脂肪干細(xì)胞的分離提取、鑒定及與脂肪顆粒的混合移植研究

袁志堅 何文涓 周紅 蔣美玲

1.無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇無錫214028；2.中國藥科大學(xué)，江蘇南京210009

脂肪干細(xì)胞的分離提取、鑒定及與脂肪顆粒的混合移植研究

袁志堅1何文涓1周紅1蔣美玲2

1.無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇無錫214028；2.中國藥科大學(xué)，江蘇南京210009

目的分離提取脂肪干細(xì)胞(ADSCs)，對其進(jìn)行成脂、成骨的鑒定，并與脂肪顆?；旌弦浦?，觀察移植后的脂肪組織的存活情況。方法取大鼠腹股溝脂肪，磷酸鹽緩沖液清洗，0.1%Ⅰ型膠原酶37℃消化1 h，離心，取沉淀，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，取第3代ADSCs用于成脂、成骨鑒定；另取第3代ADSCs用于移植，分為兩組：ADSCs(密度為5×107/mL)0.9 mL+脂肪顆粒0.6 mL組、脂肪顆粒1.5 mL組，分別移植于大鼠背部兩側(cè)，共移植24只大鼠，分別于2周、1、3個月時脫頸椎處死8只大鼠，再取出背部脂肪組織。結(jié)果大鼠ADSCs成脂、成骨誘導(dǎo)后，經(jīng)油紅O、茜素紅染色呈陽性，移植2周、1個月時，兩組取出的脂肪組織的體積變化不大；但移植3個月后，取背部脂肪組織，稱重：脂肪顆粒1.5 mL組平均重量為(0.4551±0.0024)g，而ADSCs(密度為5×107/mL)0.9 mL+脂肪顆粒0.6 mL組的平均重量為(0.7798±0.0033)g，兩組脂肪組織的重量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論原代分離、培養(yǎng)的ADSCs生長狀況良好，具有向成脂、成骨分化的能力，與脂肪顆粒混合移植后組織的存活率高，并能夠改善脂肪顆粒單獨移植時的液化吸收情況。

脂肪干細(xì)胞；成脂誘導(dǎo)；成骨誘導(dǎo)；移植

脂肪組織的獲得快捷、方便，2001年，Zuk等［1］從脂肪組織中分離到了一種具有多向分化能力的干細(xì)胞，即脂肪來源干細(xì)胞(ADSCs)，有分化為脂肪、成骨、軟骨、成肌等能力［2.3］，能夠在體外穩(wěn)定增殖，衰亡率低，少量的組織就可獲得大量干細(xì)胞，適合大規(guī)模培養(yǎng)，是近年來的研究熱點之一。單純脂肪移植很容易出現(xiàn)組織液化吸收、形成纖維囊等問題，這些問題一直沒有得到根本解決。本研究引入的ADSCs，具有自我復(fù)制和多向分化的能力，能夠分泌多種生長因子及細(xì)胞因子，所以將ADSCs和脂肪顆粒混合移植［4］，會大大提高脂肪組織移植的存活率，降低液化、纖維化、壞死等不良反應(yīng)［5.6］，本文就ADSCs輔助脂肪移植進(jìn)行研究，旨在探索ADSCs在脂肪移植中的良好作用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑

HH.2恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；XSP.3CA生物顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器)。胎牛血清(Gibco，北美)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；0.25%胰蛋白酶. EDTA(Gibco，美國)；Ⅰ型膠原酶(Sigma，美國)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(KCl 0.20 g，NaCl 8.00 g，KH2PO40.20 g，Na2HPO4·12H2O 3.49 g，加水至1000 mL，pH 7.4)；成脂、成骨誘導(dǎo)液和茜素紅染液及油紅O(賽業(yè)生物科技有限公司)。

1.2 動物

12～14周齡SD雄性大鼠，體質(zhì)量200～220 g，由中國藥科大學(xué)動物實驗中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 ADSCs的提取、培養(yǎng)和傳代

