頸總動脈結扎聯(lián)合半乳糖注射制備老年期癡呆大鼠模型及行為學評價研究

趙桂芝 王緒平 黃孝聞 楊明艷 壽旦

1.浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江杭州310007；2.浙江中醫(yī)藥大學，浙江杭州310053

頸總動脈結扎聯(lián)合半乳糖注射制備老年期癡呆大鼠模型及行為學評價研究

趙桂芝1王緒平1黃孝聞1楊明艷2壽旦1

1.浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江杭州310007；2.浙江中醫(yī)藥大學，浙江杭州310053

目的探討不同制備方法對癡呆大鼠模型學習記憶能力的影響，為藥效評價提供老年期癡呆大鼠模型。方法40只Wistar雄性大鼠隨機分為5組：分期雙側頸總動脈永久結扎后D.半乳糖注射組(A組)；D.半乳糖注射后分期雙側頸總動脈永久結扎組(B組)；單次雙側頸總動脈永久結扎組(C組)；D.半乳糖注射組(D組)，正常對照組(E組)，每組8只。除E組外，A組左側頸總動脈結扎，間隔1周后行右側頸總動脈結扎術；并于結扎術1周后行D.半乳糖腹腔注射(60 mg/kg體重，每天1次)，共連續(xù)注射42 d；B組腹腔連續(xù)注射D.半乳糖(60 mg/kg體重)42 d后，再行雙側頸總動脈永久結扎術；C組僅行雙側頸總動脈永久結扎術42 d，腹腔不注射半乳糖；D組：僅連續(xù)腹腔注射D.半乳糖(60 mg/kg體重)42 d，不接扎其雙側頸總動脈。最后采用Morris水迷宮行為學測試法進行定位航行及空間探索實驗；取各組大鼠海馬CA1區(qū)進行電鏡觀察。結果與C、E組相比，A、B及D組游泳時間與距離均明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；而A組與B、D組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；比較正常組各模型組海馬CA1區(qū)錐體細胞有不同程度的丟失，且腦組織病理學改變明顯。結論采用雙側頸總動脈永久結扎聯(lián)合半乳糖腹腔注射方法，制備的老年期癡呆大鼠模型，記憶力明顯減退，且腦組織病理學顯著改變，能有效重現(xiàn)老年期癡呆患者的發(fā)病特點。

老年期癡呆；行為學評價；學習記憶；組織病理學

隨著老齡化社會到來，老年性癡呆發(fā)病率持續(xù)上升，老年癡呆患者人群不斷擴大，其中以阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)及血管性癡呆(vascular dementia，VD)為主，兩種類型癡呆的臨床表現(xiàn)、神經(jīng)生物化學及神經(jīng)生理學特點存在不同程度的交錯；相關研究已證實兩者在發(fā)病機制及病理變化方面存在本質的相似［1.4］。由于在臨床癡呆人群中，“混合性癡呆”具有較高的流行趨勢［5］，現(xiàn)有的模型制備通常將兩者嚴格區(qū)分，筆者前期已優(yōu)化血管性癡呆大鼠模型制備方法［6］，研究證實腦衰老及腦低灌注是AD及VD發(fā)病過程中的兩大關鍵因素［7.10］。

基于AD和VD發(fā)病的多因性及相似性，本文嘗試利用腹腔注射半乳糖促老化，分期永久結扎雙側頸總動脈致腦低灌注的方法，制備腦衰老與腦低灌注兩種關鍵因素聯(lián)合作用的癡呆大鼠［11］。并進一步通過大鼠的學習記憶和空間記憶等行為學改變［12］，以及腦海馬組織病理學改變進行模型驗證與評價，以期為老年期癡呆的發(fā)病機制及藥物作用評價研究提供動物模型。

1 材料與方法

1.1 設備、材料與試劑

Morris水迷宮實驗儀及Ethovision 3.0分析軟件(荷蘭)；DM2500生物顯微鏡(德國徠卡)；D.半乳糖(D.galactose)，購自美國Sigmal試劑公司；手術剪、止血鉗、眼科彎鑷、縫針及0～3號縫線。

1.2 實驗動物與分組

1.2.1 實驗動物Wistar大鼠，雄性，體重190～210 g，購自上海思萊克實驗動物有限責任公司，飼養(yǎng)于浙江省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK(浙)2009.0122。

