轉(zhuǎn)nanog基因抑制帕金森病大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)

陳施艷，張志堅(jiān)，劉麗金，林 紅，吳秀麗，王 偉，王志強(qiáng)

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建福州350005)

帕金森病(parkinson's disease，PD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性死亡為主要病理特點(diǎn)。值得注意的是，帕金森病患者尸檢發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)致密部除多巴胺能神經(jīng)元缺失外，還伴隨大量的膠質(zhì)細(xì)胞增殖，小膠質(zhì)細(xì)胞激活后釋放多種炎性因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、IL-1β、核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)和反應(yīng)性氧自由基等，導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元損傷。近年證據(jù)表明，炎性反應(yīng)參與了帕金森病多巴胺能神經(jīng)元的變性過程，成為目前研究熱點(diǎn)［1-3］。有學(xué)者在胚胎干細(xì)胞分化研究中發(fā)現(xiàn)，Nanog 可通過與NF-κB 蛋白結(jié)合抑制NF-κB 轉(zhuǎn)錄［4］。前期工作已成功構(gòu)建攜帶nanog 基因的慢病毒載體，并證實(shí)其能抑制小鼠骨髓間質(zhì)細(xì)胞中NF-κB 的表達(dá)［5］，抑制脂多糖誘導(dǎo)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB 的轉(zhuǎn)錄［6］，同時(shí)證實(shí)了帕金森病大鼠腦內(nèi)炎性因子升高［7］。轉(zhuǎn)nanog 基因?qū)ε两鹕“l(fā)病中炎性反應(yīng)是否產(chǎn)生影響?本實(shí)驗(yàn)在觀察帕金森病大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞和炎性因子變化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀測(cè)Nanog 對(duì)多巴胺能神經(jīng)元存活、小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及TNF-α 表達(dá)的影響，為帕金森病的抗感染治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組與帕金森病大鼠模型的制備:清潔級(jí)雄性SD 大鼠32 只，體質(zhì)量250～300 g(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證:SCXK滬，2012-0001)，隨機(jī)分為對(duì)照組、6-OHDA + PBS組、6-OHDA + 慢病毒空載體PNL 組和6-OHDA +nanog 組(每組n =8)。采用雙靶點(diǎn)注射神經(jīng)毒素6-羥多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)誘導(dǎo)方法制備帕金森病大鼠模型［8］。采用單側(cè)雙點(diǎn)立體定向注射法，先將2.5 μL 濃度為2 g/L 的6-OHDA 注射到大鼠左側(cè)紋狀體內(nèi);再將5 μL 攜帶nanog 基因的慢病毒載體、慢病毒空載體、PBS 分別注射到6-OHDA+ nanog 組、6-OHDA + PNL 組與6-OHDA +PBS 組大鼠左側(cè)紋狀體內(nèi)。因預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示動(dòng)物在注射6-OHDA 后近14 d 才有明顯旋轉(zhuǎn)行為改變，故選擇在注射后14 d 這個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)估以及腦組織取材進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的組織化學(xué)檢測(cè)。所有動(dòng)物均在室溫22～25 ℃飼養(yǎng)，光線12 h 交替，自由飲水、進(jìn)食，在實(shí)驗(yàn)前經(jīng)反復(fù)檢測(cè)無異常旋轉(zhuǎn)行為。

1.1.2 主要試劑:慢病毒載體質(zhì)粒PNL-IRES.EGFP，包裝質(zhì)粒HELPER，包膜質(zhì)粒VSVG 以及293T 細(xì)胞均由美國杜蘭大學(xué)陳一平教授惠贈(zèng)。Top10 菌(福建醫(yī)科大學(xué)林建銀教授惠贈(zèng))。其他主要試劑:反轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Sal Ⅰ(Promega公司)，高保真Pfu ultra DNA 聚合酶(Strategen 公司)，Trizol 以及脂質(zhì)體lipofectamin 2000(Invitrogen公司)，polybrene(Sigma 公司)，質(zhì)粒抽提試劑盒(Qiagen 公司)，DNA 凝膠回收試劑盒(上海博亞生物公司)。胎牛血清(PAA)、胰蛋白酶、6-OHDA、阿樸嗎啡(Sigma 公司)，兔抗大鼠酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)多克隆抗體(武漢博士德公司)，辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG 多聚體、DAB(北京中衫金橋公司)，羊抗大鼠IBA1 多克隆抗體、兔抗大鼠TNF-α 多克隆抗體(Abcam 公司)，驢抗羊IgGTRITC、驢抗兔IgG-TRITC(Jackson 公司)。

