環(huán)氧合酶-2和核因子-κB在膿毒癥大鼠肝損傷中的表達

李 斌 劉麗平 郭 鴻 李 汛

蘭州大學第一醫(yī)院重癥醫(yī)學科，甘肅蘭州730000

環(huán)氧合酶-2和核因子-κB在膿毒癥大鼠肝損傷中的表達

李 斌 劉麗平 郭 鴻 李 汛

蘭州大學第一醫(yī)院重癥醫(yī)學科，甘肅蘭州730000

目的探討環(huán)氧合酶2（COX-2）和核因子-κB（NF-κB）在膿毒癥大鼠的肝組織炎性反應中的表達及其相互關系。方法隨機選擇54只200～220 g成年Wistar大鼠分為3組，假手術A組（實驗開始前2 h腹腔內(nèi)注射生理鹽水，麻醉后行開腹手術，不做模型誘導，n=6）；膿毒癥模型B組[實驗開始前2 h腹腔內(nèi)注射生理鹽水，麻醉后盲腸結扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）建立腹腔感染模型，n=24]；NS398干預C組（CLP建立腹腔感染模型，實驗開始前2 h腹腔內(nèi)注射NS398 10 mg/kg，n=24）。以CLP法建立動物模型，逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測COX-2 mRNA在肝臟組織的表達，免疫組織化學法（Elisa）測定NF-κB在肝細胞中表達，并檢測肝臟功能，如谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和肝臟大體標本及病理變化。結果①COX-2 mRNA在A組呈低表達（1040.82±2.77），各時點C組較B組明顯降低。②肝細胞中NF-κB在A組表達較低[3 h：（0.60±0.54），6 h：（0.60±0.54），12 h：（0.60±0.54），24 h：（0.60±0.54）]，膿毒癥后其表達明顯增高[3 h：（2.60±0.55），6 h：（7.20± 1.09），12 h：（12.20±0.32），24 h：（6.40±0.73）]；在同一時點比較，B組低于C組[3 h：（1.60±1.89），6 h：（6.60±0.79），12 h：（9.20±2.68），24 h：（4.80±1.60）]（P<0.05）。③Pearson相關分析，COX-2 mRNA與NF-κB呈直線正相關（r= 0.685，P=0.042）。④膿毒癥后肝臟轉氨酶明顯增高[ALT：3 h：（174.00±18.73）U/L，6 h：（204.67±23.59）U/L，12 h：（311.00±44.53）U/L，24 h：（506.67±24.79）U/L；AST：3 h：（619.67±145.81）U/L，6 h：（594.00±34.59）U/L，12 h：（1027.66±136.21）U/L，24 h：（1518.33±139.38）U/L]，NS-398干預后降低[ALT：3 h：（105.33±18.01）U/L，6 h：（157.00±32.36）U/L，12 h：（101.00±16.52）U/L，24 h：（93.33±10.41）U/L；AST：3 h：（217.00±26.21）U/L，6 h：（461.33± 22.01）U/L，12 h：（322.00±72.33）U/L，24 h：（268.00±98.57）U/L]，C組與B組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示經(jīng)干預肝臟病理損傷減輕。結論COX-2在膿毒癥后引起的肝損傷中占有重要地位，NS-398通過特異性抑制COX-2來抑制肝細胞中NF-κB的表達，從而減輕肝細胞損傷。

膿毒癥；COX-2；NS398；肝損傷；NF-κB

膿毒癥（sepsis）是ICU最為常見的疾病，常常繼發(fā)于嚴重創(chuàng)傷、燒傷、休克、大手術后，而膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征（MODS）等是其進一步發(fā)展而來的，已成為當今外科ICU首要死亡原因[1-2]，而肝臟是最常受累的器官之一。核因子-κB（NF-κB）是炎癥和免疫應答中的關鍵因素，能夠在基因水平調(diào)控一些致炎癥細胞因子和誘生型酶，如環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）、一氧化氮合酶（iNOS）等的表達[1-3]。COX-2一般在正常組織較少表達，它主要表達在一些與炎癥有密切關系的細胞或組織上，在炎癥因子和（或）細胞因子等的刺激下大量表達，參與和加重炎性反應，且其表達水平與炎癥的嚴重程度相關[4-6]。國內(nèi)外對于NF-κB和COX-2在膿毒癥后肝損傷中的作用及相互關系報道不多，所以本研究試圖通過建立膿毒癥后肝組織炎性反應模型，研究二者在其中的表達和相互關系，探索保護肝細胞的新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗分組和給藥方法

