兔急性心肌梗死模型的建立與心功能、病理演變的動態(tài)研究

龍湘黨LONG Xiangdang

趙 康1ZHAO Kang

葉劍榮2YE Jianrong

喻 宏3YU Hong

蒲大容4PU Darong

兔急性心肌梗死模型的建立與心功能、病理演變的動態(tài)研究

龍湘黨1LONG Xiangdang

趙 康1ZHAO Kang

葉劍榮2YE Jianrong

喻 宏3YU Hong

蒲大容4PU Darong

目的建立兔急性心肌梗死模型，并評估梗死后的心功能及病理動態(tài)變化。材料與方法35只新西蘭大白兔采用開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支（LAD）制作心肌梗死模型，術(shù)后1 d、1周、2周、4周、8周行超聲心動圖檢查，同時抽取靜脈血檢測腦鈉肽（BNP）濃度，并與術(shù)前及前一時間點比較。制作心肌病理切片，行HE染色并觀察病理變化。結(jié)果制?？傮w死亡率為28.6%（10/35）。術(shù)后1周、2周、4周左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、收縮末期內(nèi)徑（LVESD）均較術(shù)前和前一時間點增大（P＜0.05）。術(shù)后1 d、1周、2周、4周左心室射血分數(shù)（LVEF）、短軸縮短率（LVFS）均較術(shù)前和前一時間點降低（P＜0.05）。BNP術(shù)后1 d開始升高，1周達峰值，然后逐漸下降，至8周仍持續(xù)升高（P＜0.01）。病理切片呈典型的心肌細胞變性、壞死、纖維化、鈣化、瘢痕形成等動態(tài)變化。結(jié)論開胸結(jié)扎兔冠狀動脈LAD是建立急性心肌梗死模型的有效方法；兔急性心肌梗死后心功能明顯降低、BNP明顯升高，其變化與病理演變密切相關(guān)。

心肌梗死；急性?。怀曅膭用栌浶g(shù)，多普勒，彩色；心室功能；利鈉肽，腦；病理學，外科；疾病模型，動物；兔

急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）是常見的心血管疾病，嚴重威脅著人類健康。AMI后將產(chǎn)生心臟大小、形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)及功能狀態(tài)的改變，即心室重構(gòu)，是心肌梗死發(fā)展為心力衰竭的重要病理生理過程，并貫穿于整個病程的始終，成為影響AMI近期及遠期預后的主要原因之一。動物心肌梗死模型是研究AMI的病理生理機制、發(fā)生發(fā)展過程和探索新的治療途徑的基本環(huán)節(jié)。實驗性心肌梗死的研究多側(cè)重于制作AMI動物模型的方法學研究[1-4]以及對心肌梗死前后的心功能對比研究和病理學觀察[2,3,5]，對心肌梗死后心功能、生化指標及病理學演變的長期動態(tài)研究較少。本研究旨在通過結(jié)扎新西蘭大白兔冠狀動脈左前降支（LAD）建立心肌梗死模型，對兔AMI后心功能、腦鈉肽（brain natriuretic peptide, BNP）及病理的動態(tài)演變規(guī)律進行研究并探討它們的關(guān)系，以進一步加深對心肌梗死的了解，為心肌梗死的病理學及病理生理學研究打下基礎(chǔ)，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與模型建立 新西蘭大白兔35只，雌雄不限，體重1.6～2.1 kg，由湖南省人民醫(yī)院動物實驗中心提供[許可證號syxk（湘）2010-0013]。大白兔經(jīng)腹腔緩慢注射3%戊巴比妥鈉1 ml/kg進行麻醉。實驗兔仰臥位固定于手術(shù)臺上，胸前區(qū)及上腹部備皮，保持自主呼吸，碘伏消毒，鋪巾。于左側(cè)胸壁第3～4肋間沿肋骨走行方向剪開皮膚及皮下組織，逐層切開斜行肌和豎行肌，鈍性分離肋間肌，于胸骨左緣剪斷第3～4肋軟骨進入胸腔，保持胸膜完整，切開并懸吊心包，暴露心臟。于左心耳下緣及肺動脈圓錐間尋找心大靜脈，并以此為標志在左心耳下緣5～10 mm處用6/0醫(yī)用無創(chuàng)縫合線結(jié)扎LAD，觀察結(jié)扎遠端心肌變蒼白，初步認為制模成功[1]。關(guān)閉胸腔，逐層縫合肌肉及皮膚。開胸手術(shù)時要小心操作，避免損傷血管及胸膜，以免術(shù)中發(fā)生大出血及氣胸。術(shù)后連續(xù)5 d每天肌肉注射青霉素80萬U抗感染，術(shù)后喂養(yǎng)8周。

