銅綠假單胞菌肺部感染對(duì)小鼠Toll樣受體2、4的影響

紀(jì)曉莉 徐 凌 陸 奕 沈 策▲ 湯 瑾

1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇蘇州215123；2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海200233；3.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200233

銅綠假單胞菌肺部感染對(duì)小鼠Toll樣受體2、4的影響

紀(jì)曉莉1，2徐 凌2陸 奕2沈 策2▲湯 瑾3

1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇蘇州215123；2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海200233；3.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200233

目的探討Toll樣受體（TLR）2、4 mRNA在銅綠假單胞菌慢性感染小鼠肺內(nèi)的動(dòng)態(tài)改變及其作用。方法56只雄性Balb/c小鼠隨機(jī)氣道接種含有銅綠假單胞菌（PA）瓊脂糖珠（感染組，34只）和無菌瓊脂糖珠（對(duì)照組，22只）。于第1、3、5、7、10天處死小鼠，取肺組織細(xì)菌培養(yǎng)，行肺組織病理觀察，ELISA法檢測(cè)肺泡灌洗液（BALF）中白介素（IL）-6和IL-17的含量，采用Real-time PCR檢測(cè)TLR2 mRNA及TLR4 mRNA表達(dá)。結(jié)果感染組在接種后第3天IL-6和IL-17水平均達(dá)高峰，分別為（154.83±12.51）ng/L和（601.05±25.53）ng/L，均顯著高于對(duì)照組（40.05±2.98）ng/L和（213.75±9.25）ng/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且兩者在接種后第10天仍處于高水平。感染組中TLR4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量第7天達(dá)高峰（4.09±0.25），與對(duì)照組第7天（0.97±0.05）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而TLR2 mRNA在感染組和對(duì)照組各時(shí)間相比變化均不明顯（P＞0.05）。結(jié)論TLR4與小鼠肺部慢性感染PA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其機(jī)制可能與TLR4在肺的免疫損傷中起到重要作用有關(guān)。

銅綠假單胞菌；Toll樣受體；慢性肺部感染；小鼠

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一種革蘭陰性桿菌，是慢性肺病常見的感染病原菌，如囊性纖維化、彌漫性泛細(xì)支氣管炎及支氣管擴(kuò)張等。由于PA分布廣泛，適應(yīng)能力強(qiáng)，也是臨床常見的機(jī)會(huì)致病菌，有統(tǒng)計(jì)顯示[1]，在ICU、呼吸內(nèi)科等臨床科室，PA檢出率占革蘭陰性菌株的23.18%，且表現(xiàn)出高度耐藥和多重耐藥。為制訂新的診療方法治療PA感染，需了解PA在肺部感染的發(fā)病機(jī)制。呼吸系統(tǒng)的免疫系統(tǒng)中固有免疫越來越受到重視，特別是肺泡上皮細(xì)胞可通過其表面的受體識(shí)別細(xì)菌的特異成分，其中Toll樣受體（Toll like receptors TLRs）[2]主要承擔(dān)了這個(gè)任務(wù)，TLR2、TLR4和TLR5可以識(shí)別革蘭陰性桿菌的保守成分[3]。本研究主要觀察TLR2和TLR4在小鼠肺部慢性感染PA的變化，有助于探索出新的診療方法解決PA感染的臨床難題。

1 儀器與試藥

1.1 動(dòng)物與菌株

選用清潔級(jí)健康雄性Balb/c小鼠56只，6～8周齡，體重18～20 g，由上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動(dòng)物房提供。銅綠假單胞菌（ATCC27853）購于中國科學(xué)院微生物研究所。

1.2 藥物試劑與儀器

鹽酸氯胺酮注射液（福田古田藥業(yè)），低熔點(diǎn)瓊脂糖（Bio Basic，加拿大），引物設(shè)計(jì)與合成（上海生物工程），小鼠IL-6、IL-17 ELISA試劑盒（R&D，美國），一步法PrimeScript RT-PCR試劑盒（大連寶生物工程），7500 real time PCR儀（ABI，美國），Wellscan MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Labsystem Dragon，芬蘭）。

2 方法

2.1 包被PA瓊脂糖懸液的制備

參照朱松雷等[4]的方法將凍存的標(biāo)準(zhǔn)菌株制作成包被PA的瓊脂糖珠后，取微量的PA瓊脂糖懸液以10的倍數(shù)稀釋液接種到羊血瓊脂板上，37℃5%CO2孵育24 h后觀察菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，以做參照調(diào)整瓊脂糖懸液濃度至5×108CFU/mL。