取大鼠1只，脫頸椎處死，在75%乙醇中浸泡10min后，將大鼠置于超凈臺上，剪開腹部，取出腹股溝脂肪，用PBS沖洗3遍，去除肉眼可見的血管，再剪至1 mm3大小的脂肪碎塊，加入2～3倍體積的0.1%Ⅰ型膠原酶溶液，37℃恒溫水浴消化1 h，然后，加入等體積的含10%血清的DMEM培養(yǎng)基中和膠原酶，1500 r/min離心10 min，棄去上層脂肪，沉淀加含10%血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，1500 r/min離心10 min，沉淀加含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，分于2個培養(yǎng)瓶中，放于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每3天換1次液，當(dāng)細(xì)胞長滿80%～90%時，1∶2傳代。

2.2 ADSCs的凍存與復(fù)蘇

0.25 %胰蛋白酶.EDTA溶液消化細(xì)胞，將ADSCs懸液收集到離心管中，1000 r/min離心10 min，棄上清液，加入凍存液［DMEM培養(yǎng)基.血清.二甲基亞砜(7∶2∶1)］調(diào)整ADSCs密度在5×106/mL左右，將含ADSCs的凍存液分至凍存管中，每管1 mL，按下列順序程序降溫：放置4℃冰箱30 min，.20℃冰箱1 h，再于液氮罐中保存。ADSCs復(fù)蘇時，將ADSCs從液氮中取出，迅速置37℃的溫水中晃動，使凍存管中的ADSCs凍存液在1 min內(nèi)融化，將ADSCs懸液吸到離心管中，1000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀加含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，吹打均勻，再轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

2.3 ADSCs的成脂、成骨鑒定

將第3代細(xì)胞消化接種于6孔板中，用于成脂、成骨實驗。

2.3.1 成脂鑒定當(dāng)細(xì)胞匯合100%時，換成成脂誘導(dǎo)液A，3 d后換成維持培養(yǎng)液B，經(jīng)過成脂誘導(dǎo)/維持3次循環(huán)后，用維持培養(yǎng)液再培養(yǎng)1周，進(jìn)行油紅O染色，吸去誘導(dǎo)液，PBS洗3次，加入10%中性甲醛溶液，固定30 min，吸去固定液，加入油紅O，37℃染色30 min，再加入PBS洗3次，然后在生物顯微鏡下觀察。

2.3.2 成骨誘導(dǎo)當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)75%時，換成成骨誘導(dǎo)液，每3天換液1次，誘導(dǎo)2周后，吸去成骨誘導(dǎo)液，PBS洗3次，加10%中性甲醛溶液固定30 min，吸去固定液，加入茜素紅染5 min，然后在生物顯微鏡下觀察。

2.4 ADSCs的移植

第3代ADSCs用0.25%胰蛋白酶.EDTA溶液消化，1500 r/min離心10 min，沉淀用于移植。另取一些脂肪組織剪成1 mm3的脂肪顆粒，分為2組：ADSCs (密度為5×107/mL)0.9 mL+脂肪顆粒0.6 mL組，脂肪顆粒1.5 mL組，分別移植至大鼠背部皮下兩側(cè)，自身對照，并且每3天觀察背部脂肪的生長情況，共24只大鼠，術(shù)后2周、1、3個月分別處死8只大鼠，將其背部脂肪取出，3個月時，稱量取出的脂肪組織。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用單因素方差分析，行t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.6 結(jié)果

2.6.1 ADSCs的培養(yǎng)及傳代細(xì)胞原代提取接種后，懸浮于含10%血清的DMEM培養(yǎng)基中，呈圓形，24 h后細(xì)胞貼壁，72 h后，細(xì)胞伸展開來，呈短梭形或多角形，見圖1，7～8 d后，細(xì)胞長滿，呈長梭形漩渦樣生長，見圖2。

2.6.2 ADSCs復(fù)蘇后的生長情況ADSCs凍存后復(fù)蘇，與未凍存前的細(xì)胞形態(tài)未見明顯的區(qū)別，都呈長梭形生長，見圖3。

2.6.3 ADSCs的成脂、成骨鑒定成脂誘導(dǎo)：成脂誘導(dǎo)后，細(xì)胞體積變大，胞內(nèi)有脂滴產(chǎn)生，油紅O染成紅色，見圖4。成骨誘導(dǎo)：成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞變成不規(guī)則形狀或多角形，細(xì)胞體積略微增大，茜素紅染成紅色，可以見礦化結(jié)節(jié)，見圖5。

