黑青稞籽皮提取物對心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護作用

蘇麗華 王璇琳 賀 敏 李偉靜 任素萍 王春燕 喬志新 丁雪潔 何躍忠▲ 于 群▲

1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院急診科，湖南長沙410011；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所，北京100850；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院急診科，北京100071

黑青稞籽皮提取物對心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護作用

蘇麗華1，2，3王璇琳2賀 敏2李偉靜2任素萍2王春燕3喬志新2丁雪潔2何躍忠3▲于 群2▲

1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院急診科，湖南長沙410011；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所，北京100850；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院急診科，北京100071

目的研究黑青稞籽皮提取物對心肌細胞缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷的保護作用及其機制。方法取大鼠胚胎心肌細胞（H9c2），隨機分為5組：正常對照組（C組）、缺氧/復(fù)氧組（H/R組）、缺氧/復(fù)氧+低、中、高劑量藥物組（H/R+ L、M、H組）。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡、細胞線粒體跨膜電位（ΔΨm）和細胞內(nèi)活性氧（ROS）產(chǎn)生情況；Western blot方法檢測B細胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl-2），Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax），總絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（tAkt）和磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（pAkt）蛋白表達變化。結(jié)果藥物組[（H/R+L）組至（H/R+H組）]細胞凋亡比例為（26.7±2.9）%至（6.1±1.1）%，較H/R組[（57.3±10.4）%]明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與H/R組比較，藥物組ΔΨm升高，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），ROS水平下降，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），Bcl-2及pAkt表達升高，Bax及tAkt表達無明顯變化。結(jié)論黑青稞籽皮提取物對心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷具有保護作用，可抑制心肌細胞凋亡，其可能與Bcl-2/Bax調(diào)控和激活磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）信號通路有關(guān)。

黑青稞；籽皮提取物；心肌細胞；缺氧/復(fù)氧；凋亡

心肌缺血再灌注損傷是冠心病、失血性休克及心血管手術(shù)中常見的病理損傷，可造成大量心肌細胞凋亡。心肌細胞的缺氧/復(fù)氧損傷與缺血再灌注損傷具有極為相似的病理生理機制。心肌的缺血再灌注損傷是一個極其復(fù)雜的病理生理過程，目前公認的主要致病機制包括氧化應(yīng)激損傷、細胞內(nèi)鈣超載、細胞凋亡、細胞能量喪失，中性粒細胞炎性反應(yīng)激活等。伴隨著缺氧/復(fù)氧損傷過程產(chǎn)生的大量的自由基[1]，具有很強的化學(xué)活性，活躍的電子很容易與細胞的組成物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，使細胞膜脂質(zhì)過氧化增強，抑制蛋白質(zhì)的功能并且破壞核酸及染色體，從而破壞細胞的結(jié)構(gòu)和功能。有效清除自由基，是阻止缺氧/復(fù)氧損傷進程的有效途徑?；ㄉ疹愇镔|(zhì)在體外對1，1-二苯基-2苦肼自由基（DPPH·）、超氧陰離子（O2-·）、羥基自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）均具有清除作用，尤其對·OH的清除能力強于抗壞血酸，且清除作用與濃度呈量效關(guān)系[2]。

黑青稞是一種生長在高原低溫低氧環(huán)境中的農(nóng)作物，其表皮中含有豐富花色苷，黃酮及類黃酮等物質(zhì)，藥理學(xué)研究表明，花色苷具有抗氧化、抗炎、降血脂、抑制腫瘤生成等生物學(xué)活性[3-4]，筆者在前期動物實驗中發(fā)現(xiàn)：黑青稞籽皮提取物能夠有效延長常壓缺氧及斷頭小鼠的存活時間，說明黑青稞籽皮提取物具有耐缺氧功效；同時，通過細胞學(xué)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：黑青稞籽皮提取物對心肌細胞的缺氧/復(fù)氧損傷具有良好的保護作用；經(jīng)過對黑青稞籽皮提取、分離，檢測，發(fā)現(xiàn)黑青稞籽皮提取物含有主要的花色苷物質(zhì)為氯化花翠素。為了探討黑青稞籽皮提取物抗缺氧作用的可能機制，筆者進行了相關(guān)實驗研究，以期擴展花色苷的應(yīng)用領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞H9c2細胞（購自上?；馍锟萍加邢薰荆?。