1.2.1 分組實驗大鼠40只，隨機分為5組，每組8只。A組：分期雙側頸總動脈永久結扎后D.半乳糖注射組(2VO+Gal組)；B組：半乳糖注射后分期雙側頸總動脈永久結扎組(Gal+2VO組)；C組：單次雙側頸總動脈永久結扎組(2VO組)；D組：半乳糖注射組(Gal組)；E組：正常對照組。

1.3 手術操作

A組：術前8～12 h禁食不禁飲水，10%水合氯醛以350 mg/kg劑量腹腔注射麻醉，仰臥位固定于保溫手術臺上，頸部皮膚備皮消毒后行頸側向切口，用0號絲線永久結扎左側頸總動脈，縫合皮膚。復蘇后正常飼養(yǎng)，觀察手術創(chuàng)口愈合情況，1周后行右側頸總動脈結扎術。術后第8天開始腹腔注射D.半乳糖，劑量60 mg/kg，每天1次，連續(xù)注射42 d。

B組：先腹腔注射D.半乳糖42 d，第41、48天分期行雙側頸總動脈永久結扎術，其余處理同A組。

C組：僅一次性雙側頸總動脈永久結扎，不注射半乳糖，其余處理同A組。

D組：僅腹腔注射D.半乳糖42 d，不行頸總動脈接扎術，其余處理同A組。

E組：不給予任何手術或藥物處理，與前4組大鼠同等條件飼養(yǎng)。

1.4 行為學實驗

實驗系統(tǒng)主要由圓形不銹鋼水池(直徑和深度分別為1.50 m和0.45 m)及圖像自動采集、處理系統(tǒng)組成。池內加水至水位高度為0.38 m，水中加碳素墨水使之渾濁，水溫(22±2)℃。水面以原點為中心均等劃分為L、P、R、O四個象限區(qū)，在P區(qū)中央放置一圓形有機玻璃平臺(直徑12 cm，高度0.36 m)。從與平臺相對的象限區(qū)(即O象限)，自距水面20 cm高度處以面向池壁方式拋投大鼠入水，到達平臺頂部后在平臺上休息30 s后重復操作，記錄其自入水至登上平臺所需的時間(即逃避潛伏期)、游泳路徑與游泳距離。如果大鼠180 s內未到達平臺，則由實驗者引導其至平臺，此時潛伏期為最高值(180 s)。實驗共進行7 d，前5天進行同樣的定位航行訓練，每天1次；第6天將實驗入水點改為相鄰的左側象限(L象限)區(qū)，同法操作并記錄數(shù)據(jù)；第7天行空間探索實驗，即撤去平臺，并將大鼠入水點恢復為O象限，觀察大鼠入水后60 s內的游泳情況并記錄路徑。A、D組于腹腔注射D.半乳糖后42 d，B、C組大鼠于雙側頸總動脈永久結扎術后1周，與E組大鼠同時進行行為學實驗。

記錄大鼠在水池各象限區(qū)的游泳距離與時間，并分別計算其占游泳總距離與總時間的百分比，以此作為大鼠學習記憶成績的評價指標。

1.5 腦海馬病理組織學觀察

1.5.1 病理切片制片及染色行為學實驗結束后，將每組大鼠斷頭處死，在冰盤上小心迅速取出完整腦組織，剝離出雙側海馬組織，用5%甲醛固定24 h，經(jīng)系列梯度酒精脫水，石蠟包埋后切片，并采用蘇木素.伊紅HE染色［13］，于電鏡下觀察海馬的病理變化。

1.5.2 腦海馬病理組織學改變判斷方法腦缺血所致的腦神經(jīng)細胞損傷與死亡，受損細胞類型與腦缺血的誘因、程度以及持續(xù)時間直接相關。由大腦中動脈(MCA)梗塞引起的腦缺血時，缺血中心區(qū)域的損傷表現(xiàn)以神經(jīng)元細胞(如紋狀體、皮層神經(jīng)元、海馬)壞死為主，表現(xiàn)為核固縮、破裂，細胞分界線消失。缺血梗死灶邊緣區(qū)域則以神經(jīng)元細胞凋亡為主，表現(xiàn)為細胞體積變小、胞漿皺縮、胞核固縮等［15］。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(s)表示，采用t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 動物外觀及行為活動