體重200～220 g Wistar雄性大鼠54只（購于蘭州大學動物實驗中心），稱重后隨機分為3組：假手術A組（實驗開始前2 h腹腔內(nèi)注射生理鹽水，麻醉后行開腹手術，不做模型誘導，n=6）；膿毒癥模型B組（實驗開始前2 h腹腔內(nèi)注射生理鹽水，麻醉后CLP建立腹腔感染模型，n=24）；NS398干預C組（CLP建立腹腔感染模型，實驗開始前2 h腹腔內(nèi)注射NS398 10 mg/kg，n=24）。將B、C兩組根據(jù)取材時間不同又分為4組，每組6只。除干預措施不同外，其余喂養(yǎng)相同，分別于造模后3、6、12、24 h，假手術組在術后6 h抽取大鼠門靜脈血標本，用于檢測肝功能，包括谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）；取肝組織觀察病理學改變、免疫組織化學染色和RT-PCR。

1.2 動物模型的建立

盲腸結扎穿孔（cecalligation and puncture，CLP）腹腔感染模型建立參照Flammand等[7]的方法。實驗前動物禁食12 h，自由飲水，腹腔內(nèi)注射1%氯胺酮10 mL/kg，麻醉成功后，無菌操作，腹正中2 cm切口進腹，于盲腸出口處用4號線結扎，18G套管針將盲腸貫通穿孔一次，穿孔為兩個，擠出少量腸內(nèi)容物，還納腸管于腹腔，間斷縫合腹壁。術后各組動物均自由進食飲水。

1.3 主要藥物和試劑

NS398購于Sigma公司，NF-κB p65免疫組化試劑盒、SABC試劑盒購于武漢博士德公司，Trizol柱式RNA抽提試劑盒、AMV cDNA第一鏈合成試劑盒為上海生工公司產(chǎn)品，2×HotStart Taq PCR Mastermix試劑盒為北京天為時代公司產(chǎn)品。

1.4 檢測指標和方法

1.4.1 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）觀察COX-2 mRNA水平變化①取-80℃冰箱保存肝組織50μg，用Trizol柱式總RNA抽提試劑盒提取總RNA，并檢測純度和完整性。②RT-PCR（二步法，按照說明書操作）：引物序列（5′→3′）：COX-2上游引物CTG TAT CCC GCC CTG CTG GT；下游引物GAG GCA CTT GCG TTG ATG GT[8]；產(chǎn)物287 bp。β-actin（內(nèi)參照）上游引物GAT GGT GGG TAT GGG TCA GAA；下游引物CTA GGA GCC AGG GCA GTA ATC；產(chǎn)物839 bp（均由上海生工公司合成）。反應條件：94℃預變性3 min，然后按94℃30 s，50℃30 s，72℃1 min進行28個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物6μL，在1.8%瓊脂糖膠上電泳，EB染色，凝膠成像儀照相記錄。分析結果以COX-2與相應β-actin條帶灰度（IOD）之比值Q表示（Q=IODCOX-2/IODβ-actin），用Quantity One 4.0圖像分析軟件分析IOD。