1.1.2 主要試劑黑青稞籽皮提取物（本實驗室提供）；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）（Gibco，批號：1237443）；胎牛血清（Hyclone，批號：NXC0582）；連二亞硫酸鈉（國藥集團，批號：20120413）；C膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）凋亡檢測試劑盒（凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司，批號：130411）；線粒體膜電位檢測試劑盒（編號：C2006）及活性氧檢測試劑盒（編號：S0033）（碧云天生物技術(shù)研究所）；二辛可酸（BCA）蛋白定量試劑盒（Pierce，批號：OC185139）；抗體：B細胞淋巴瘤白血病-2（Bcl-2）（編號：#2870S），Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）（編號：#2772S），絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（Akt，編號：#4691S），磷酸化絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（pAkt，編號：#4056S），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，編號：#2118S），均購于Cell Signaling Technology。

1.2 心肌細胞培養(yǎng)

H9c2細胞置于含有15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。細胞貼壁生長至鋪滿80%~85%后，用0.25%胰蛋白酶對細胞進行消化，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 心肌細胞H/R模型的構(gòu)建與實驗分組

采用化學(xué)性缺氧法，使用耗氧劑連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）建立缺氧模型。將Na2S2O4溶于低糖DMEM中，現(xiàn)用現(xiàn)配成終濃度為5 mmol/L Na2S2O4缺氧液。將含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液吸出，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次后換上缺氧液，置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)20 min，造成細胞缺氧；將缺氧液換成含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液放置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)8 h，使細胞復(fù)氧。

分別取正常培養(yǎng)的H9c2細胞隨機分為5組：正常對照組（C組）；缺氧/復(fù)氧組（H/R組）：按照上述缺氧/復(fù)氧模型培養(yǎng)；缺氧/復(fù)氧+低、中、高劑量藥物組（H/R+L、M、H組）：在復(fù)氧同時，在復(fù)氧培養(yǎng)基中加入已配制好的黑青稞籽皮提取物使其終濃度為75、150、300 mg/L，余處理同H/R組。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

H9c2細胞按以上分組進行處理后，消化收集所有細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次。加入C膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）凋亡檢測試劑盒中200 μL Binding Buffer重懸細胞，后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶（PI）輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)30 min，最后加入300 μL Binding Buffer混勻（Annexin V-FITC和PI終濃度均為1 mg/L），立即上機檢測，計算各組細胞凋亡率。

1.5 線粒體跨膜電位（ΔΨm）檢測

H9c2細胞按以上分組進行處理后，消化收集所有細胞，PBS洗滌1次。用500 μL培養(yǎng)基重懸細胞后，加入500 μL四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物（JC-1）染色工作液（終濃度為12.5 mg/L），置于37℃孵育30 min，用預(yù)冷的染色緩沖液洗滌2次，立即上機檢測，計算各組細胞紅綠熒光值比例。

1.6 細胞內(nèi)活性氧（ROS）檢測

H9c2按以上分組進行處理（但復(fù)氧及給藥時間縮短為4 h）后，消化收集所有細胞，PBS洗滌1次。加入用低糖DMEM稀釋的2′，7′-二氯氫化熒光素二酯（DCFH-DA）800 μL（終濃度為10 μmol/L），置于37℃孵育20 min。PBS洗滌細胞2次，立即上機，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm檢測各組細胞熒光強度。

1.7 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達改變

H9c2細胞按以上分組進行處理（但復(fù)氧及給藥時間縮短為4 h）后，消化收集所有細胞，PBS洗滌2次。向各組加入Western細胞裂解液重懸細胞，低溫放置30 min后，離心取上清，進行蛋白定量后，加入5×蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min變性處理。各組蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），后轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。將孵育過一抗和二抗的PVDF膜在Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)中進行檢測，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黑青稞籽皮提取物處理對H9c2細胞凋亡的影響

