劑與藥材

丹參酮ⅡA（批號：110766-200518）和丹酚酸B（批號：110562-200504）對照品均購于中國藥品生物制品檢定所，丹參藥材購于石家莊樂仁堂藥店，經(jīng)侯芳潔老師鑒定符合《中國藥典》2010年版一部相關(guān)項下規(guī)定，乙腈（色譜純，美國Grace公司，批號：10102501），甲醇（色譜純，德國Fisher Scientific公司，批號：061495-053786），娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 丹參酮ⅡA色譜條件

Agilent ZORBAXDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm），流動相：甲醇-水（80∶20），流速：1.0 mL/min，檢測波長：270 nm[3]，柱溫：室溫，進(jìn)樣量：20μL。

2.1.2 丹酚酸B色譜條件

Agilent ZORBAXDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm），流動相：乙腈-甲醇-甲酸-水（10∶30∶1∶59），流速：1.0 mL/min，檢測波長：286 nm，柱溫：室溫，進(jìn)樣量：20μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備[4]

2.2.1.1 丹參酮ⅡA取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的丹參酮ⅡA對照品約20 mg，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，甲醇定容，得丹參酮ⅡA對照品儲備液。

2.2.1.2 丹酚酸B取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的丹酚酸B對照品約18 mg，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，75%甲醇定容，得丹酚酸B對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液的制備

稱取丹參藥材10 g，以8倍量70%乙醇提取兩次，時間分別為1.5、1 h，濾過，合并提取液，濃縮至近干，加甲醇定容至250 mL，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性實驗

精密吸取對照品溶液、供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果表明，對照品溶液和供試品溶液色譜圖相應(yīng)位置上有相同保留時間的色譜峰，且紫外吸收光譜圖一致，吸收峰與其他色譜峰能達(dá)到基線分離，且峰形穩(wěn)定。理論塔板數(shù)按丹參酮ⅡA峰、丹酚酸B峰計算均不低于5000。見圖1。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

2.3.2.1 丹參酮ⅡA精密移取對照品溶液1、2、3、4、6、8 mL分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定標(biāo)準(zhǔn)溶液及丹參酮ⅡA對照品儲備液峰面積。以丹參酮ⅡA濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，得回歸方程：Y=49 592 086.0080X-44 976.6300（r=0.9999，n=7），結(jié)果表明：在0.021～0.210 mg/mL范圍內(nèi)，丹參酮ⅡA的峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2.2 丹酚酸B精密移取對照品溶液1、2、3、4、6、8 mL分別置于10 mL容量瓶中，用75%甲醇定容，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定標(biāo)準(zhǔn)溶液及丹酚酸B對照品儲備液峰面積。以丹酚酸B濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，得回歸方程：Y=10 425 847.2879X-1375.0068（r=0.9993，n=7），結(jié)果表明：在0.0192～0.192 mg/mL范圍內(nèi)，丹酚酸B的峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度實驗

分別取丹參酮ⅡA、丹酚酸B對照品溶液，按相應(yīng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄丹參酮ⅡA、丹酚酸B的峰面積，丹參酮ⅡA峰面積的RSD為0.86%（n= 6），丹酚酸B峰面積的RSD為0.94%（n=6），結(jié)果表明儀器精密度良好。

圖1 丹參酮ⅡA對照品、丹參樣品、丹酚酸B HPLC色譜圖

2.3.4 穩(wěn)定性實驗

分別取丹參酮ⅡA、丹酚酸B對照品溶液和樣品溶液，按相應(yīng)色譜條件，在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄丹參酮ⅡA、丹酚酸B的峰面積，結(jié)果丹參酮ⅡA、丹酚酸B峰面積的RSD分別為1.24%（n=6）、1.11%（n=6）和1.03%（n=6）、0.98%（n=6），表明丹參酮ⅡA、丹酚酸B溶液和樣品溶液在24 h內(nèi)均穩(wěn)定。

2.3.5 重現(xiàn)性實驗

稱取丹參藥材6份，每份10 g，按“2.2.2”項下制備6份供試品溶液，進(jìn)行含量測定，結(jié)果丹參酮ⅡA與丹酚酸B含量的RSD分別為1.61%（n=6）、1.34%（n=6），表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.3.6 加樣回收率