1.4.2 肝細胞NF-κB表達的測定采用Elisa法（免疫組織化學法）肝組織標本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm切片，分別做HE和NF-κB免疫組化標記，采用SABC法，按試劑盒說明書進行。經(jīng)DAB顯色后，蘇木精復染，中性樹膠封固。用已知的陽性片作為陽性對照，每組均用PBS代替一抗作陰性對照。所有切片均在同一條件下的顯微鏡下觀察，結果以胞質(zhì)或胞核中發(fā)現(xiàn)棕黃色顆粒或褐色顆粒為陽性細胞，陰性對照則無棕黃色反應產(chǎn)物。取光學顯微鏡下每平方毫米視野（20×或40×）中的陽性細胞數(shù)，隨機選擇5個視野，其中每平方毫米內(nèi)的平均陽性細胞數(shù)作為計數(shù)標準。采用以下評分標準[9]。染色強度分為4級：0級：陰性，1級：弱陽性染色，2級：中度陽性，3級：強陽性染色。每張切片按所見陽性細胞范圍分為5級：0級：陰性，1級：1%≤陽性細胞≤25%，2級：25%＜陽性細胞≤50%，3級：50%＜陽性細胞≤75%，4級：75%＜陽性細胞≤100%，每張切片的染色積分以兩者之和表示。

1.4.3 肝功能檢測用日立7020全自動生化分析儀檢測肝功能指標ALT、AST。

1.4.4 超微結構觀察TEM-1230透射電鏡觀察肝臟超微結構改變。

1.5 統(tǒng)計學方法

所得實驗數(shù)據(jù)均由SPSS 13.0軟件分析，實驗數(shù)據(jù)滿足方差齊性時，采用均數(shù)±標準差（x±s）描述，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）方法，組間兩兩比較采用Bonfferoni法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR觀察COX-2在不同組、不同時間變化結果

由圖像軟件分析相應條帶后可知：肝組織中COX-2 mRNA在假手術組呈低表達（1040.82±2.77）；CLP造模后3 h表達明顯增強（2064.04±6.78），到6 h達到高峰（3992.45±16.75），12、24 h仍呈高表達[（2916.80±6.79），（2237.80±7.42）]。NS398干預后各時點COX-2 mRNA表達較膿毒癥組顯著降低，但是仍然高于假手術組。見圖1。

圖1 COX-2在不同組、不同時間變化結果

2.2 大體及病理檢查結果

2.2.1 假手術組肉眼觀察，肝臟無明顯改變。肝臟紅潤，無血性腹水及壞死灶。

2.2.2 膿毒癥組各時間點大鼠剖檢均可見不同程度的血性腹水，腸管擴張，并可見散布于盲腸、大網(wǎng)膜、腸系膜等處出血、壞死灶和皂化斑。肝臟大小無明顯改變，顏色呈暗紅色，表面可見散在的點狀淤血。電鏡下3 h組可見肝細胞核基本正常，Diss間隙增寬，溶酶體增多，線粒體擴張（圖2）。6 h組可見肝細胞核固縮、畸形，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，線粒體嵴斷裂、髓鞘樣改變，并有肥大細胞、巨噬細胞和漿細胞浸潤（圖3）。12 h組和24 h組可見細胞變形，血竇擴張，肝細胞核固縮、染色質(zhì)呈塊狀、核膜不清，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、脫顆粒，膽小管閉塞、絨毛消失（圖4、5）。

2.2.3 NS398干預組除3 h組外，其余各組可見少量血性腹水，腸管輕度擴張，盲腸處可見出血壞死，無灶化斑。肝臟色澤稍暗，未見出血點。電鏡下3 h組與膿毒癥3h組變化基本相同（圖6）。6 h組Diss間隙增寬，核染色質(zhì)邊集，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，線粒體擴張，未見細胞浸潤（圖7）。12 h和24 h組可見溶酶體增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體僅見個別擴張，個別核膜不完整、染色質(zhì)邊集（圖8、9）。

圖2 膿毒癥組3 h（12 000×）

圖3 膿毒癥組6 h（25 000×）

圖4 膿毒癥組12 h（20 000×）

圖5 膿毒癥組24 h（20 000×）

圖6 NS398干預3 h組（15 000×）

圖7 NS398干預6 h組（2 0000×）

圖8 NS398干預12 h組（12 000×）

圖9 NS398干預24 h組（12000×）

2.3實驗大鼠在同一時間段ALT、AST變化

結果顯示，CLP造模后膿毒癥組ALT、AST含量顯著增高，到24 h含量最高，各時段與假手術組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而NS398干預組ALT、AST含量也增高，在3、12、24 h，與假手術組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；相同時段比較，ALT、AST與膿毒癥組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這與COX-2 mRNA變化基本相同。見表1。