1.2 超聲心動圖檢查 所有實驗動物于術(shù)前及術(shù)后1 d、1周、2周、4周、8周行超聲心動圖檢查。應(yīng)用ALOKA-ProSound α10彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率7.5～10.0 MHz，啟動專用心臟程序進行常規(guī)超聲心動圖檢查。于胸骨旁標準左心室長軸切面測量左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic diameter, LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end systolic diameter, LVESD）；應(yīng)用M型超聲測量左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction, LVEF）和左心室短軸縮短率（left ventricular shortening fraction, LVFS）[6]，每個指標至少測量3次，取平均值。

1.3 BNP檢測 所有實驗兔分別于術(shù)前及術(shù)后1 d、1周、2周、4周、8周抽取兔耳緣靜脈血1 ml進行BNP檢測，由長沙精維誠生物試劑公司提供專用兔BNP ELISA試劑盒，嚴格按使用說明測定BNP濃度。

1.4 病理學檢查 抽血和超聲檢查結(jié)束后分別于術(shù)后1 d、1周、2周、4周、8周隨機各取2只兔經(jīng)耳緣靜脈注射空氣處死，迅速取出心臟，用預冷磷酸鹽緩沖溶液沖洗，去除心房、大血管及周圍結(jié)締組織，僅留心室。取少許梗死組織和遠離梗死部位的正常組織，固定于10%甲醛溶液中，石蠟包埋，HE染色，于光學顯微鏡下觀察心肌組織的改變。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件，配對資料比較采用配對t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 模型兔存活情況 35只大白兔手術(shù)過程中死亡6只，1只兔因心律失常、1只兔因失血過多、2只兔因大量氣胸導致呼吸抑制死亡，2只兔結(jié)扎冠狀動脈后猝死，推測因冠狀動脈變異結(jié)扎了冠狀動脈主干導致大面積心肌梗死急性心力衰竭死亡，病理檢查支持該推斷。術(shù)后1 d死亡2只，尸體解剖和病理檢查發(fā)現(xiàn)大面積心肌梗死。術(shù)后2周死亡1只，尸體解剖發(fā)現(xiàn)傷口大量積膿，推測感染是其死亡原因。術(shù)后5周死亡1只，尸體解剖發(fā)現(xiàn)心臟明顯增大，有心包積液，推測心力衰竭為其主要死因。25只兔存活并完成實驗步驟，制?？傮w死亡率為28.6%（10/35）。

2.2 手術(shù)前后超聲心動圖測值及形態(tài)學比較 所有大白兔均獲得胸骨旁左心室長軸切面，其中8只兔術(shù)后1 d檢查時因肺氣干擾及傷口影響，導致超聲心動圖顯示欠佳，其中術(shù)后1 d、術(shù)后2周、術(shù)后5周各死亡1只，術(shù)后1 d、1周、4周各有1只被處死行病理學檢查，2只喂養(yǎng)至8周。術(shù)后1 d出現(xiàn)節(jié)段性室壁運動減弱（圖1），LVEF和LVFS較術(shù)前減低（t=16.5、22.3, P＜0.05）。術(shù)后1周出現(xiàn)左心室內(nèi)徑增加（t=20.6、22.4, P＜0.05），LVEF和LVFS較術(shù)后1 d減低（t=25.6、23.3, P＜0.05），同時6只兔出現(xiàn)心包積液，8只出現(xiàn)心律失常。隨著心肌梗死時間的推移，左心室逐漸擴大，心功能進一步降低，術(shù)后2周、4周左心室內(nèi)徑均較前一時間點增大（t=18.6、17.4、13.5、15.4, P＜0.05），LVEF和LVFS較前一時間點降低（t=17.4、15.7、17.4、12.2, P＜0.05），但術(shù)后8周與術(shù)后4周比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。術(shù)后4周左心室長軸切面顯示左心室呈球形擴張，心尖圓鈍（圖2），3只兔室壁瘤形成。

2.3 BNP的動態(tài)變化 與術(shù)前比較，結(jié)扎后BNP濃度升高（t=20.8, P＜0.01）。BNP術(shù)后1 d開始升高，1周達峰值，然后逐漸下降，至8周仍持續(xù)升高（t=20.7、27.9、19.2、30.8、8.0, P＜0.01）。見圖3。