結(jié)果顯示，C組細胞與H/R組的凋亡細胞所占百分比分別為（5.0±1.1）%和（57.3±10.4）%，藥物組中凋亡細胞百分率與H/R組相比呈濃度依賴性降低，從（26.7±2.9）%降低到（6.1±1.1）%[（H/R+L）組至（H/R+H）組]，給藥組和H/R組凋亡細胞百分率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且不同劑量藥物組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。說明黑青稞籽皮提取物具有抑制缺氧/復(fù)氧損傷細胞凋亡的作用，且具有一定的劑量依賴性（圖1，封三）。

2.2 黑青稞籽皮提取物對H9c2細胞線粒體跨膜電位的影響

用熒光探針JC-1對線粒體跨膜電位進行檢測，紅綠熒光的比例越高，線粒體跨膜電位越高。缺氧/復(fù)氧損傷細胞紅綠熒光比值為（6.0±0.5），線粒體跨膜電位較C組明顯下降。H/R+L、M、H組的黑青稞籽皮提取物處理后紅綠熒光比值分別為（8.8±0.7）、（8.6±0.4）和（10.3±0.4），均較H/R組升高，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明黑青稞籽皮提取物處理后線粒體跨膜電位升高（圖2，封三）。

2.3 黑青稞籽皮提取物對H9c2細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響

DCFH可被細胞內(nèi)的活性氧氧化后生成有熒光的2′，7′-二氫二氯熒光黃（DCF），故DCF熒光值強度可反映ROS水平。H/R組DCF熒光強度為（87.7±1.3），較C組（12.0±3.1）明顯升高，說明缺氧/復(fù)氧損傷心肌細胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧。H/R+L、M、H劑量組的黑青稞籽皮提取物處理后DCF熒光強度分別為（46.5±1.6）、（40.5±5.3）和（32.4±3.3），較H/R組明顯下降，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明黑青稞籽皮提取物處理可降低缺氧/復(fù)氧細胞內(nèi)的活性氧水平（圖3，封三）。

2.4 黑青稞籽皮提取物對Bcl-2，Bax蛋白表達的影響

和C組比較，缺氧/復(fù)氧損傷的細胞Bcl-2表達出現(xiàn)明顯下降，各劑量給藥組細胞Bcl-2表達低于C組，但明顯高于H/R組，其中150 mg/L劑量組Bcl-2表達最高，300 mg/L劑量組次之。而Bax蛋白在各組中均沒有出現(xiàn)明顯的變化（圖4）。

圖4 各組細胞Bcl-2家族蛋白表達的水平

2.5 黑青稞籽皮提取物對Akt表達的影響

磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）信號通路具有調(diào)控細胞代謝、增殖和凋亡的作用，尤其與細胞凋亡的線粒體調(diào)控關(guān)系密切。Western blotting結(jié)果顯示，各組中總絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（tAkt）蛋白的表達無顯著變化；而H/R組pAkt蛋白表達顯著降低，黑青稞籽皮提取物處理后，各劑量組pAkt表達仍低于C組，但較H/R顯著升高（圖5）。說明缺氧/復(fù)氧對tAkt表達無明顯影響，但對pAkt具有抑制作用，黑青稞籽皮提取物可能具有重新激活該通路的作用。

圖5 各組細胞Akt及Pakt蛋白表達的水平

3 討論

心肌細胞的缺氧/復(fù)氧損傷與缺血再灌注損傷具有極為相似的病理生理機制。缺血再灌注損傷的發(fā)生機制涉及到線粒體跨膜電位下降、氧自由基生成、細胞凋亡等。線粒體跨膜電位下降和膜通透性改變導(dǎo)致線粒體內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞漿中，引發(fā)系列凋亡過程，線粒體解聯(lián)的呼吸鏈會產(chǎn)生大量活性氧，而大量的活性氧可以氧化線粒體內(nèi)膜上的心磷脂，加重線粒體解聯(lián)，二者相互作用，促進細胞凋亡[5]。ROS是心肌缺血再灌注損傷的主要啟動子之一，當(dāng)?shù)蛲鰡雍?，ROS進一步升高可加速凋亡過程。PI3K/Akt存活通路在心肌缺血再灌注損傷中起著重要的保護作用[6-7]。絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶C末端的Ser473殘基被磷酸化激活后，可作用于多種底物，包括Bcl-2家族、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，抑制細胞凋亡。在本實驗中，黑青稞籽皮提取物通過保護線粒體跨膜電位，抑制了活性氧產(chǎn)生，從而減少了活性氧對心肌細胞的損傷作用，這可能與激活PI3K/Akt通路及改變Bcl-2家族蛋白的表達水平密切相關(guān)。