表1 各組ALT、AST變化比較（U/L，x±s）

2.4 在同一時間段大鼠NF-κB變化

肝細胞中NF-κB在假手術組呈低表達；CLP造模后3 h表達增強，到12 h達到高峰，24 h仍呈高表達。NS-398干預后相同時點NF-κB表達較膿毒癥組顯著降低，但是仍然高于假手術組（P<0.05）。這與COX-2 mRNA變化基本一致，Pearson相關分析，COX-2 mRNA與NF-κB呈正相關（r=0.685，P= 0.042）。見表2。

表2 各組NF-κB變化比較（U/L，x±s）

3 討論

膿毒癥時機體各個重要器官都有可能受到炎癥波及，而肝臟是炎性反應最為劇烈和最容易受到損傷的器官之一，內(nèi)毒素（LPS）通過直接或間接作用造成肝損傷，其中細胞因子、氧自由基等發(fā)揮重要作用[10]。肝損傷的就是各種致病因素作用于肝組織，肝細胞在一定程度上出現(xiàn)變性、壞死和功能性變化。作為重要炎癥介質(zhì)，前列腺素在肝損傷中的細胞因子網(wǎng)絡中發(fā)揮重要作用。COX是合成各種前列腺素（prostaglandins，PGs）的關鍵限速酶，在肝損傷時，激素、細胞因子、內(nèi)毒素和促癌劑等誘導COX-2的表達，氧化應激與脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物也可誘導COX-2表達參與肝損傷[11]。但是COX-2在肝損傷后高表達，究竟是對肝組織的保護性因素還是損傷性因素，其作用機制如何，目前尚不完全清楚，而且一直存在爭議。一些實驗研究認為，抑制COX-2表達，不僅可以降低血中炎癥細胞和其他有害因子水平，減輕膿毒癥癥狀，從而抵御內(nèi)毒素介導的感染和死亡，降低病情嚴重程度。其中的機制可能與COX-2抑制劑能阻礙NF-κB的激活有關。

NF-κB由p50和p65兩個亞基組成，只有p65在蛋白的C末端含有轉錄激活區(qū)域能直接作用于轉錄區(qū)域而激活轉錄過程，因此，可通過測定NF-κB亞單位p65反映NF-κB的活性[12]。近年來研究發(fā)現(xiàn)COX-2的基因中含有2個NF-κB位點序列：5-GGG ACT TTC C2-3′，分別位于-445/-427和-223/-214處，該位點序列發(fā)生定向突變后，幾乎完全封閉TNF-α對COX-2啟動子連接的報告基因活性的誘導作用[13]。而且有研究表明COX-2抑制劑發(fā)揮抗炎和抗增殖作用主要與抑制轉錄因子NF-κB或AP-1相關[14]。二者的相互關系如何，相互之間的作用機制如何，所以在前人研究的基礎上，筆者假設通過反饋調(diào)節(jié)機制，可以抑制COX-2 mRNA來減弱NF-κB的表達。