A、B及D組大鼠在半乳糖注射過程中，均逐漸出現(xiàn)行為異常，如活動減少、動作遲緩、精神不振等。A、B、C組大鼠頸總動脈永久結扎后，C組大鼠死亡2只，補充2只。C組術后有1只出現(xiàn)眼瞼下垂，術后第1天時大鼠自發(fā)活動均有所減少，但術后2 d后，除C組外的其余各組基本恢復至術前狀態(tài)，C組4 d后恢復術前狀態(tài)，各組飲水、攝食均未見明顯異常。

2.2 行為學分析結果

行為學分析結果見表1、2。由表1可知，C、E組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而A、B及D組時間比與距離比均較C、E組減小，差異有高度統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。但A組與B、D組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。表2顯示A、B、D組大鼠在P象限的游泳時間顯著少于正常對照組。

表1 空間探索實驗中各組大鼠原平臺象限游泳時間比與距離比分析s）

表1 空間探索實驗中各組大鼠原平臺象限游泳時間比與距離比分析s）

注：與E組比較，*P＜0.01；與C組比較，#P＜0.01

組別只數(shù)P象限游泳時間占總時間比P象限游泳距離占總距離比A組B組C組D組E組8 8 8 8 8 0 . 2 9 ± 0 . 0 4*#0 . 2 6 ± 0 . 0 4*#0 . 5 0 ± 0 . 0 8 0 . 3 0 ± 0 . 0 3*#0 . 5 0 ± 0 . 0 6 0 . 3 0 ± 0 . 0 3*#0 . 2 7 ± 0 . 0 5*#0 . 4 8 ± 0 . 0 6 0 . 2 9 ± 0 . 0 3*#0 . 4 6 ± 0 . 0 5

表2 空間探索實驗中大鼠各象限游泳距離及游泳速度比較（s）

表2 空間探索實驗中大鼠各象限游泳距離及游泳速度比較（s）

注：與E組比較，*P＜0.01；與C組比較，#P＜0.01

組別只數(shù)游泳速度( c m / s )各象限游泳距離( c m ) P L O R A組B組C組D組E組8 8 8 8 8 4 3 8 . 8 ± 9 1 . 3*#4 0 8 . 9 ± 7 7 . 8*#6 6 4 . 9 ± 7 4 . 5 4 0 6 . 1 ± 8 6 . 4*#6 3 3 . 6 ± 9 6 . 4 3 3 6 . 9 ± 1 3 5 . 1 3 1 0 . 2 ± 1 1 3 . 9 2 7 9 . 6 ± 1 0 9 . 9 2 9 2 . 0 ± 1 5 2 . 3 2 5 1 . 8 ± 4 7 . 2 3 0 5 . 0 ± 7 1 . 6 3 7 7 . 3 ± 7 5 . 4*#2 3 8 . 0 ± 6 0 . 6 3 7 1 . 5 ± 3 8 . 7*#2 2 8 . 7 ± 4 9 . 8 3 4 8 . 5 ± 1 3 8 . 6 4 2 6 . 8 ± 1 4 7 . 7#2 0 9 . 9 ± 7 0 . 0 3 0 5 . 5 ± 8 8 . 9 2 4 4 . 3 ± 4 5 . 8 2 4 . 3 ± 5 . 1 2 5 . 4 ± 2 . 8 2 3 . 2 ± 1 . 6 2 2 . 9 ± 4 . 1 2 2 . 6 ± 1 . 5

2.3 腦海馬病理組織學改變

各組腦海馬病理組織學改變見圖1。E組大鼠海馬CA1區(qū)樹突呈條索狀分布，錐體細胞3～4層，排列緊密、整齊；胞體完整，界線清晰，無變性壞死，胞核大而圓。A、B組大鼠海馬CA1區(qū)樹突明顯破壞，幾乎呈陰性染色，錐體細胞減少，細胞1～2層，排列松散，界限不清；可見變性壞死細胞，核固縮、破碎，呈深藍色，胞漿濃縮；C、D組海馬細胞丟失，排列紊亂，周圍結締組織增生情況較模型組明顯減少。