精密移取已知含量的供試品溶液9份，3份為一組，分別添加丹參酮ⅡA與丹酚酸B對照品儲備液1.85、2.30、2.75、3.40、4.25、5.10 mL，測定，結(jié)果丹參酮ⅡA與丹酚酸B平均回收率分別為100.06%、99.69%，RSD分別為0.3226%（n=9）、0.4935%（n=9）。表明該方法測定丹參中丹參酮ⅡA和丹酚酸B的含量準(zhǔn)確、可靠。見表1、2。

表1 丹參酮ⅡA加樣回收率

表2 丹酚酸B加樣回收率

2.4 正交試驗設(shè)計[5-6]

確定乙醇濃度、乙醇用量、提取時間、提取次數(shù)為4個考察因素，采用L9（34）正交表安排實驗，以丹參酮ⅡA、丹酚酸B含量為指標(biāo)，運(yùn)用加權(quán)評分法對丹參的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。因素水平表見表3，正交實驗見表4。

表3 因素水平表

表4 正交實驗結(jié)果

2.5 結(jié)果分析

由正交表可知，各因素影響大小順序為D＞A＞C＞B，即提取次數(shù)＞乙醇濃度＞提取時間＞乙醇用量。最佳提取工藝為A3B2C2D3，即6倍量70%乙醇提取3次，每次2.5 h。

2.6 最佳工藝驗證

根據(jù)正交實驗結(jié)果，按丹參最佳提取工藝，提取三批藥材，測定，結(jié)果丹參酮ⅡA含量分別為2.52、2.54、2.58 mg/g；丹酚酸B含量分別為4.29、4.27、4.34 mg/g；兩種成分含量綜合評分，在九組試驗中皆為最高，說明本次正交實驗所篩選的工藝是合理的。

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

本研究采用平行試驗法對提取溶劑進(jìn)行篩選，以水、10%、30%、50%、60%、70%、85%、95%乙醇為提取溶劑。結(jié)果表明乙醇濃度越高，測得丹參酮ⅡA的含量較高；乙醇濃度越低，測得丹酚酸B含量較高。兼顧二者，根據(jù)平行試驗結(jié)果確定60%、70%、80%三個水平進(jìn)行正交實驗。

3.2 溶液的儲存

丹參酮ⅡA具有不穩(wěn)定性，易發(fā)生化學(xué)降解，降解速度與水、熱密切相關(guān)[6-10]且對光不穩(wěn)定。故其對照品溶液及供試品溶液均應(yīng)避光放置，且操作宜迅速、避光，以免分解。

3.3綜合評分的確定[11-12]

丹參中主要含有兩類有效成分，一類是以丹參酮ⅡA為代表的脂溶性成分，另一類是以丹酚酸B為代表的水溶性成分，兩類成分所產(chǎn)生的功效對于人參強(qiáng)心滴丸都有重要意義，為此，筆者采取正交試驗綜合評分優(yōu)選最佳工藝。由于藥材中丹酚酸B的含量約為丹參酮ⅡA的2倍，故在加權(quán)評分時，將所測丹酚酸B含量除以2，以使兩者在評價系統(tǒng)中所占權(quán)重盡量一樣，保證了評分的合理性。

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Multi-index evaluation of integration technique for extracting of Salvia Miltiorrniza

ZHAO Hui1WANG Liping1CHEN Lin2ZHANG Huatan2LI Chunhua3HUANG Xiuying4
1.The First Hospital of Baoding City,Hebei Province,Baoding 071000,China;2.College of Past-graduate,Hebei Medical University,Hebei Province,Shijiazhuang 050091,China;3.Teaching and Research section of Chinese Medicine Pharmaceutical,Hebei Medical University,Hebei Province,Shijiazhuang 050091,China;4.The Fourth Hospital of Baoding City,Hebei Province,Baoding 071000,China

ObjectiveTo optimize an integration technique for extracting the liposoluble and water-soluble components of Salvia.MethodsSalvianolic acid B and TanshinoneⅡA were selected as marker components and determined by HPLC to optimize the integration extract process of Salvia by orthogonal test.ResultsThe best extraction process was that,Salvia was added with 6 times alcohol of 70%and extracted 2.5 hours for 3 times.ConclusionThis extraction method can be employed to reduce time,working and be suitable for the morden production.

Salvia Miltiorrniza;Integration technique for extracting;Orthogonaltest;TanshinoneⅡA;Salvianolic acid B

R283

A

1673-7210（2014）03（b）-0101-04

2013-06-18本文編輯：衛(wèi)軻）

河北省衛(wèi)生廳中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合科研計劃項目（編號2008004）。

李春花，教授，碩士生導(dǎo)師；研究方向：中藥制劑新技術(shù)新方法。