通過高效液相色譜檢測，黑青稞籽皮提取物中總花色苷含量占籽皮提取物的7.6%，同時主要存在的天然花色苷物質(zhì)為氯化花翠素（含量為5.7%）。目前關(guān)于花色苷對心肌細胞缺氧/復(fù)氧保護作用的研究熱點是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷[8-9]，而對氯化花翠素相關(guān)研究較少[10]。通過本實驗筆者認識到，黑青稞籽皮提取物具有良好的心肌細胞保護作用，氯化花翠素是否單獨或者協(xié)同其他花色苷及類黃酮物質(zhì)對心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷起到保護作用，即明確黑青稞籽皮提取物的功效物質(zhì)基礎(chǔ)是下一步需要解決的問題。另外，黑青稞在耐缺氧/復(fù)氧損傷方面與紅景天具備一定的相似功效[11-12]。紅景天這一珍貴、稀缺的藏藥資源是非常有限的，而黑青稞在西藏地區(qū)廣為種植，在產(chǎn)量上比紅景天有明顯優(yōu)勢，因此未來有望以天然、綠色、低成本食品來源的天然植物替代珍貴的藥用資源，系本研究的意義所在。

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Protective effect of black barley pericarp extract on cardiomyocytes against hypoxia/reoxygenation injury

SU Lihua1,2,3WANG Xuanlin2HE Min2LI Weijing2REN Suping2WANG Chunyan3QIAO Zhixin2DING Xuejie2HE Yuezhong3▲YU Qun2▲
1.Department of Emergency,the Second Xiangya Hospital of Central South University,Hu′nan Province,Changsha 410011,China;2.Institute of Field Blood Transfusion,Academy of Military Medical Sciences,Beijing100850,China; 3.Department of Emergency,the Affiliated Hospital of Academy of Military Medical Sciences,Beijing100071,China

ObjectiveTo investigate the protective effect of black barley pericarp extract on cardiomyocytes against hypoxia/reoxygenation injury and to elucidate its underlying mechanism.MethodsCultured rat cardiac myoblast cells H9c2 were randomly divided into 5 groups:normal control group(C group),hypoxia/reoxygenation injury group(H/R group),and H/R followed by drug treatment with low/median/high dose group(HR+L,+M,+H group).Cell apoptosis, mitochondrial transmembrane potential(ΔΨm)and the generation of intracellular ROS were monitored by flow cytometer.The protein levels of Bcl-2,Bax,tAkt and pAkt in H9c2 cells were observed by Western blot assay.ResultsIt was shown that black barley pericarp extract could reduce the apoptosis rate compared with H/R group cells[H/R group: (57.3±10.4)%,drug treat group(H/R+L)group→(H/R+H)group:(26.7±2.9)%to(6.1±1.1)%,P＜0.05],rescue the loss of mitochondrial transmembrane potential(P＜0.01),and inhibit the production of ROS(P＜0.01).Drug treatments increased the expression levels of Bcl-2 and pAkt rather than H/R group cells,accompanied with no changes in the expression levels of Bax and tAkt.ConclusionBlack barley pericarp extract can protect cardiomyocytes against hypoxia/ reoxygenation injury and suppress the apoptosis of cardiomyocytes,which may relate to Bcl-2/Bax regulation and PI3K-Akt activation pathway.

Black barley;Pericarp extract;Cardiomyocytes;Hypoxia/reoxygenation;Apoptosis

R284

A

1673-7210（2014）04（c）-0021-04

2013-10-30本文編輯：衛(wèi)軻）

蘇麗華（1988-），女，中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院2011級在讀碩士研究生；研究方向：中毒急救。

▲共同通訊作者