1.2 方法

1.2.1 攜帶nanog 基因慢病毒載體構(gòu)建、鑒定:慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定已在前期相關(guān)研究中完成，所獲病毒載體滴度為(6.1～6.8)×106IU/mL。該慢病毒載體質(zhì)?；蛐蛄兄械哪康幕蚺cEgfp 基因之間以IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))相連接，使二者轉(zhuǎn)錄出一條單順反子，同時(shí)翻譯出兩種蛋白，從而通過觀察EGFP 的表達(dá)直觀地觀測(cè)目的基因的表達(dá)。構(gòu)建的載體的鑒定參照文獻(xiàn)［5-6］。

1.2.2 行為學(xué)的檢測(cè):于手術(shù)后14 d 經(jīng)腹腔注射0.5 mg/kg 阿樸嗎啡(apomorphine，APO)，誘發(fā)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，注射后5 min 觀察各組大鼠旋轉(zhuǎn)行為學(xué)改變，計(jì)算大鼠每分鐘的旋轉(zhuǎn)次數(shù)。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)以動(dòng)物向注射對(duì)側(cè)不改變方向旋轉(zhuǎn)360°計(jì)為旋轉(zhuǎn)1次，每只動(dòng)物每次記錄30 min 為限，若每次大鼠均恒定地轉(zhuǎn)向右側(cè)，平均≥7 轉(zhuǎn)/min 視為成功模型。

1.2.3 TH 免疫組織化學(xué)檢測(cè):各亞組動(dòng)物分別在注射后第14 天，用10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，經(jīng)左心室注入肝素0.9%氯化鈉注射液150 mL 及4%多聚甲醛溶液200 mL 進(jìn)行灌注固定后，斷頭取腦置固定液中過夜。于中腦區(qū)行冰凍切片連續(xù)冠狀切片，厚約20 μm，自前囟后5 mm 層面開始，每隔5 張選取1 張，每5 張為1 組，共取5 組。取一組切片用于TH 免疫組織化學(xué)染色。TH 免疫組織化學(xué)染色步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。每只大鼠的5 張切片置顯微鏡下計(jì)數(shù)黑質(zhì)區(qū)TH 免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元，分別累計(jì)大鼠注射側(cè)黑質(zhì)區(qū)TH 陽性神經(jīng)元數(shù)目。

1.2.4 腦內(nèi)nanog 基因表達(dá)的觀測(cè):各亞組的取材同1.2.3 步驟，取一組腦組織切片用于觀測(cè)腦內(nèi)nanog 基因表達(dá)。在熒光顯微鏡下，切片中注射針道周圍0.5 mm 范圍內(nèi)任意選4 個(gè)視野，計(jì)算其表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞個(gè)數(shù)，取均數(shù)。

1.2.5 小膠質(zhì)細(xì)胞IBA1 及TNF-α 免疫熒光檢測(cè):各亞組的取材同1.2.3 步驟，分別各取一組腦組織切片進(jìn)行小膠質(zhì)細(xì)胞IBA1 及TNF-α 免疫熒光檢測(cè)。小膠質(zhì)細(xì)胞IBA1 及TNF-α 的免疫熒光染色分別按照試劑盒說明書操作。在熒光顯微鏡下，觀察小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況，并累計(jì)各組大鼠注射側(cè)黑質(zhì)區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞及TNF-α 表達(dá)陽性細(xì)胞的數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 APO 誘發(fā)旋轉(zhuǎn)的行為學(xué)檢測(cè)

在注射6-OHDA 后第14 天，模型組(6-OHDA+PBS、6-OHDA+PNL 與6-OHDA +nanog 組)大鼠均出現(xiàn)不同程度的向右側(cè)健側(cè)旋轉(zhuǎn)。其中，6-OHDA+nanog 組大鼠APO 誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)少于6-OHDA+PNL 組與6-OHDA+PBS 組(P＜0.05)(表1)。

2.2 nanog 基因在腦內(nèi)的表達(dá)

注射后第14 天，對(duì)照組和6-OHDA +PBS 組幾乎無綠色熒光表達(dá)，而在6-OHDA+PNL 組與6-OHDA+nanog 組的針道周圍0.5 mm 范圍內(nèi)觀察到大量綠色熒光陽性細(xì)胞(圖1)。