2.6.4 ADSCs的移植情況移植后的大鼠，正常飲水，每3天肉眼觀察1次脂肪體積的變化，在2周、1、3個月這三個時期分別取得大鼠背部脂肪組織，剪開大鼠背部皮膚展開于兩側(cè)，能明顯看見皮下移植的脂肪組織，見圖6，前2個月脂肪體積有所減小，最后1個月脂肪體積變化不大，結(jié)果見圖7(A1、A2、B1、B2、C1、C2)?？梢?，3個月時ADSCs(密度為5×107/mL)0.9 mL+脂肪顆粒0.6 mL組脂肪組織體積明顯大于脂肪顆粒1.5 mL組，見表1。

3 討論

種子細(xì)胞在組織工程中起到核心的作用，同時它也是組織工程的研究基礎(chǔ)，組織工程的基本原理是將體外擴(kuò)增的組織吸附在支架上(生物相容性好，可被機(jī)體吸收)，再將此復(fù)合物移植入機(jī)體的損傷部位，形成新的器官或組織，達(dá)到修復(fù)功能，然而，許多組織細(xì)胞的擴(kuò)增能力有限，又無法通過少量組織擴(kuò)增構(gòu)建大塊組織，所以，成體干細(xì)胞逐漸進(jìn)入種子細(xì)胞的研究領(lǐng)域。ADSCs來源豐富、成本低、應(yīng)用范圍廣泛，可以取材于臨床治療后的副產(chǎn)品且擴(kuò)增分化能力強(qiáng)，用于自體移植無免疫排斥反應(yīng)，易于被患者接受，在美容外科方面具有很好的應(yīng)用前景［7.9］，如皮下組織缺損的填充、瘢痕凹陷的填充、皺紋的填充、乳腺癌手術(shù)后乳腺的重建等，另外，還發(fā)現(xiàn)其對一些心血管疾病和肝損傷疾病等有治療作用［10.12］。

圖1 短梭形或多角形ADSCs（100×）

圖2 長梭形漩渦樣ADSCs（100×）

圖3 復(fù)蘇前后的ADSCs（200×）

圖4 ADSCs成脂分化（油紅O染色，200×）

圖5 ADSCs成骨分化（100×）

圖6 移植后可見的大鼠背部皮下的脂肪組織

本文圍繞ADSCs的原代提取、培養(yǎng)、生物學(xué)特性及其定向分化潛能展開研究，而ADSCs原代提取時所獲得的是一種混雜的細(xì)胞群，而能否獲得單一均質(zhì)的ADSCs將直接影響對ADSCs生物性狀的研究以及之后的ADSCs的移植，本實驗中是通過3次傳代，篩去一些貼壁能力或傳代能力差的雜細(xì)胞來優(yōu)化選擇ADSCs，第三代的ADSCs將用于與脂肪顆?；旌弦浦玻筮M(jìn)一步觀察移植后的脂肪組織生長情況，研究發(fā)現(xiàn)ADSCs(密度為5×107/mL)0.9 mL+脂肪顆粒0.6 mL組的脂肪組織的體積明顯大于脂肪顆粒1.5 mL組(P＜0.05)，表明ADSCs能夠促進(jìn)脂肪組織的存活，改善單純移植脂肪顆粒的壞死、纖維化及液化現(xiàn)象。

圖7 不同時段大鼠背部脂肪組織情況

表1 ADSCs加脂肪顆粒以及單獨的脂肪顆粒移植3個月后脂肪組織的存活量（±s，n=8）

表1 ADSCs加脂肪顆粒以及單獨的脂肪顆粒移植3個月后脂肪組織的存活量（±s，n=8）

注：與脂肪顆粒1.5 mL組比較，*P＜0.05

組別存活量( g )脂肪顆粒1 . 5 m L組A D S C s (密度為5 × 1 07/ m L ) 0 . 9 m L +脂肪顆粒0 . 6 m L組0 . 4 5 5 1 ± 0 . 0 0 2 4 0 . 7 7 9 8 ± 0 . 0 0 3 3*

