Apelin-13對(duì)局灶性腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及受體表達(dá)的影響

李亮 龍俊 王知非

1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院神經(jīng)外科，湖南長沙410013；2.湖南省婁底市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，湖南婁底417000

Apelin-13對(duì)局灶性腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及受體表達(dá)的影響

李亮1，2龍俊1▲王知非1

1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院神經(jīng)外科，湖南長沙410013；2.湖南省婁底市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，湖南婁底417000

目的觀察Apelin.13對(duì)局灶性腦缺血.再灌注損傷大鼠缺血區(qū)皮層腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和及其受體酪氨酸激酶B(TrkB)表達(dá)的影響。方法采用線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈缺血.再灌注損傷模型。SD雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和Apelin.13(0.1、1.0和10.0 μg/kg)處理組。缺血.再灌注損傷大鼠在缺血2 h后再灌注24 h，Apelin.13在再灌注前15 min進(jìn)行側(cè)腦室注射。采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)BDNF和TrkB mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死側(cè)皮層BDNF和TrkB mRNA和蛋白的表達(dá)顯著性增加，BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(100.00±0.00)%和(138.54±7.63)%；TrkB mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(100.00±0.00)%和(121.74±8.73)%。BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.25±0.04)和(0.38±0.05)；TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.23±0.03)和(0.36±0.04)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.45、10.79、10.37、8.76，均P＜0.05)。與模型組比較，1.0和10.0 μg/kg Apelin.13處理組大鼠腦梗死側(cè)皮層BDNF和TrkB的表達(dá)均顯著性增加，BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(138.54±7.63)%、(158.69±11.37)%和(189.31±13.74)%；TrkB mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(121.74± 8.73)%、(149.25±9.46)%和(166.41±13.74)%。BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.38±0.05)、(0.57±0.06)和(0.71± 0.08)；TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.36±0.04)、(0.51±0.07)和(0.68±0.07)，呈濃度依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.84、11.12、9.72、10.48，均P＜0.05)。結(jié)論Apelin.13對(duì)大鼠局灶性腦缺血.再灌注損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)BDNF及受體TrkB的表達(dá)有關(guān)。

Apelin-13；腦缺血-再灌注損傷；腦源性神經(jīng)生長因子；酪氨酸激酶B

腦血管疾病是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病之一，是導(dǎo)致死亡的重要原因之一。缺血性腦血管病占到腦血管疾病70%左右。腦缺血梗死后，再灌注會(huì)進(jìn)一步加重腦損傷［1］。Apelin是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的內(nèi)源性多肽，在神經(jīng)系統(tǒng)中有大量表達(dá)［2.3］。研究顯示Apelin能對(duì)抗興奮性毒性和氧化應(yīng)激等對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷以及抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，也能保抑制心肌的缺血.再灌注損傷［4.6］。因此本研究擬觀察Apelin.13對(duì)局灶性腦缺血.再灌注損傷大鼠缺血區(qū)皮層腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)和及其受體酪氨酸激酶B(tyrosine kinase B，TrkB)表達(dá)的影響，以探討Apelin.13對(duì)腦缺血.再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

Apelin.13為美國Sigma公司產(chǎn)品?？俁NA提取試劑盒、MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒、DNA Mark er和Hot Star Taq Master Mix試劑盒(Invitrogen公司)。引物由上海生物工程公司合成。BCA蛋白定量試劑(Pierce公司)。BDNF、TrkB和β.actin抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗為美國Santa Cruz產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量250～300 g，由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。將大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組(10只)、缺血再灌注組(10只)、不同劑量Apelin.13組(0.1、1.0、10.0 μg/kg，每組10只)。將Apelin.13溶解于生理鹽水，配成不同濃度的溶液，在再灌注前15 min進(jìn)行側(cè)腦室微量注射，確保注射的Apelin.13溶解量為30 μL/kg。假手術(shù)組和缺血再灌注組給予相同劑量的生理鹽水。