2.2 動(dòng)物模型制作

將56只健康小鼠隨機(jī)分成兩組，其中，感染組34只，經(jīng)氣管接種含有PA的瓊脂糖懸液，對(duì)照組22只小鼠接種無菌的瓊脂糖懸液。參照文獻(xiàn)[4]的方法將50 μL PA瓊脂糖懸液和無菌瓊脂糖懸液分別接種感染PA組小鼠和對(duì)照組小鼠氣管內(nèi)，傷口予酒精消毒，不做縫合。此操作過程中感染組和對(duì)照組分別有4只和2只小鼠術(shù)后死亡。每日觀察小鼠飲食情況、呼吸狀況及體重變化等生理特征。接種后第1、3、5、7、10天各處死對(duì)照組小鼠4只，感染組6只。

2.3 標(biāo)本收集與處理

2.3.1 標(biāo)本的制備分別于各時(shí)間點(diǎn)取小鼠肺泡灌洗液（BALF）1.5 mL，ELISA法檢測(cè)BALF中IL-6、IL-17的變化。取小鼠右上肺稱重研磨培養(yǎng)，計(jì)數(shù)肺組織菌落；右下肺置于10%中性甲醛溶液中固定，制成石蠟切片，采用蘇木精-伊紅（H-E）染色。取左肺置-80℃冰箱保存，用于檢測(cè)肺組織中TLR-2 mRNA和TLR-4 mRNA的含量。根據(jù)表1標(biāo)準(zhǔn)對(duì)病理切片進(jìn)行評(píng)分[5]。

表1 肺組織的病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR提取肺組織RNA采用RNAsio Reagent，操作過程參照說明書，采用SYBRGreenⅡ熒光免疫法測(cè)定肺組織中TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的量。一步法實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件：42℃5 min，95℃10 s，1個(gè)循環(huán)；95℃5 s，58℃34 s，95℃15 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。TLR4的上游引物為5′-CTTCTCCCACTTCAGGCTCTT-3′，下游引物為5′-CCAGGTAGGCTCTGGTGTTCA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為166 bp；TLR2上游引物為5′-GAGCCGTTGGTGTATCTTTGA-3′，下游引物為5′-CTCCCATTCCAGGTAGGTGTT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為134 bp；GAPDH上游引物為5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游引物為5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為233 bp。在ABI7500realtimePCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。將GAPDH作為內(nèi)參比較目的基因的相對(duì)mRNA水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠的生理狀況

感染組小鼠嗆咳反應(yīng)嚴(yán)重，活動(dòng)量顯著減少，精神萎靡伴體重下降。對(duì)照組小鼠術(shù)后第1天活動(dòng)稍差，第2天基本恢復(fù)正常活動(dòng)和飲食。

3.2 肺組織細(xì)菌負(fù)荷

感染組各時(shí)間點(diǎn)處死的小鼠中，肺組織勻漿細(xì)菌培養(yǎng)均培養(yǎng)出PA菌落，第10天時(shí)仍大于103cfu/g，并且單胺氧化酶試驗(yàn)均為陽性，對(duì)照組的小鼠均未培養(yǎng)出PA菌落。

3.3 肺組織的病理學(xué)變化

對(duì)照組小鼠肺組織初期肺泡有少量滲出,結(jié)構(gòu)較清晰完整，第7天已經(jīng)恢復(fù)正常，肺泡腔已無滲出，肺間質(zhì)未見明顯的炎癥浸潤表現(xiàn)。感染組小鼠的早期病理表現(xiàn)為肺泡內(nèi)有大量滲出并伴有出血，肺間質(zhì)內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤；第10天時(shí)表現(xiàn)為遠(yuǎn)端肺泡結(jié)構(gòu)有塌陷，有纖維增生，仍伴有大量炎癥細(xì)胞。見圖1。對(duì)兩組病理評(píng)分采用秩和檢驗(yàn)，其中，感染組30例，秩和為1065，秩均值為35.5，對(duì)照組20例，秩和為210，秩均值為10.5，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=6.853，P＜0.05）。

