骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞全細(xì)胞抗原干預(yù)肺癌細(xì)胞系A(chǔ) 549移植瘤生長的實(shí)驗(yàn)研究

李 靜 陳 軍 李秀玉

1.海軍總醫(yī)院中醫(yī)科，北京100048；2.陜西中醫(yī)學(xué)院針灸推拿系，陜西咸陽712046

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞全細(xì)胞抗原干預(yù)肺癌細(xì)胞系A(chǔ) 549移植瘤生長的實(shí)驗(yàn)研究

李 靜1陳 軍2李秀玉1

1.海軍總醫(yī)院中醫(yī)科，北京100048；2.陜西中醫(yī)學(xué)院針灸推拿系，陜西咸陽712046

目的觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的全細(xì)胞抗原（WCAs）對人肺腺癌細(xì)胞株A549荷瘤的影響，并探討腫瘤相關(guān)增殖抗原的改變揭示其可能的抑制機(jī)制。方法全骨髓貼壁法原代培養(yǎng)小鼠MSCs，取3~5代MSCs以15 Gy X線滅活獲取WCAs，將BALB/c小鼠隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組各24只。實(shí)驗(yàn)組皮下接種WCAs（1次/3 d，共2周），獲得免疫接種小鼠模型，對照組皮下注射同體積的磷酸緩沖液。觀察兩組小鼠腫瘤生長情況，測量腫瘤直徑、計(jì)算腫瘤體積，并于接種后第7（Day7）、30天（Day30）行Western blot及實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）及Ki-67因子的蛋白及mRNA水平。結(jié)果肺腺癌A549細(xì)胞皮下移植成功使小鼠荷瘤，實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤體積顯著小于對照組（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組PCNA蛋白水平顯著低于對照組[Day7：（6.42±0.54）比（18.67±0.96），P＜0.01；Day30：（2.12±0.14）比（4.32±0.25），P＜0.05]；PCNA mRNA水平低于對照組[Day7：（11.64±0.28）比（25.18±1.37），P＜0.01；Day30：（2.11±0.18）比5.69±0.41），P＜0.01]；實(shí)驗(yàn)組Ki-67蛋白水平顯著低于對照組[Day7：（1.57±0.51）比（4.84±0.23），P＜0.05；Day30：（2.75±0.28）比（5.66±0.19），P＜0.01]；Ki-67 mRNA水平也明顯下調(diào)[Day7：（2.12±0.43）比（5.94±1.03），P＜0.01；Day30：（3.71±0.72）比（8.62±0.35），P＜0.01]。結(jié)論采用MSCs獲得全細(xì)胞抗原進(jìn)行免疫應(yīng)激可產(chǎn)生抑制腫瘤生長作用，其機(jī)制可能與及腫瘤增殖相關(guān)因子PCNA、Ki-67的下調(diào)有關(guān)，其內(nèi)在的免疫分子機(jī)制有待深層次的探索。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；腫瘤；免疫治療

免疫治療不僅能增強(qiáng)機(jī)體的主動(dòng)抗腫瘤能力，識(shí)別殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)還避免了傳統(tǒng)治療的毒副作用。腫瘤特異性抗原和相關(guān)抗原能夠激發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫，從而識(shí)別和殺傷腫瘤[1]。最新的理念認(rèn)為，選取盡可能全面的腫瘤抗原作為應(yīng)激抗原可以最大程度實(shí)現(xiàn)腫瘤免疫應(yīng)激，從而激發(fā)抗腫瘤作用。因此，如何獲取最為理想的腫瘤抗原成為腫瘤免疫研究的熱點(diǎn)。當(dāng)前，全腫瘤細(xì)胞抗原（WCAs）、樹突細(xì)胞荷載腫瘤全抗原、抗原多重修飾等等研究正初步展開[2-3]；有意思的是，有學(xué)者基于腫瘤細(xì)胞與干細(xì)胞的相似性，提出通過“胚胎類物質(zhì)”或“干細(xì)胞”等獲得抗原進(jìn)行荷瘤免疫，發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞的WCAs對大腸癌細(xì)胞皮下移植瘤有明顯抑制作用[4]。