1.3 側(cè)腦室微量注射

腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠后固定在腦立體定位儀上，根據(jù)L.J.Pellegrine鼠腦定向圖譜在相當(dāng)于側(cè)腦室的顱骨部位，具體位置為大鼠矢狀縫和冠狀縫愈合處(前信)向后3～4 mm，中縫向右1～2 mm，深度為3 mm，鉆孔埋入插管套管，使用牙托粉固定。將注射器插入固定套管尖端伸出套管外1 mm，每次注藥3 min注完，并留針l min。

1.4 動(dòng)物模型制備

在大鼠側(cè)腦室埋管手術(shù)結(jié)束后，立即將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血模型。做頸部正中切口，分離出右側(cè)頸總和頸內(nèi)、外動(dòng)脈，在動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈，頸總動(dòng)脈剪一小口，插入頭端呈圓鈍形的尼龍魚線(直徑0.28 mm)，插入長度約18 mm，在大腦中動(dòng)脈起始端堵塞動(dòng)脈。將頸總動(dòng)脈和尼龍魚線一起結(jié)扎，縫合皮膚。在阻斷血流2 h后，通過拔出尼龍魚線實(shí)現(xiàn)再灌注24 h。假手術(shù)組只分離血管，不結(jié)扎動(dòng)脈，不插入尼龍魚線。大鼠蘇醒后左側(cè)肢體癱瘓，站立不穩(wěn)，左上肢屈曲、行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈的大鼠為造模成功，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

再灌注24 h后，斷頭處死大鼠后迅速取出大腦，選取梗死區(qū)皮層腦組織，進(jìn)行組織勻漿，Trizol提取腦組織的總RNA。提取的總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第一鏈。取cDNA樣品梯度稀釋，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)總體系為30 μL，包含1 μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL)，4 μL cDNA，1 μL雙鏈DNA特異性結(jié)合的熒光染料(SYBR Green 0NE)(50×)，上下游引物各1 μL，8 μL dNTP Mix(2×)，其余用蒸餾水補(bǔ)足。BDNF引物：上游：5′.TCC CTG GCT GAC ACT TTT GAG.3′，下游：5′.ATT GTG TAG ATC GGC ATT GCG.3′。TrkB引物：上游：5′.GCA CAC GCA CTC TCA CTG ACT GGC ACT.3′，下游：5′.GAG CGG GTC ACC CGC GAC GAT GCA GCT.3′。β.actin引物：上游：5′. CGA TCA TCT TCC AGG AGC G.3′，下游：5′.CTT GCA GTG TGC TAT ACT CG.3′。采用2.△△CT法處理數(shù)據(jù)，以假手術(shù)組作為對(duì)照組，以對(duì)照組為100%對(duì)目的基因的mRNA表達(dá)進(jìn)行分析。

1.6 Western blotting檢測(cè)

提取梗死區(qū)皮層腦組織總蛋白，BAC法蛋白定量。100 μL樣本加入到2×SDS凝膠加樣緩沖液中煮沸。凝膠電泳1 h分離蛋白質(zhì)，分離的蛋白轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙稀膜上。10%脫脂牛奶封閉2 h，加入兔抗鼠BDNF、TrkB和β.actin一抗，4℃下過夜。加入羊抗兔二抗，孵育6 h。顯影后進(jìn)行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間的兩兩比較采用LSD.t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Apelin-13對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死側(cè)皮層BDNF和TrkB mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，局灶性腦缺血再灌注損傷模型組大鼠腦梗死側(cè)皮層BDNF和TrkB mRNA表達(dá)顯著性增加，BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(100.00± 0.00)%和(138.54±7.63)%；TrkB mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(100.00±0.00)%和(121.74±8.73)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.45、10.79，均P＜0.05)。與模型組比較，1.0和10.0 μg/kg Apelin.13處理組大鼠腦梗死側(cè)皮層BDNF和TrkB mRNA表達(dá)均顯著性增加，BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(138.54±7.63)%、(158.69±11.37)%和(189.31±13.74)%；TrkB mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(121.74±8.73)%、(149.25±9.46)%和(166.41±13.74)%，呈濃度依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.84、11.12，均P＜0.05)。見圖1、2。

圖1 Apelin-13對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死側(cè)皮層BDNF mRNA表達(dá)的影響