表1 APO 誘發(fā)大鼠旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of APO-induced rotation in rats (turns/min)(±s)

表1 APO 誘發(fā)大鼠旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of APO-induced rotation in rats (turns/min)(±s)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.05 compared with 6-OHDA+PNL and 6-OHDA+PBS groups.

groupscontrol6-OHDA+PBS6-OHDA+PNL6-OHDA+nanog 14 days after injection08.79 ±1.46*8.37 ±1.28*5.87 ±0.94*#

圖1 各組大鼠注射側(cè)腦紋狀體綠熒光陽性細(xì)胞的觀察與比較Fig 1 The number of green fluorescent positive cells in the left striatum of the rat brain in each group

2.3 各組大鼠中腦黑質(zhì)中TH 陽性神經(jīng)元的觀察

光鏡下觀察大鼠中腦切片可見TH 陽性神經(jīng)元分布于黑質(zhì)，其形態(tài)為大多角形或錐形細(xì)胞，胞質(zhì)棕染。注射后第14d，模型組大鼠注射側(cè)黑質(zhì)TH 陽性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯減少(P＜0.05)，但6-OHDA+nanog 組黑質(zhì)區(qū)存活的TH 陽性細(xì)胞數(shù)多于6-OHDA+PNL 組與6-OHDA+PBS 組(P＜0.05)(表2，圖2)。

2.4 各組大鼠注射側(cè)中腦黑質(zhì)中小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及TNF-α 含量的變化

IBA1-TRITC 免疫熒光染色呈紅色陽性的細(xì)胞為小膠質(zhì)細(xì)胞。與正常對(duì)照組相比，注射后第14 天，模型組大鼠注射側(cè)中腦黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加(P＜0.05)，且陽性細(xì)胞胞體增大，突起變短、增粗，形態(tài)呈典型“阿米巴狀”。但6-OHDA+nanog 組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)低于6-OHDA+PNL 組與6-OHDA+PBS 組(P＜0.05)(表2，圖3)。

免疫熒光染色呈紅色者為TNF-α 陽性表達(dá)。與正常對(duì)照組相比，注射后第14 天，模型組大鼠注射側(cè)中腦黑質(zhì)區(qū)TNF-α 表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，但6-OHDA+nanog 組的TNF-α 表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)少于6-OHDA + PNL 組與6-OHDA + PBS 組(P＜0.05)(表2，圖4)。

表2 各組動(dòng)物左側(cè)注射6-OHDA 的黑質(zhì)區(qū)TH、IBA1、TNF-α 免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)Table 2 Number of TH，IBA1，TNF-α immunopositive cells in the left substantia nigra(number / section)(±s)

表2 各組動(dòng)物左側(cè)注射6-OHDA 的黑質(zhì)區(qū)TH、IBA1、TNF-α 免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)Table 2 Number of TH，IBA1，TNF-α immunopositive cells in the left substantia nigra(number / section)(±s)

*P＜0.05 compared with control group;#P＜0.05 compared with 6-OHDA+PNL and 6-OHDA+PBS groups.

groupsTH-immunopositive neuronsIBA1 (+)microglial cellsTNF-α immunopositive cells control88.5 ±8.351.8 ±15.731.2 ±8.5 6-OHDA+PBS15.6 ±3.9*100.5 ±10.8*81.4 ±10.2*6-OHDA+PNL18.6 ±3.8*96.6 ±13.2*85.6 ±9.9*6-OHDA+nanog48.3 ±5.6* #75.9 ±11.5* #58.5 ±8.0*#

圖2 各組大鼠注射側(cè)腦組織黑質(zhì)區(qū)TH 陽性細(xì)胞的表達(dá)與比較Fig 2 Expression of TH positive cells in the left substantia nigra of the rat in each group(×200)

圖3 各組大鼠注射側(cè)腦組織黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的觀察與比較Fig 3 Observation and comparison of microglial cells in the left substantia nigra of the rat brain in each group(×200)

圖4 各組大鼠注射側(cè)腦組織黑質(zhì)區(qū)TNF-α 陽性細(xì)胞的表達(dá)與比較Fig 4 Expression of TNF-α positive cells in the the left substantia nigra of the rat brain in each group(×200)

