小葉板藍根抗病毒及抑菌效果比較研究

謝曉亮，尹曉琳，溫春秀，劉靈娣

（1.河北省農(nóng)林科學院藥用植物研究中心，河北 石家莊 050051；2.河北醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學學院，河北 石家莊 050071）

小葉板藍根抗病毒及抑菌效果比較研究

謝曉亮1*，尹曉琳2，溫春秀1，劉靈娣1

（1.河北省農(nóng)林科學院藥用植物研究中心，河北 石家莊 050051；2.河北醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學學院，河北 石家莊 050071）

目的：明確不同板藍根種質(zhì)藥效學差別，為板藍根優(yōu)良品種選育、生產(chǎn)栽培提供依據(jù)。方法：通過板藍根不同種質(zhì)水提液細胞毒試驗、抗病毒試驗、抑菌試驗，進行抗病毒、抑菌效果比較。結(jié)果：小葉板藍根對細胞的毒性作用、抗病毒作用以及對金黃色葡萄球菌的抑菌作用均明顯優(yōu)于大葉板藍根，從藥效學監(jiān)督看小葉板藍根可以作為板藍根栽培的優(yōu)良品種進行推廣應(yīng)用。

板藍根；種質(zhì)；抗病毒；抑菌；比較研究

板藍根是我國傳統(tǒng)常用中藥材， 《中國藥典》2010年版記載板藍根為十字花科植物菘藍Isatis indigoticaFort.的干燥根，別名北板藍、大青根等，其葉為大青葉。板藍根味苦，性寒，歸心、胃經(jīng)，具有清熱解毒，涼血利咽的功能［1］，具有抗菌、抗病毒、抗內(nèi)毒素、抗炎、增強免疫功能［2-3］、抗乙型肝炎［4］等多種作用。近年來的研究證實，板藍根內(nèi)含有多種抗病毒成分，對感冒病毒、腮腺炎病毒、肝炎病毒及流腦病毒等有較強的抑制和殺滅作用［5-8］，主治流行性感冒、流行性腮腺炎、乙型腦炎、傳染性肝炎、咽喉腫痛等癥［9-11］。它是板藍根沖劑、板藍根針劑、三九感冒靈、康必得等感冒和抗病毒類中成藥的主要原料。在臨床上常用板藍根單味或與貫眾、金銀花、野菊花等合用以治療感冒和流感等傳染病及熱性病。然而，板藍根種質(zhì)混雜，栽培類型較多。目前，安國等地大田生產(chǎn)的板藍根有明顯區(qū)別的兩種類型，一是小葉菘藍，習稱北板藍根（小葉板藍根）；一是廣泛栽培的大葉菘藍（大葉板藍根，普通栽培品）。本文針對目前安國等地種植生產(chǎn)的小葉板藍根和大葉板藍根進行了抑菌及抗病毒效果方面的比較研究，明確其藥效學差別，為生產(chǎn)栽培提供依據(jù)。

1 材料

小葉板藍根和對照大葉板藍根均采自安國霍莊種植基地。取1年生秋季采收的根條，切成1 cm左右長的小塊于60℃烘箱中過夜烘干至衡重，然后將其粉碎，取其粉末分別裝袋編號，置干燥器中備用。

稱取制備好的板藍根粉末10 g，加蒸餾水80mL于100 mL燒杯中煮至沸騰，并繼續(xù)煮沸水提15 min，室溫下冷卻后于 2 000 r·min－1下離心10 min，取上清液用5 mol·L－1NaOH水溶液調(diào)pH值至7.2，于100 mL容量瓶中定容得板藍根水提制劑原液置4℃冰箱中備用。

病毒唑（上海通用藥業(yè)股份有限公司第三公司）；1640培養(yǎng)液（GIBCO公司）；FBS（胎牛血清，杭州四季青生物工程有限公司）；慶大霉素（Sigma公司）；Hela細胞（中國科學院上海細胞庫）；金黃色葡萄球菌ATCC26001（北京菌種保存中心）；MH血液瓊脂培養(yǎng)基（自配）；呼吸道合胞病毒（RSV）（中國軍事醫(yī)學科學院）。

2 方法

2.1 藥液配制

細胞維持液（2%FBS1640培養(yǎng)液）：98 mL 1640培養(yǎng)液、2mL FBS（胎牛血清）、0.125 mL慶大霉素（4萬 U·mL－1），混勻過濾除菌備用。

病毒唑溶液配制：取病毒唑溶液（100 mg·mL－1）0.6 mL，加入0.6mL，混勻后用細胞維持液進行倍比稀釋，稀釋的終濃度分別為 1／4，1／8，1／16，1／32，1／64，1／128，1／256，1／512，1／1 024（即配即用）。

各種板藍根制劑的配制：取定容后的板藍根水提制劑原液0.6 mL，加入0.6 mL細胞維持液進行倍比稀釋，得到終濃度為原液濃度的1／4，1／8，1／16，1／32，1／64，1／128，1／256，1／512，1／1 024的板藍根水提制劑稀釋液（即配即用）。