目前，對于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）全抗原對于腫瘤預(yù)防免疫應(yīng)激的研究尚無報(bào)道。MSCs屬于成體干細(xì)胞，存在于骨髓基質(zhì)中可向三個(gè)胚層組織進(jìn)行誘導(dǎo)分化，取材簡單、培養(yǎng)容易，且其研究及臨床運(yùn)用均不存在倫理爭議[5]。本研究采用MSCs為目的瘤苗制備WCAs，分次對小鼠進(jìn)行預(yù)防接種后進(jìn)行以人肺腺癌A549細(xì)胞荷瘤造模，觀察腫瘤生長情況并初步探索分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；熒光定量PCR儀（日本TOYOBO東洋紡定量PCR儀器型號(hào)：Biored IQ5）；凝膠成像系統(tǒng)（美國ProteinSimple公司）；低溫高速離心機(jī)（美國Beckman公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

BALB/c野生小鼠（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院）；RPMI-1640、低糖型培養(yǎng)基（DMEM）（美國Hyclone公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；胰白酶干粉（美國Sigma公司）；10×多聚賴氨酸（北京中杉公司）；膠考馬斯亮藍(lán)（美國Sigma）；BCA蛋白濃度測定藥盒（PIERCE公司）；丙烯酞胺（美國Sigma）；甲又丙烯酞胺（美國Sigma）；Tris堿（上海生工生物技術(shù)公司）；一抗anti-PCNA，anti-Ki-67（美國Santa）；二抗-辣根（北京中杉公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MSCs培養(yǎng)、鑒定及A549培養(yǎng)①M(fèi)SCs：全骨髓貼壁法培養(yǎng)MSCs，6周小鼠的股骨和脛骨，以10%胎牛血清（FBS）-低糖DMEM沖出骨髓，直接接種在培養(yǎng)瓶里，24~48 h后去懸浮，再接下來的每3~4天換液，直到需要傳代。②人肺腺癌A549細(xì)胞：從液氮罐中取出A549細(xì)胞凍存管，放入37℃水浴鍋中解凍，1000 r/min離心5 min，PBS吹打清洗重新離心后，以10%FBS+5%RPMI-1640培養(yǎng)，每2~3天換液，直到需要傳代。

1.3.2MSCs全細(xì)胞抗原制備、免疫應(yīng)激BALB/c小鼠及實(shí)驗(yàn)分組X線照射裂解法獲得抗原，具體如下調(diào)整3~5代A549細(xì)胞密度為1×106，接種于培養(yǎng)皿中行X線照射，照射強(qiáng)度為15 Gy；照射后的抗原4℃保存不超過6 h。獲得WCAs后，根據(jù)是否接受抗原刺激將BALB/c小鼠隨機(jī)分成兩組，每組各24只；其中實(shí)驗(yàn)組小鼠每3天接受1次皮下注射瘤苗應(yīng)激（抗原液加PBS共2 mL），2周后（共5次）進(jìn)行腫瘤荷瘤造模。對照組小鼠每3天接受1次皮下注射2 mL的PBS，同樣2周后行荷瘤造模。

1.3.3 A549皮下移植造模及腫瘤測量獲得復(fù)蘇后3~4代A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106接種小鼠上肢下方（腋窩下）皮膚，接種后分別于第3、5、7、15、21、30天觀察腫瘤增長情況；處死小鼠后，取下腫瘤組織，測量最長徑與最短徑，計(jì)算腫瘤體積，公式為公式V=2πab/6（a為長徑，b為短徑）。

1.3.4Wes tern b l ot檢測PCNA、Ki-67蛋白表達(dá)接種后第7、30天，提取細(xì)胞總蛋白，紫外分光光度計(jì)檢測蛋白濃度后將蛋白上樣，以堆積膠80 V，分離膠120 V，電泳時(shí)間90min；移入玻璃皿中加入Coomassie染色液2 h后脫色；再轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育，一抗的封閉液稀釋為1∶20，同時(shí)抗人GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）單克隆抗體作為陽性對照，其封閉液稀釋為1∶1000。室溫作用2 h，TBST沖洗5 min×4次；辣根酶標(biāo)記二抗，封閉液稀釋為1∶2000，室溫1 h后TBST沖洗；定影、顯影。結(jié)果用數(shù)碼相機(jī)攝取并用NCBI的Melanie Viewer 7.0軟件分析進(jìn)行圖像分析，測定各個(gè)條帶的灰度值，將SIRTI條帶灰度值與其相應(yīng)的GAPDH條帶灰度值相比較，每組所得數(shù)值求均數(shù)。