3 討論

關(guān)于帕金森病發(fā)病機(jī)制的研究多集中于對(duì)多巴胺能神經(jīng)元損傷的關(guān)注，近年來研究報(bào)道小膠質(zhì)細(xì)胞的激活也參與了多巴胺能神經(jīng)元的變性損傷過程［9］。小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境刺激非常敏感，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損或發(fā)生炎性反應(yīng)，甚至中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的輕微失衡，都可引起小膠質(zhì)細(xì)胞激活，而激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可上調(diào)一些細(xì)胞因子，如TNF-α、白介素-1 等的分泌水平，同時(shí)還產(chǎn)生大量自由基，如過氧化物、喹啉酸、類花生酸類和一氧化氮，這些因子在介導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元損害中均發(fā)揮關(guān)鍵作用［1-3，10］。TNF-α 屬于一種前炎性因子，具有多效促炎性反應(yīng)，在帕金森病發(fā)病中可啟動(dòng)并維持炎性反應(yīng)損傷過程。在帕金森病患者腦內(nèi)黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)和腦脊液中可檢測(cè)到TNF-α 表達(dá)升高［11-12］。TNF-α 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要由小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)神經(jīng)元主要組織相容性抗原Ⅰ(major histocompatibility complex Ⅰ，MHCⅠ)表達(dá)上調(diào)，使之容易受到MHCⅠ限制性細(xì)胞毒性T 細(xì)胞的攻擊。前期研究工作觀察發(fā)現(xiàn)，6-OHDA 誘導(dǎo)的大鼠帕金森病模型存在炎性細(xì)胞因子的異常升高，炎性因子TNF-α、IL-6 參與了多巴胺能神經(jīng)元損傷過程［7］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，6-OHDA 注射后14 d 大鼠注射側(cè)中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元明顯減少，而小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增多，且形態(tài)發(fā)生改變，同時(shí)存在TNF-α 表達(dá)增高，提示小膠質(zhì)細(xì)胞激活可能介導(dǎo)并參與了損傷多巴胺能神經(jīng)元的炎性反應(yīng)過程。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在帕金森病的發(fā)病過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞及其激活后產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子對(duì)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元有不良反應(yīng)，為炎性反應(yīng)參與帕金森病的發(fā)病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但至于這種激活改變與多巴胺能神經(jīng)元之間相互作用的機(jī)制如何，還有待于更進(jìn)一步深入研究。

假設(shè)如果能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，阻斷其后續(xù)介導(dǎo)的炎性反應(yīng)過程，可能為帕金森病的治療提供新思路。Nanog 是一個(gè)獨(dú)特的同源異型框轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)僅限于多能性干細(xì)胞，在已分化的細(xì)胞中其表達(dá)則被抑制［13］。有學(xué)者在胚胎干細(xì)胞分化研究中發(fā)現(xiàn)，nanog 通過與NF-κB 蛋白結(jié)合抑制NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性和促分化能力，維持了胚胎干細(xì)胞的多能性［4］。Nanog 基因存在于人與動(dòng)物的基因組中，在發(fā)育的后期處于沉默狀態(tài)，如果在疾病的情況下，活化該基因有可能獲益。轉(zhuǎn)nanog 基因可能通過下調(diào)炎性因子來抑制炎性反應(yīng)過程。前期工作已構(gòu)建了攜帶nanog 基因的慢病毒載體，并證實(shí)nanog 能抑制脂多糖誘導(dǎo)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB 的轉(zhuǎn)錄［6］。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)制備帕金森病大鼠模型，植入已帶有nanog 基因的慢病毒載體來觀察轉(zhuǎn)nanog 基因的表達(dá)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及其后續(xù)介導(dǎo)的炎性反應(yīng)是否有抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，注射6-OHDA 后第14 天，6-OHDA +nanog 組注射側(cè)黑質(zhì)區(qū)中小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目及TNF-α的表達(dá)低于6-OHDA+PNL 與6-OHDA+PBS 組，而且其黑質(zhì)中存活的多巴胺能神經(jīng)元較多，APO 誘發(fā)的大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少，這與一些研究報(bào)道的黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的損毀程度與APO 誘發(fā)大鼠向健側(cè)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)呈正相關(guān)相一致［14］，提示6-OHDA 誘導(dǎo)的帕金森病大鼠經(jīng)轉(zhuǎn)nanog 基因后黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損毀程度較輕，這種減輕有可能源于nanog 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其后續(xù)介導(dǎo)的炎性反應(yīng)過程的抑制。

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