圖1 肺組織病理變化（HE，200×）

3.4 小鼠肺泡支氣管灌洗液中細(xì)胞因子水平

感染組IL-6、IL-17水平在術(shù)后第3天達(dá)到峰值，隨時(shí)間遷移有所下降，但仍然維持在較高的水平，與對(duì)照組相比較有顯著增加趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)IL-6、IL-17均表現(xiàn)為低水平。見表2、3。

3.5 肺組織中TLR2、TLR4 mRNA表達(dá)水平

肺組織中TLR4 mRNA表達(dá)情況：感染組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠的TLR4 mRNA的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。感染組小鼠TLR2 mRNA表達(dá)與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表5。

4 討論

PA慢性肺部感染是臨床上常見的慢性肺部疾病，常見于囊性纖維化、彌漫性泛細(xì)支氣管炎和支氣管擴(kuò)張等，由于肺組織長期感染，導(dǎo)致炎癥遷延和肺部結(jié)構(gòu)損傷，患者往往出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸道癥狀和肺功能障礙。隨著肺組織損傷程度加重，患者可出現(xiàn)臨床癥狀惡化，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量和生存壽命[6]，尋找新的PA感染治療位點(diǎn)一直是醫(yī)學(xué)界探索目標(biāo)。

表2 兩組小鼠肺泡支氣管灌洗液中IL-6水平比較（ng/L，x±s）

表3 兩組小鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-17水平比較（ng/L，x±s）

表4 兩組小鼠肺組織中TLR4 mRNA水平比較（x±s）

表5 兩組小鼠肺組織中TLR2 mRNA水平比較（x±s）

TLRs是一類病原模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs），PRRs識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），即病原體的基本成分或病原體的產(chǎn)物，進(jìn)而產(chǎn)生一系列的生物學(xué)反應(yīng)。TLR4是最早發(fā)現(xiàn)的TLRs，通過識(shí)別脂多糖，向胞內(nèi)傳導(dǎo)信號(hào)，通過髓樣分化因子88（MyD88）介導(dǎo)下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子活化，激活I(lǐng)L-1、IL-6、IL-8、β-干擾素以及腫瘤壞死因子-α等下游炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，最終引起相應(yīng)炎癥介質(zhì)合成和釋放[7-9]，啟動(dòng)針對(duì)病原微生物的固有和獲得性免疫。

近年來研究顯示，TLR4、TLR2與很多肺部感染性疾病發(fā)展相關(guān)[10-11]，感染后，與對(duì)照組相比較肺組織中TLR4、TLR2均高表達(dá)，其通過參與中性粒細(xì)胞的上調(diào)而參與機(jī)體炎性反應(yīng)。Nathan等[12]發(fā)現(xiàn)，在敲除TLR2、TLR4基因的C57BL/6小鼠和野生型小鼠比較得出：在感染肺炎鏈球菌性角膜炎時(shí)，敲除TLR2基因的小鼠不能有效地招募中性粒細(xì)胞來協(xié)助角膜清除細(xì)菌，同時(shí)證實(shí)敲除TLR4基因小鼠無法啟動(dòng)固有免疫反應(yīng)。目前對(duì)TLR2、TLR4在PA慢性肺部感染中的作用了解還不甚全面。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠在感染PA后，與對(duì)照組小鼠相比，肺組織TLR4 mRNA顯著上升，第7天時(shí)達(dá)高峰，可能機(jī)制是TLR4受體在PA感染刺激后被全面激活，第10天仍然維持高水平表達(dá)，同時(shí)肺組織HE切片也有大量的炎癥細(xì)胞浸潤，說明TLR4在小鼠肺部慢性感染PA時(shí)被激活。既往也有研究證實(shí)，TLR4和PA感染角膜炎密切相關(guān)，野生型小鼠感染PA時(shí)，與對(duì)照組相比較感染組角膜TLR4 mRNA水平顯著上調(diào)，表明TLR4信號(hào)在感染PA時(shí)被激活，參與細(xì)菌性角膜炎反應(yīng)[13]。本研究顯示，TLR2 mRNA在兩組中表達(dá)沒有差異（P＞0.05）。推測(cè)原因可能是：①TLR2與對(duì)照組相比無變化與Ramphal等[14]的發(fā)現(xiàn)部分相一致，TLR2與PA肺部感染并無關(guān)聯(lián)；②TLR2主要識(shí)別革蘭陽性菌，與革蘭陰性菌不相關(guān)[15]。