1.3.5 Rea l-t ime PCR檢測PCNA、Ki-67 mRNA表達(dá)接種后第7、30天，提取細(xì)胞總RNA提取，所得RNA溶解于DEFC水中；紫外分光光度計(jì)測定總RNA濃度取2μL總RNA稀釋至600μL，測260處光密度OD值，RNA濃度（μg/mL）=OD×300×40。加入逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系。擴(kuò)增過程：取2μL模板，在25μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中先將模板于97℃，2 min，加入Taq DNA聚合酶，循環(huán)儀中循環(huán)35次。PCR擴(kuò)增條件及引物見表1。反應(yīng)完成后，取10μL PCR反應(yīng)液在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳分離，EB染色后照相，軟件系統(tǒng)掃描。以目的mRNA擴(kuò)增帶的平均光密度對GAPDH mRNA擴(kuò)增帶平均光密度的比值代表組織中目的mRNA的表達(dá)水平。

表1 PCNA、Ki-67和GAPDH的Real-time PCR引物與條件

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSCs形態(tài)

原代接種1 d即可見較多貼壁細(xì)胞，外觀呈紡錘形和多角形，并可見細(xì)胞核，48～72 h后細(xì)胞數(shù)量明顯增多，呈現(xiàn)纖維長條樣梭型細(xì)胞；圖1示不同放大倍數(shù)下MSCs的形態(tài)，可看到不甚均一的梭型排列的細(xì)胞，400倍鏡下可見到有部分細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)有雙核仁。

圖1 MSCs倒置顯微鏡下形態(tài)

2.2 移植瘤體積及其增殖曲線評(píng)估

分別對兩組小鼠的腫瘤進(jìn)行測量，首先評(píng)估體內(nèi)腫瘤增殖情況，如圖2所示，實(shí)驗(yàn)組皮下移植腫瘤明顯小于對照組；進(jìn)一步解剖獲得腫瘤，分別測量兩組腫瘤的最長徑與最短徑計(jì)算出其體積，第3天時(shí)，對照組移植瘤的短徑及長徑均大于實(shí)驗(yàn)組，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），然而自第5天開始，MSCs抗原進(jìn)行預(yù)防接種，實(shí)驗(yàn)組其短經(jīng)與長徑都小于對照組（P＜0.05）；第3、5、7、15、21、30天實(shí)驗(yàn)組體積均明顯小于對照組（P＜0.05或P＜0.01），見表2。并進(jìn)一步獲得其增殖曲線，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的增殖趨勢明顯低于對照組。

表2 兩組移植瘤直徑及體積的比較（x±s）

圖2 移植瘤體積及增殖曲線

2.3MSCs全細(xì)胞瘤苗抗原對PCNA及Ki-67的影響

MSCs作用后，腫瘤組織的PCNA及Ki-67的表達(dá)都明顯下調(diào)，本研究檢測了7、30 d的PCNA與Ki-67的表達(dá)，可見在蛋白水平及mRNA水平PCNA與Ki-67的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表3、圖3~4。

表3 兩組PCNS及Ki-67表達(dá)水平比較（x±s）

圖3 兩組PCNA、Ki-67的蛋白表達(dá)情況

圖4 兩組PCNA、Ki-67的m RNA表達(dá)

3 討論

腫瘤免疫治療源于Burnet提出的“腫瘤免疫監(jiān)視”理論，認(rèn)為機(jī)體的免疫系統(tǒng)能夠通過細(xì)胞免疫機(jī)制識(shí)別并產(chǎn)生免疫應(yīng)答。研究表明，該種免疫應(yīng)答的機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多種免疫細(xì)胞及其分泌的產(chǎn)物，包括T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、NC細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞介導(dǎo)的特異或非特異的細(xì)胞免疫，抗體介導(dǎo)的體液免疫以及補(bǔ)體、細(xì)胞因子的抗腫瘤作用[6]；因此，探索有效、安全的應(yīng)激源即“識(shí)別”是免疫治療的基礎(chǔ)[7]。