本研究采用經(jīng)典的CLP，制造與臨床感染相似的膿毒癥動物模型。結果表明膿毒癥之后肝組織炎性反應劇烈，肝臟功能迅速變化，轉氨酶快速升高，而且病理變化顯著，肝細胞出現(xiàn)變性壞死，這提示已造成一定程度的肝損傷。本研究中筆者觀察發(fā)現(xiàn)，在沒有明顯膿毒癥的假手術組NF-κB表達較低（0.60±0.54），而在膿毒癥B組，3 h后NF-κB表達顯著增高，12 h時達到高峰（12.20±0.32），24 h仍然高表達。與此同時，膿毒癥后早期肝組織COX-2 mRNA表達即增高，24 h時仍呈高表達，這個變化與NF-κB變化相一致。這說明NF-κB參與膿毒癥肝損傷過程，而NF-κB的活化促進了COX-2 mRNA的表達，而且COX-2 mRNA的表達增高可能是造成機體損傷的一種有害機制。當使用COX-2特異性抑制劑NS-398干預后，COX-2 mRNA表達明顯降低，肝功能及肝細胞病理損傷明顯好轉，同時段NF-κB較膿毒癥組降低（P<0.05）。Pearson相關分析，COX-2 mRNA與NF-κB呈正相關（r=0.685，P=0.042）。Strong等[15]的研究結果也表明：NS398通過抑制PGE2和COX-2 mRNA表達，從而明顯降低致炎癥細胞因子產(chǎn)物水平，提高宿主存活率。這些變化使我們有理由相信，選擇性COX-2抑制劑在抑制COX-2 mRNA表達的同時，通過負反饋調(diào)節(jié)機制，減弱NF-κB的表達，從而改善肝損傷，有效保護肝細胞。

通過實驗研究表明，COX-2在膿毒癥后引起的肝損傷中占有重要地位，NS-398通過負反饋調(diào)節(jié)機制，特異性抑制COX-2來抑制肝細胞中NF-κB的表達，從而減輕肝細胞損傷。

[1]Ikezoe T，Yang Y，Heber D，etal.PC-SPES：a potentinhibitor ofnuclearfactor-kappa B rescues mice from lipopolysaccharide-induced septic shock[J].Mol Pharmacol，2003，64（6）：1521-1529.

[2]姚詠明，盛志勇，林洪遠，等.膿毒癥定義及診斷的新認識[J].中國危重病急救醫(yī)學，2004，16（6）：321-324.

[3]韓梅，溫進坤，劉月平，等.大鼠血管新生內(nèi)膜形成過程中NF-κB的活化和ICAM-1及COX-2表達的變化[J].中國病理生理雜志，2008，24（2）：257-260.

[4]Kniss DA.Cyclooxygenase in reproductive medicine and biology[J].J Soc Gynecol Investig，1999，6（6）：285-292.

[5]陳善正，李宜雄，呂新生，等.環(huán)氧合酶-2在重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織中表達的實驗研究[J].中國普通外科雜志，2004，13（6）：419-423.

[6]步麗梅，徐敏，湯茂春，等.環(huán)氧合酶-2與急性胰腺炎研究進展[J].世界華人消化雜志，2010，18（18）：1919-1922.

[7]Flammand FJ，Sibbald WJ，Girotti MJ，et al.Pentoxifylline does not prevent microvascular injury in normotensive，septic rats[J].Crit Care Med，1995，23（1）：119.

[8]嚴文偉，周總光，陳友琴，等.急性水腫性胰腺炎大鼠胰腺微血流變化和環(huán)氧合酶-2的表達[J].中華肝膽外科雜志，2004，10（4）：252-255.

[9]Koga H，Sakisaka S，Ohishi M，et al.The expression of cyclooxygenase-2 in human hepatocellular carcinoma：relerance to tumor differentiation[J].Hepatology，1999，29（8）：688-696.

[10]張馨.內(nèi)毒素損傷肝臟機制的研究進展[J].國外醫(yī)學：消化系疾病分冊，2002，5（3）：163-166.

[11]Kumagai T，Kawamoto Y，Nakamura Y，et al.4-hydroxy-2-nonenal，the end product of lipid peroxidation，is a specific inducer of cyclooxygenase-2 gene expression[J]. Biochem Biophys Res Commun，2000，273（2）：437-441.

[12]Grimn S，Bacuerle PA.The Inducible Transcri ption Factor-kappa B，Structure 2 function Relationship of Its Protein Subunits[J].J Biochem，1993，290（2）：297-308.

[13]Reddy ST，Wadleigh DJ，Herschman HR，etal.Transcriptional Regulation ofthe Cyclooxygenase-2 Gene in Activated Mast Cells[J].J Biol Chem，2000，275，（5），3107-3113.