2.2 細胞毒試驗

取出凍存的Hela細胞，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 min內(nèi)全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入無菌細胞培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。每2 d擴增1次細胞，當細胞培養(yǎng)足量時，將細胞稀釋成1×106個·mL－1，分裝至 24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，1 mL／孔，同樣條件過夜培養(yǎng)。

將生長良好的24孔單層細胞培養(yǎng)板用無血清培養(yǎng)液洗滌1次細胞，然后加入各濃度板藍根水提制劑稀釋液及病毒唑，1 mL／孔，每個稀釋度用兩個孔，留細胞對照，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，通過顯微鏡下觀察有無細胞病變來確定不同藥物的細胞毒性。

2.3 抗病毒試驗

將擴增好的RSV病毒液進行10倍系列稀釋，取10－3和10－4兩個濃度的病毒稀釋液接種于新的生長良好的24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)的單層Hela細胞中，每孔0.1 mL，每個稀釋度接種2孔，37℃、5%CO2下孵育1 h，棄病毒液。

將2種板藍根的水提制劑原液和病毒唑溶液（100 mg·mL－1）進行倍比稀釋。取 1／64～1／1 024的5個稀釋度進行病毒抑制試驗，其中小葉板藍根和大葉板藍根從1／32開始，病毒唑從1／128開始稀釋。將以上幾種藥液分別加入不同稀釋度病毒吸附過的單層Hela細胞中，每個稀釋度各加2孔，同時設(shè)病毒對照、細胞對照，置37℃、5%CO2下培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察有無細胞病變。

2.4 抑菌試驗

將金黃色葡萄球菌ATCC26001接種于M-H血液瓊脂平板中，37℃普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。

將金黃色葡萄球菌配制成105CFU·mL－1，接種于含藥 1／2，1／4，1／8，1／16，1／32，1／64，1／128，1／256，1／512的液體 M-H培養(yǎng)基中，50μL／管，37℃下培養(yǎng)24 h，并設(shè)正常對照。

取培養(yǎng)后的各稀釋度菌液做百倍稀釋，得10－2，10－4，10－6，10－85個稀釋度，再取百倍稀釋的各稀釋度菌液50μL，分別涂布在不含藥液的M-H固體培養(yǎng)板上，培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果。

菌落計數(shù)：菌落計數(shù)后，按 “細菌濃度＝菌落數(shù)／0.05 mL×稀釋倍數(shù)”折算出各管細菌的濃度。

3 結(jié)果與分析

3.1 小葉板藍根對細胞的毒性

24孔單層細胞培養(yǎng)板上生長良好的細胞經(jīng)無血清培養(yǎng)液洗滌1次并加入各濃度板藍根水提制劑稀釋液及病毒唑后，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，然后在顯微鏡下觀察有無細胞病變發(fā)生。未發(fā)生病變的細胞應(yīng)為梭形，發(fā)生病變的細胞變?yōu)閳A形或多形態(tài)性。結(jié)果以出現(xiàn)明顯病變的稀釋度（＋）為最高稀釋度，見表1。由表1可以看出，對細胞產(chǎn)生毒性作用的最高稀釋度：小葉板藍根為1／32，大葉板藍根為1／16，藥物陽性對照（病毒唑）為1／64。顯然各種板藍根的細胞毒性與病毒唑相比均較弱，其中小葉板藍根對細胞的毒性作用強于大葉板藍根。

表1 小葉板藍根的細胞毒試驗比較

3.2 小葉板藍根的抗病毒效果

將小葉板藍根和對照大葉板藍根的水提制劑原液和病毒唑溶液（100 mg·mL－1）進行2倍稀釋。取1／64～1／1 024的5個稀釋度進行病毒抑制試驗，其中大葉板藍根從1／32開始，病毒唑從1／128開始稀釋。將以上幾種藥液分別加入10－3和10－4兩種不同稀釋度的病毒吸附過的單層Hela細胞中，同病毒對照和細胞對照一起，在37℃、5%CO2下培養(yǎng)48h后，顯微鏡下觀察細胞發(fā)生病變的情況，確定細胞是否發(fā)生病變，病變的標準同前，觀察結(jié)果見表2和表3。從中不難看出，當病毒稀釋度為10－4時，藥物抗病毒作用的最高稀釋度：小葉板藍根為1／512，大葉板藍根為1／128，陽性對照（病毒唑）為1／256，可見在此病毒稀釋度下，小葉板藍根的抗病毒效果是大葉板藍根的4倍；當病毒稀釋度為10－3時，藥物抗病毒作用的最高稀釋度：小葉板藍根為1／256，大葉板藍根為1／32，陽性對照（病毒唑）為1／128?？梢姡诖瞬《鞠♂尪认?，小葉板藍根的抗病毒效果是大葉板藍根的8倍，而且同樣也是病毒唑的2倍。兩種病毒稀釋度的結(jié)果均表明，小葉板藍根的抗病毒作用效果明顯比大葉板藍根強，且均強于病毒唑的抗病毒效果。