2.2 Apelin-13對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死側(cè)皮層BDNF和TrkB蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，局灶性腦缺血再灌注損傷模型組大鼠腦梗死側(cè)皮層BDNF和TrkB蛋白表達(dá)顯著性增加，BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.25±0.04)和(0.38± 0.05)；TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.23±0.03)和(0.36±0.04)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.37、8.76，均P＜0.05)。與模型組比較，1.0和10.0 μg/kg Apelin.13處理組大鼠腦梗死側(cè)皮層BDNF和TrkB蛋白表達(dá)均顯著性增加，BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.38± 0.05)、(0.57±0.06)和(0.71±0.08)；TrkB蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.36±0.04)、(0.51±0.07)和(0.68±0.07)，呈濃度依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.72、10.48，均P＜0.05)。見圖3、4。

圖3 Apelin-13對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死側(cè)皮層BDNF蛋白表達(dá)的影響

圖4 Apelin-13對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死側(cè)皮層腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的受體TrkB蛋白表達(dá)的影響

3 討論

冠狀動(dòng)脈硬化導(dǎo)致的心肌梗死、腦卒中等缺血損傷所引的組織損傷是導(dǎo)致死亡的主要原因。研究表明缺血組織血液供應(yīng)恢復(fù)后，對(duì)組織造成損傷反而加重，這種損傷稱為缺血.再灌注損傷。缺血.再灌注損傷的機(jī)制十分復(fù)雜，其中過量自由基的產(chǎn)生是一個(gè)重要的原因［7］。

神經(jīng)營養(yǎng)因子是一種對(duì)神經(jīng)組織起特殊營養(yǎng)作用的蛋白質(zhì)或多肽分子。它們可調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生長分化，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的代謝和生理功能。BDNF是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，在腦內(nèi)發(fā)布最為廣泛的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子［8］。BDNF能調(diào)節(jié)交感、運(yùn)動(dòng)和感覺神經(jīng)元的分化和增殖，防止神經(jīng)細(xì)胞的退行性病變，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。BDNF保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制包括上調(diào)鈣結(jié)合蛋白表達(dá)，維持細(xì)胞內(nèi)正常Ca2+濃度，防止細(xì)胞內(nèi)鈣超載；抑制NMDA受體功能，抑制興奮性氨基酸毒性；增加超氧化物岐化酶和谷胱甘肽過氧化物酶等的水平，清除自由基，保護(hù)神經(jīng)元免受自由基的攻擊；抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等［9.10］。在缺血損傷早期，BDNF及其受體TrkB表達(dá)均上調(diào)。TrkB表達(dá)的上調(diào)，BDNF通過激活TrkB受體，防止神經(jīng)元發(fā)生變性、壞死，發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的作用［11］。

Apelin是在1998年由Tatemoto等通過反向藥理學(xué)方法從牛胃的分泌物中分離純化的一種小分子內(nèi)源性神經(jīng)肽，是G蛋白耦聯(lián)受體血管緊張素受體AT1相關(guān)的受體蛋白(putative receptor protein related to the angiotensinreceptor AT1，APJ)的天然配體［12］。Apelin/ APJ在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布，研究表明Apelin/APJ具有神經(jīng)保護(hù)作用，能對(duì)抗興奮性毒性損傷、氧化應(yīng)激損傷，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡等，是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子。研究發(fā)現(xiàn)海馬細(xì)胞中有APJ和Aelin的表達(dá)，Apelin.13能誘導(dǎo)Akt和Raf/ERK1/2的磷酸化，對(duì)抗N.甲基.D.門冬氨酸(N.methyl.D.aspartic acid，NMDA)對(duì)海馬神經(jīng)元的興奮性毒性損傷［13］。Apelin. 13可通過活化三磷酸肌醇IP3、PKC、MEK1/2和ERK1/2調(diào)節(jié)NMDA受體的NR2B亞單位的1480絲氨酸磷酸化，減少Ca2+積聚，以及降低鈣蛋白酶calpain的活化，保護(hù)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元抵抗谷氨酸的興奮性毒性損傷［14］。Apelin能抑制大腦皮質(zhì)細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生、線粒體膜電位去極化、細(xì)胞色素C的釋放以及caspase.3的激活，促進(jìn)Akt和ERKl/2的磷酸化，抑制細(xì)胞凋亡［15.16］。