腫瘤的胚胎特性的認(rèn)識(shí)由來已久，并且二者在增殖分化、侵襲、血管侵蝕和新生血管形成、免疫逃逸及細(xì)胞凋亡等諸多方面具有驚人的相似性[8]：二者表達(dá)相同的表面抗原，即癌胚抗原（carcino-embryonic antigens，CEA），在腫瘤狀態(tài)時(shí)會(huì)使得機(jī)體一些機(jī)體發(fā)育過程中許多原本“關(guān)閉”的基因激活，可重新生成和分泌這些胚胎期的蛋白如甲胎蛋白、CEA、FSA等[9-10]。正是基于此，研究者開始探索干細(xì)胞與腫瘤的關(guān)系。大量研究，在多種實(shí)體腫瘤中都存在少數(shù)具有干細(xì)胞特性即自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞亞群，這種細(xì)胞亞群被稱為腫瘤干細(xì)胞，其對腫瘤形成、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及化療耐藥性都有著重要影響[11]。2009年，Li等[4]創(chuàng)新性地發(fā)現(xiàn)以胚胎干細(xì)胞體外制作瘤苗可以起到抑制腫瘤增殖的作用，這項(xiàng)研究也使得人們在瘤苗探索的道路上多了新的思路，即干細(xì)胞可以作為瘤苗來源。那么，除了胚胎干細(xì)胞別的干細(xì)胞是否具有類似的作用呢？

本研究首次評(píng)估了MSCs作為瘤苗具有腫瘤免疫接種作用。筆者以X線照射MSCs獲得裂解抗原，每周3 d一次給予BALB/c小鼠皮下接種，連續(xù)4周獲得瘤苗應(yīng)激模型；再以GFP-A549皮下注射對其進(jìn)行荷瘤造模，并設(shè)置第3、5、7、15、21、30天觀察腫瘤增殖情況，本研究發(fā)現(xiàn)瘤苗接種組從第3天開始其腫瘤體積小于對照組，并且隨著時(shí)間的延長，其差別愈發(fā)明顯，說明疫苗應(yīng)激產(chǎn)生的抑瘤作用可能是長期的。Li等[4]采用胚胎干細(xì)胞系H9獲得疫苗，觀察其免疫刺激后荷瘤的增殖情況，同樣發(fā)現(xiàn)自第3天開始其免疫應(yīng)激的抑瘤作用開始凸顯；又有學(xué)者比較胚胎干細(xì)胞瘤苗對于不同數(shù)量的腺瘤細(xì)胞移植后腫瘤增殖的影響，發(fā)現(xiàn)無論移植初始細(xì)胞計(jì)量多少，干細(xì)胞瘤苗均可以產(chǎn)生明確的抑瘤作用[12]。

PCNA由Miyachi等[13]于1978年在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血清中首次發(fā)現(xiàn)并命名，因其只存在于正常增殖細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞內(nèi)而得名；Mathews等[14]發(fā)現(xiàn)PCNA與細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）屬于同一物質(zhì)，并與細(xì)胞增殖程度直接相關(guān)；后來人們在乳腺癌、肺癌、肝癌、大腸癌等多種腫瘤中都監(jiān)測到PCNA表達(dá)的上調(diào)[15-16]；總之，在不同的調(diào)控通路中，PCNA可以作為多種蛋白的功能轉(zhuǎn)換因子發(fā)揮作用。在細(xì)胞增殖、分化及凋亡事件中，PCNA都參與了十分重要的角色，尤其是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)。Ki-67是一種大分子蛋白質(zhì)，存在于細(xì)胞核內(nèi)，1993年，學(xué)者得出其氨基酸序列[17]，發(fā)現(xiàn)其包含有40個(gè)弱的和10個(gè)強(qiáng)的PCST區(qū)（富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸）；研究顯示，Ki-67與細(xì)胞增殖至關(guān)重要，可以用來識(shí)別生長中的正常和腫瘤細(xì)胞，評(píng)估細(xì)胞的增殖程度，但對靜止期的細(xì)胞無作用，故Ki-67已成為細(xì)胞增殖的標(biāo)志之一；研究者發(fā)現(xiàn)Ki-67的作用是在有絲分裂過程中有維持DNA規(guī)則結(jié)構(gòu)的重要作用，是具有結(jié)合特性的重要的結(jié)構(gòu)蛋白，在細(xì)胞增殖過程中不可缺少[18]；研究已經(jīng)證實(shí)其在乳腺癌[19]、肺癌[20]、結(jié)直腸癌[21]等幾乎所有的惡性增殖的腫瘤中都高表達(dá)。