表2 小葉板藍根抗病毒作用比較（RSV 10－4）

表3 小葉板藍根抗病毒作用比較（RSV 10－3）

3.3 小葉板藍根對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

取培養(yǎng)后的各稀釋度金黃色葡萄球菌菌液做百倍稀釋，得 10－2，10－4，10－6，10－84個稀釋度，再取百倍稀釋的各稀釋度菌液50μL，分別涂布在不含藥液的M-H固體培養(yǎng)板上，經(jīng)24 h培養(yǎng)后觀察結(jié)果，并進行菌落計數(shù)，并計算出最終細菌濃度，見表4。經(jīng)統(tǒng)計學分析，對金黃色葡萄球菌的抗菌作用，小葉板藍根有 4個稀釋度（1／16，1／8，1／4和1／2）表現(xiàn)明顯的抑菌效果，而大葉板藍根僅有3個稀釋度（1／8，1／4和1／2）有明顯抑菌效果。小葉板藍根在稀釋度為1／16時即表現(xiàn)抑菌作用，1／8濃度時作用變強，1／4和1／2濃度時抑菌作用同大葉板藍根相比最為明顯，特別是1／4稀釋度下，小葉板藍根的抑菌效果是大葉板藍根的106，即100萬倍。由此可見對金黃色葡萄球菌的抗菌作用，小葉板藍根要明顯強于大葉板藍根。

表4 小葉板藍根對金黃色葡萄球菌的抑菌作用比較

4 討論

試驗通過對小葉板藍根與普通栽培種大葉板藍根的細胞毒、抗病毒、抑菌效果比較研究表明，小葉板藍根與大葉板藍根的抗菌、抗病毒活性不同，這與劉云海等［10］、喬傳卓等［11］的研究報道一致。本試驗結(jié)果表明小葉板藍根對細胞的毒性作用明顯強于大葉板藍根；小葉板藍根的抗病毒作用效果明顯比大葉板藍根強；對金黃色葡萄球菌的抗菌作用，小葉板藍根強于大葉板藍根。從藥效學角度看，小葉板藍根可作為優(yōu)良板藍根種質(zhì)進行推廣應(yīng)用。

表2和表3的抗病毒作用結(jié)果顯示，小葉板藍根的水提液與大葉板藍根的水提液在兩個病毒稀釋度下的抗病毒表現(xiàn)趨勢一致，當病毒稀釋度為10－4時，藥物抗病毒作用的最高稀釋度：小葉板藍根為1／512，大葉板藍根為1／128，在此病毒稀釋度下，小葉板藍根的抗病毒效果是大葉板藍根的4倍；當病毒稀釋度為10－3時，藥物抗病毒作用的最高稀釋度：小葉板藍根為1／256，大葉板藍根為1／32，在此病毒稀釋度下，小葉板藍根的抗病毒效果是大葉板藍根的8倍，也就是說，投入等量的藥材量，小葉板藍根的藥效是大葉藥效的4倍以上。

表4顯示，小葉板藍根對金黃色葡萄球菌的抗菌作用，其水提液稀釋度由1／8變?yōu)?／16時，抗菌效果下降僅10倍左右，而由1／4變?yōu)?／8時則下降了近106即100萬倍。而接下來由1／2變?yōu)?／4時抗菌效果則又僅僅下降了不到100倍。我們認為，水提液稀釋度由1／2變?yōu)?／4時抗菌效果下降幅度的大幅度減小與試驗溶液中金黃色葡萄球菌的濃度有關(guān)，并非是抗菌效果下降的幅度真的變小了，也就是說這種結(jié)果出現(xiàn)的真正原因可能是某種因素在起作用，本研究沒有進行進一步的探討。

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A Com parative Study on Effects of Antivirus and Bacteriostasis of Different Germ plasms of Isatidis Radix

Xie Xiaoliang1，Yin Xiaolin2，Wen Chunxiu1，Liu Lingdi1
（1.Research Center on Medicinal Plants Hebei Agriculture and Forestry Academy，Shijiazhuang Hebei050051，China；2.College of Basic Medicine HebeiMedical University，Shijiazhuang Hebei050071，China）

Objective：The pharmacodynamics differences in different germplasms of isatidis radix were studied to provide basis for the field production.Methods：The water extracts from the germplasms of isatidis radix were used in cytotoxicity test，antivirus and antibacterial tests.Results：It was found that toxicity to cells，antivirus and bacteriostasis effects toward golden staphylococci of small leaf isatidis radix were obviously stronger than those of the big leaf one，the small leaf one should be used in production as an improved variety of isatidis radix.

Isatidis radix；Germplasm；Antivirus；Bacteriostasis；Comparative study

*謝曉亮，E-mail：xie7652137＠126.com

2010-03-16）