[14]Niederberger E，Tegeder I，Vetter G，et al.Cele COXib loses its anti-inflammatory efficacy at high doses through activation of NF-κB[J].FASEB J，2001，15（9）：1622-1624.

[15]Strong VE，Mackrell PJ，Concannon EM，et al.Blocking prostaglandin E2 aftertrauma attenuates pro-inflammatory cytokines and improves survival[J].Shock，2000，14（3）：374-379.

Express of cyclooxygenase-2 and NF-κB for hepatocellular injury in rats with sepsis

LI Bin LIU Liping GUO Hong LI Xun
Intensive Care Units,the First Hospitalof Lanzhou University,Gansu Province,Lanzhou 730000,China

ObjectiveTo study the expression of cyclooxygenase 2 and NF-κB on hepatic inflammatory reaction of rats with sepsis and their interrelation.Methods54 Wistar rats(200-220 g)were randomly divided into 3 groups.A:sham group(with saline injected into intraperitoneal 2 h before the experiment,and operation after anesthesia,no-maked model induced,n=6);B:sepsis model group(with saline injected into intraperitoneal 2 h before the experiment,and to make sepsis model after anesthesia by using CLP,n=24);C:NS-398 intervention group(to make sepsis model by using CLP,NS398 10 mg/kg injected into intraperitoneal 2 h before the experiment,n=24).Animal model was established with cecum ligation perforation(CLP)method.RT-PCR were used to determine COX-2 mRNA expression in liver tissue,NF-κB of hepatocyte was detected by immunohistochemical method.At the same time,ALT,AST and liver pathological changes were detected.Results①The expression of COX-2 mRNA were lower in group A(1040.82±2.77), higher in group B than C at the same time.②The expression of NF-κB were lower in hepatocyte in group A[3 h: (0.60±0.54),6 h:(0.60±0.54),12 h:(0.60±0.54),24 h:(0.60±0.54)],but higher after CLP[3 h:(2.60±0.55),6 h:(7.20± 1.09),12 h:(12.20±0.32),24 h:(6.40±0.73)],but were higher in group B than in group C[3 h:(1.60±1.89),6 h:(6.60± 0.79),12 h:(9.20±2.68),24 h:(4.80±1.60)]at the same time(P<0.05).According to Pearson correlation analysis,it was positive correlation between cyclooxygenase-2 mRNA and NF-κB(r=0.685,P=0.042).③Serum ALTand AST weresignificantly increased in B[ALT:3 h:(174.00±18.73)U/L,6 h:(204.67±23.59)U/L,12 h:(311.00±44.53)U/L,24 h: (506.67±24.79)U/L;AST:3 h:(619.67±145.81)U/L,6 h:(594.00±34.59)U/L,12 h:(1027.66±136.21)U/L,24 h: (1518.33±139.38)U/L]than group C[ALT:3 h:(105.33±18.01)U/L,6 h:(157.00±32.36)U/L,12 h:(101.00±16.52)U/L, 24 h:(93.33±10.41)U/L;AST:3 h:(217.00±26.21)U/L,6 h:(461.33±22.01)U/L,12 h:(322.00±72.33)U/L,24 h:(268.00± 98.57)U/L],but significantly decreased in group C than group B(P<0.05).Those prompted Hepatic pathologic injury extenuate after intervention.ConclusionCOX-2 plays an important role in hepatic injury by sepsis,NS-398 can peculiarly inhibitthe expression of NF-κB by inhibiting COX-2,thus relieves injury of hepatocyte.

Sepsis;Cyclooxygenase-2;NS398;Hepatic injury;NF-κB

R631.3

A

1673-7210（2014）03（b）-0014-05

2013-11-11本文編輯：衛(wèi)軻）

李斌（1972.9-），男，山西交城人，碩士，副主任醫(yī)師；研究方向：重癥醫(yī)學。

李汛（1972.12-），男，甘肅成縣人，博士研究生，主任醫(yī)師，教授，主要從事普通外科、重癥醫(yī)學方面的研究。