IL-6、IL-17與PA感染密切相關(guān)，PA刺激人角膜上皮細(xì)胞后，可導(dǎo)致IL-6等其他相關(guān)炎癥因子的大量分泌[16]。有研究證實(shí)，IL-6是TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游因子，當(dāng)PA刺激TLRs，較對(duì)照組PA組IL-6的上升程度顯著高于對(duì)照組[17]。Ann等[18]發(fā)現(xiàn)，慢性感染PA的囊性纖維變性患者的痰液中IL-17 mRNA和蛋白都是高于非PA感染的囊性纖維變性患者。本研究與上述發(fā)現(xiàn)相符合，本研究發(fā)現(xiàn)小鼠感染PA后BALF中的IL-6和IL-17水平各個(gè)時(shí)間顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），第3天表達(dá)量比第10天高，可能原因是第3天時(shí)形成急性感染，為急性細(xì)菌感染的高峰，后來演變成慢性感染。感染組呈上調(diào)表達(dá)的IL-17可能提示IL-17參與PA感染后的局部免疫應(yīng)答。目前有研究發(fā)現(xiàn)，IL-17與TLR4也有著密切聯(lián)系，關(guān)節(jié)炎患者外周血單核細(xì)胞TLR4通過誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化參與關(guān)節(jié)炎疾病發(fā)生發(fā)展[17]。本研究發(fā)現(xiàn)TLR4和IL-17都在感染組中呈高表達(dá)，但PA慢性感染時(shí)TLR4是否參與IL-17的分泌，其機(jī)制并不十分清楚，在今后研究中可以進(jìn)一步探索。

本研究通過銅綠假單胞菌致使小鼠感染，檢測(cè)慢性感染PA小鼠肺組織TLR4 mRNA的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，并且TLR4信號(hào)傳導(dǎo)下游因子IL-6及相關(guān)炎癥因子IL-17在BALF中水平也顯著高于對(duì)照組，而TLR2 mRNA的表達(dá)量在感染組和對(duì)照組之間差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TLR2與PA慢性感染并無關(guān)聯(lián)，TLR4信號(hào)在PA肺部感染時(shí)被激活，參與機(jī)體的免疫病理損傷，加重慢性肺部感染病情，如果能采取一定措施來抑制TLR4的免疫應(yīng)答，將為以后了解PA肺部感染的發(fā)病機(jī)制和治療方案的探索提供思路。

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The changes of TLR2 and TLR4 on chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection in mice

JI Xiaoli1,2XU Ling2LU Yi2SHEN Ce2▲TANG Jin3
1.School of Medicine,Soochow University,Jiangsu Province,Suzhou215123,China;2.Department of Respiratory Medicine,the Sixth People′s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University,Shanghai200233,China;3.Department of Clinical Laboratory,the Sixth People′s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University,Shanghai200233, China

ObjectiveTo investigate the function changes of toll like receptor(TLR)2,4 in mice with chronic Pseudomonas aeruginosa(PA)lung infection.Methods56 male Balb/c mice were randomly given the airway inoculated with PA agarose beads(infection group,n=34)and sterile agarose beads(control group,n=22).On day 1,3,5,7,10 after infection,mice were sacrificed.Lung tissue bacterial cultures and lung pathology were observed,interleukin(IL)-6 and IL-17 in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were observed by ELISA.The mRNA expression of TLR2 and TLR4 were detected by Real-time PCR.ResultsCompared with control group,IL-6,IL-17 levels were up to the highest levels of infection group on day 3,data of infection group were(154.83±12.51)ng/L and(601.05±25.53)ng/L,significantly higher than control group,which were(40.05±2.98)ng/L and(213.75±9.25)ng/L,the differences were statistically significant (P＜0.05);and both of them were still at high levels on day 10.On day 7 the mRNA expression of TLR4 reached a peak of(4.09±0.25)in the infection group,and the control group was(0.97±0.05),the difference was statistically significant(P＜0.05),while no significant changes of TLR2 existed in the two groups in each time(P＞0.05).ConclusionTLR4 is closely related to the occurrence and development on chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection in mice, and the mechanism is that TLR4 may be crucial for its development of immune and inflammatory injury.

Pseudomonas aeruginosa;Toll like receptor;Chronic lung infection;Mice

R563

A

1673-7210（2014）04（c）-0017-05

2013-11-22本文編輯：程銘）

紀(jì)曉莉（1986.7-），女，山東臨沂人，蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部2011級(jí)呼吸科專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：銅綠假單胞菌的慢性感染。

▲通訊作者