因此，為了初步評(píng)估MSCs瘤苗用于A549的接種的分子機(jī)制，本研究檢測了第7、30天接種組和對照組腫瘤增值因子PCNA及Ki-67的蛋白及mRNA表達(dá)情況。正如本研究結(jié)果中描述的一樣，瘤苗應(yīng)激刺激后無論蛋白水平和RNA水平，PCNA及Ki-67的表達(dá)都顯著下調(diào)，從而推測，瘤苗可能由于免疫狀態(tài)的改變下調(diào)了抑制瘤的增殖活性，從而抑制了移植瘤的增殖。當(dāng)然，細(xì)胞的免疫通路紛繁復(fù)雜，其內(nèi)在的具體的分子通路及免疫機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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Research of vaccination with whole cells antigens from mesenchymal stem cells generate an antitumor effect of lung cancer cell line A549 in vivo

LIJing1CHEN Jun2LIXiuyu1
1.Department of Traditional Chinese Medicine,Navy General Hospital,Beijing 100048,China;2.Department of Acupuncture and Massage,Shaanxi University of Chinese Medicine,Shaanxi Province,Xianyang 712046,China

Ob jective To observe the influence ofwhole cell antigens(WCAs)ofmesenchymal stem cells(MSCs)on lung cancer cell line A549,discuss the change of related antigen of tumor proliferation,and reveal the possible inhibition mechanism.M ethods The MSCs was isolated and cultured adherent cells from marrow,and then 3-5 generations MSCswere inactivated by X-ray(15 Gy),and theWCAs were obtained the BALB/c ratswere divided into experimental group and control group random ly,with 24 rats in each group.The rats of experimental group were injected subcutaneousWCAs(1 time per 3 days,2 weeks),the control group immunized subcutaneously with PBS,the immunizationmousemodelswere obtained.The growth of rats tumor weremonitored,tumor volume was plotted,and the expression of PCNA,Ki-67 both in protein and mRNA level were monitored by Western blot and Real time-PCR respectively in 7(Day7),30 d(Day30)after inoculation.Resu lts A well-established lung cancer(A549)model was established,the tumor volume ofmice in the experimental group was significantly less than that of the control group(P＜0.05);the expression of PCNA protein in experimental group were significantly lower than that of the control group [Day7:(6.42±0.54)vs(18.67±0.96),P＜0.01;Day30:(2.12±0.14)vs(4.32±0.25),P＜0.05];level of PCNA mRNA was lower than that of the control group[Day7:(11.64±0.28)vs(25.18±1.37),P＜0.01;Day30:(2.11±0.18)vs(5.69±0.41), P＜0.01];the Ki-67 protein of the experimental group was significantly lower than that of the control group[Day7: (1.57±0.51)vs(4.84±0.23),P＜0.05;Day30:(2.75±0.28) vs(5.66±0.19),P＜0.01],the levelofKi-67mRNAwas also down regulated significantly[Day7:(2.12±0.43)vs(5.94±1.03),P＜0.01;Day30:(3.71±0.72)vs(8.62±0.35),P＜0.01].Conclusion Vaccination of rats with MSCs generated consistent anticancer effect of lung carcinoma,which is further confirmed by low expression of PCNA and Ki-67 compared with controls.While the further immunemechanism need more exploring.

Mesenchymal stem cells;Cancer;Immunotherapy

R734.2

A

1673-7210（2014）08（a）-0004-05

2014-04-15本文編輯：任念）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)81102678）。

李靜（1981-），女，博士研究生；研究方向：惡性腫瘤的中醫(yī)治療。