Apelin前體肽在蛋白水解酶的作用下可分解為長度不同的多肽片段，主要有Apelin.36、Apelin.17、 Apelin.13和Apelin.12等片段。不同長度的Apelin多肽片段在體內(nèi)的分布以及與APJ的結(jié)合能力都不相同，在體內(nèi)外發(fā)揮的生理與藥理作用也不盡相同，其中Apelin.13在神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)水平較高，與神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Apelin.13上調(diào)了腦缺血再灌注損傷大鼠腦內(nèi)BDNF及其受體TrkB表達(dá)，提示Apelin.13可能通過增加神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。BDNF和TrkB表達(dá)調(diào)控的機(jī)制十分復(fù)雜，Apelin.13上調(diào)BDNF和TrkB表達(dá)涉及到哪些信號(hào)通路還有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究闡明Apelin.13對(duì)大鼠局灶性腦缺血.再灌注損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)BDNF及受體TrkB的表達(dá)有關(guān)。

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Effect of Apelin-13 on the expression of brain-derived neurotrophic factor and tyrosine kinase B in the focal cerebral isehemia-reperfused injury rats

LI Liang1,2LONG Jun1▲WANG Zhifei11.Department of Neurosurgery,the Third Xiangya Hospital of Central South University,Hu′nan Province,Changsha 410013,China;2.Department of Neurosurgery,the Central Hospital of Loudi City,Hu′nan Province,Loudi417000, China

Objective To observe the effects of Apelin.13 on the expressions of brain.derived neurotrophic factor（BDNF）and tyrosine kinase B（TrkB）in the focal cerebral isehemia.reperfused rats.Methods The rats models of focal middle cerebral artery ischemia.reperfusion were established by filament in SD male rats.The rats were randomly divided into the sham,model and Apelin.13（0.1,1.0 and 10.0 μg/kg）treatment group.After 2 h ischemia,the focal middle cerebral artery was followed by 24 h reperfusion in rats with isehemia.reperfused injury.Apelin.13 was administrated by the intracerebroventricular injection 15 minutes before reperfusion.The mRNA and protein expressions of BDNF and TrkB in cerebral cortex were measured by real.time PCR and Western blot respectively.Results Compared with the sham group,the mRNA and protein expressions of BDNF and TrkB in cerebral cortex were significantly increased in the models of ischemia.reperfusion group,the relative mRNA expressions of BDNF were（100.00±0.00）% and（138.54±7.63）%respectively;the relative mRNA expressions of TrkB were（100.00±0.00）%and（121.74±8.73）% respectively.The relative protein expressions of BDNF were（0.25±0.04）and（0.38±0.05）respectively;the relative protein expressions of TrkB were（0.23±0.03）and（0.36±0.04）respectively,with significant differences（t=9.45,10.79, 10.37,8.76,all P＜0.05）.Compared with the models of ischemia.reperfusion group,the mRNA and protein expressions of BDNF and TrkB in cerebral cortex were significantly increased in the 1.0 and 10.0 μg/kg Apelin.13 treatment group,the relative mRNA expressions of BDNF were（138.54±7.63）%,（158.69±11.37）%and（189.31±13.74）%respectively;the relative mRNA expressions of TrkB were（121.74±8.73）%,（149.25±9.46）%and（166.41±13.74）%respectively.The relative protein expressions of BDNF were（0.38±0.05）,（0.57±0.06）and（0.71±0.08）respectively;the relative protein expressions of TrkB were（0.36±0.04）,（0.51± 0.07）and（0.68±0.07）respectively,with significant differences（F=8.84,F=11.12,F=9.72,F=10.48,all P＜0.05）. Conclusion Apelin.13 protects the ischemia.reperfusion injury,the mechanism of which may be related with up.regulation of BDNF and TrkB.

Apelin.13;Brain ischemia.reperfusion injury;Brain.derived neurotrophic factor;Tyrosine kinase B

R743.33

A

1673-7210（2014）02（a）-0021-05

2013.11.02本文編輯：衛(wèi)軻)

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