上述實驗結(jié)果說明在脂肪顆粒中添加ADSCs能夠明顯減少脂肪顆粒移植時的液化現(xiàn)象，改善長期效果。首先，ADSCs可以分化為脂肪細(xì)胞，補(bǔ)充壞死的脂肪細(xì)胞的數(shù)量；其次，ADSCs具有多向分化能力可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，再通過旁分泌促進(jìn)血管的新生，從而促進(jìn)血供的恢復(fù)；此外，ADSCs還可以通過旁分泌作用調(diào)整組織的局部微環(huán)境，減少細(xì)胞受到的損傷，提高移植后脂肪組織的存活率。雖然如此，但是移植中ADSCs與脂肪顆粒的最佳比例及它們之間的作用和轉(zhuǎn)歸還有待進(jìn)一步的研究。

本研究初步解決了脂肪移植的一些問題，筆者將繼續(xù)深入研究，采用熒光標(biāo)記ADSCs后，再與脂肪顆粒混合移植，移植后取出脂肪組織，在熒光顯微鏡下觀察定位標(biāo)記的ADSCs，用RT.PCR檢測移植物過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的表達(dá)。ADSCs的成脂分化過程復(fù)雜，受各種miRNA的影響［13.14］，而miRNA是一種很重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，因此，可以通過直接或者間接的修飾影響ADSCs脂向分化的轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而更好地調(diào)控ADSCs分化為成熟的脂肪細(xì)胞，進(jìn)一步闡明ADSCs成脂分化的分子調(diào)控機(jī)制，從而更好地提高細(xì)胞輔助脂肪組織移植的成活率［15］。

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Isolation,culture and transplantation of rat adipose-derived stem cells

YUAN Zhijian1HE Wenjuan1ZHOU Hong1JIANG Meiling21.Wuxi Higher Health Vocational School,Jiangsu Province,Wuxi214028,China;2.China Pharmaceutical University, Jiangsu Province,Nanjing210009,China

Objective To isolate and culture the rat adipose.derived stem cells（ADSCs）and to identificate its multipotent differentiation ability and to observe the survival of transplantation of ADSCs with adipose compared with adipose in the back of the rats.Methods Adipose tissue were obtained from inguinal region and washed in PBS,then digested with 0.1%collagenase typeⅠat 37℃for 1 h followed by centrifugation and ADSCs pellet was resuspended in DMEM with 10%fetal bovine serum（FBS）and seeded in flasks,cells at passages 3 were used for adipogenic differentiation and osteogenic differentiation,both sides of twenty.four rats were received subcutaneously 5×107/mL ADSCs resuspended in 0.9 mL of DMEM medium+0.6 mL of adipose and 1.5 mL of adipose,took out the adipose tissue of eight rats after two weeks,one month and three months respectively.Results ADSCs stained positively for oil red.O and alizarin red,two weeks and one month later,the weight of adipose had no difference with each other,however,after three months,the average weight of 1.5 mL of adipose group and the 5×107/mL ADSCs resuspended in 0.9 mL of DMEM medium+0.6 mL of adipose group were（0.4551±0.0024）g and（0.7798±0.0033）g respectively,thus,there were significant differences between the two groups（P＜0.05）.Conclusion ADSCs is in good condition and has adipogenic and osteogenic differentiation ability,ADSCs with adipose can improve the survival and the liquefied of the adipose after transplantation when compared with adipose alone.

Adipose.derived stem cells;Adipogenic induction;Osteogenic induction;Transplantation

R329

A

1673-7210（2014）02（a）-0009-05

2013.10.31本文編輯：衛(wèi)軻)

江蘇省衛(wèi)生廳科技項目(編號J201117)。

袁志堅(1962.1.)，男，江西贛州人，副教授，副主任中醫(yī)師；研究方向：中醫(yī)藥。