圖1 海馬組織CA1區(qū)HE染色切片（200×）

3 討論

以雙側頸總動脈同時永久結扎的方法制備的癡呆大鼠模型，由于短時間腦內供血驟降，易導致較高的動物死亡率。本文采用間隔1周，分期手術的方式結扎雙側頸總動脈，在手術間隔期，椎動脈緩慢代償性供血，逐漸形成前腦供血不足的病理狀態(tài)，其過程及表現(xiàn)與臨床慢性腦缺血更為接近［16］，且大鼠死亡率下降，術后恢復較快。因而采用分期頸總動脈永久結扎方式用于老年期癡呆大鼠的模型制備，具有動物死亡率低，術后運動功能恢復快，病理特征與臨床相似等特點。

本研究中的大鼠模型結合了腦衰老與腦低灌注兩種關鍵因素的作用，利用腹腔注射半乳糖促老化，使大鼠體內產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基，對腦組織產(chǎn)生過氧化損害；同時由于細胞內存積D.半乳糖后干預了細胞內物質代謝，細胞代謝功能下降，導致鼠快速衰老［17］；永久結扎雙側頸總動脈則導致腦內低灌流，細胞代謝能力進一步下降。兩種因素共同作用，使模型大鼠呈現(xiàn)明顯的學習、記憶能力減退特征，具備了老年期癡呆的臨床表現(xiàn)。且該造模過程較符合老年期癡呆臨床患者的病理歷程，因而適用于研究癡呆患者腦組織的形態(tài)及病理、生理變化，能夠為老年期癡呆的基礎研究及藥效評價提供有益參考。

此外，術后7 d，A組大鼠的原平臺象限游泳距離比、時間比等各項指標與B、D組比較，差異均無統(tǒng)計學意義，提示低灌注聯(lián)合半乳糖誘導記憶功能損傷無長期效應，此種現(xiàn)象可能與機體自身代償有關。據(jù)此推斷本模型仍屬急性.亞急性范疇，提示下一步工作應致力于更具實用性的亞急性.慢性模型研究工作。

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Studyonratsmodelofseniledementiabyligationofcarotidarteriescombined with injection of D-galactose and its application for behavioral evaluation

ZHAO Guizhi1WANG Xuping1HUANG Xiaowen1YANG Mingyan2SHOU Dan11.Zhejiang Academy of Traditional Chinese Medicine,Zhejiang Province,Hangzhou310007,China;2.Zhejiang Chinese Medical University,Zhejiang Province,Hangzhou310053,China

Objective To explore the effect of different preparation methods on learning and memory of senile dementia rats model,and to offer effective rats model for efficacy evaluation.Methods Totally 40 male Wistar rats were randomly divided into five groups:2.VO+D.galactose injected group（group A）;D.galactose injected+2.VO group（group B）; 2.VO group（group C）;D.galactose injected group（group D）;normal control group（group E）;8 rats in each group.Except the group E,unilateral common carotid artery were permanently ligated in the rats of group A,the other lateral artery then were permanently ligated after 7 days.With the interval of one week,the rats were injected with D.galactose（60 mg/kg,once every day）for 6 consecutive weeks.The rats of group B were injected with D.galactose（60 mg/ kg）for 6 consecutive weeks,then their bilateral common carotid arteries were permanently ligated,the bilateral common carotid arteries were permanently ligated only in the rats of group C.The rats of group D were injected peritoneally with D.galactose for 6 consecutive weeks only.Finally,the water maze experiment was taken to explore the place navigation and spatial experiments;and their hippocampal CA1 region in the rats of each group were observed with electron microscope.Results Compared with group C and E,the swimming time and distance in the rats of group A,B and D reduced obviously（P＜0.01）,but there were rarely differents between the rats of group A with the rats of group B and D（P＞0.05）.Compared with normal group,obvious loss of pyramidal cells hippocampal CA1 were found in every other group,and their cerebral pathology had significantly changes.Conclusion The senile dementia rats model established by the method of permanent bilateral common carotid artery ligation combined with intraperitoneal injection with D.galactose shows obvious loss in learning and memory,and has significant changes in their cerebral pathology, which represent the characteristics of the Senile dementia.

Senile dementia;Learning and memory;Behavioral evaluation;Histopathology

R332

A

1673-7210（2014）02（a）-0034-04

2013.08.28本文編輯：衛(wèi)軻)

浙江省科技計劃項目(編號2012F10022)。