2.4 術(shù)后病理演變特點 AMI兔光學顯微鏡下心肌病理表現(xiàn)如下：術(shù)后1 d：心肌細胞大部分變性，間質(zhì)散在炎癥細胞浸潤；術(shù)后1周：心肌纖維凝固性壞死，心肌細胞變性，部分見核肥大、固縮，間質(zhì)水腫，間質(zhì)及梗死灶周圍大量炎癥細胞浸潤，以中性粒細胞為主，有肉芽組織形成傾向（圖4）；術(shù)后2周：梗死后小片狀纖維化，血管壁增厚，玻璃樣變性；術(shù)后4周：梗死心肌中出現(xiàn)片狀纖維化，脂肪細胞小片狀增生，灶狀鈣化和瘢痕（圖5）；術(shù)后8周：梗死心肌出現(xiàn)機化，灶狀鈣化，瘢痕形成，伴有大片脂肪組織增生。

表1 兔手術(shù)前后常規(guī)超聲心動圖測值及BNP濃度比較（n=35）

圖1 術(shù)后1 d M型超聲心動圖示室間隔中部運動減弱

圖2 術(shù)后4周左心室擴張，心尖圓鈍

圖3 兔AMI后BNP各時間點動態(tài)變化

圖4 術(shù)后1周心肌細胞凝固性壞死、變性，間質(zhì)大量炎癥細胞浸潤（HE, ×400）

圖5 術(shù)后4周梗死心肌呈片狀纖維化，脂肪細胞呈小片狀增生（HE, ×100）

3 討論

動物心肌梗死模型對研究心肌梗死的病理生理和血流動力學有重要作用。新西蘭大白兔心臟大小適宜，冠狀動脈天然側(cè)支循環(huán)較少（與人相似），阻斷后發(fā)生致命的心律失常、死亡率低[7]；而且兔具有雙側(cè)胸膜，可在非人工通氣情況下進行開胸結(jié)扎手術(shù)，是復制心肌梗死模型的理想動物[1]。本研究經(jīng)胸骨左緣切口開胸，保持胸膜腔完整，對呼吸和血流動力學影響較?。恍g(shù)中未使用氣管插管，保持兔自主呼吸，避免了氣管插管對呼吸道的損傷，因此操作較簡便，死亡率較低。然而由于操作視野和空間的影響，仍有1只兔損傷了胸廓內(nèi)血管引起大出血，2只兔損傷了胸膜引起大量氣胸而死亡。此外，經(jīng)胸手術(shù)切口導致8只兔術(shù)后1 d超聲圖像質(zhì)量欠佳，影響了對心功能指標的精確測量。

本研究發(fā)現(xiàn)，兔AMI后左心室發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能改變，即左心室重構(gòu)，病理學上也出現(xiàn)相應(yīng)的變化，兩者密切相關(guān)。冠狀動脈結(jié)扎后1 d局部室壁可見節(jié)段性運動異常，梗死區(qū)域病理表現(xiàn)為心肌細胞大部分變性。心肌細胞對缺血非常敏感，結(jié)扎冠狀動脈20～40 min即可形成不可逆的心肌壞死[8]。心肌細胞是左心室壁產(chǎn)生舒縮運動的基本單位，因此局部室壁失去產(chǎn)生舒縮運動的基礎(chǔ)，導致LVEF和LVFS降低。心肌梗死1周后局部室壁開始重建，左心室逐漸增加，到術(shù)后4周呈球形擴張，部分出現(xiàn)室壁瘤，心功能進一步降低。心肌缺血壞死后，壞死的心肌組織失去正常的心肌張力，在左心室壓力下發(fā)生伸展和變形，導致梗死區(qū)變薄并向外膨展。何振山等[9]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎兔冠狀動脈4周后左心室內(nèi)壓力將發(fā)生改變，左心室中部收縮期壓力由正常時的略高于流出道壓力轉(zhuǎn)為低于后者，收縮期壓力升高的時間順序由正常時室中略早于流出道變?yōu)檫t于后者，這種逆轉(zhuǎn)性變化可能是心肌梗死后左心室重塑的重要始動及增重因素。AMI術(shù)后1周病理主要表現(xiàn)為梗死心肌細胞凝固性壞死、變性，2周開始出現(xiàn)纖維化，4周出現(xiàn)鈣化和瘢痕形成。瘢痕組織主要由I型膠原纖維組成，無舒縮功能，伸展性和彈性較小，硬度較大[10]，最終梗死節(jié)段失去收縮功能。4周時瘢痕組織完全形成，梗死節(jié)段重建完成，故8周時左心室大小及心功能與4周時無明顯變化。

BNP主要由心室分泌，當心室壁張力增加或容量超負荷時，BNP濃度明顯升高。BNP是預測急性心力衰竭的最強指標[11]，AMI后高水平的血漿BNP提示心室重構(gòu)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，AMI模型兔血漿BNP于梗死后升高并呈現(xiàn)動態(tài)變化規(guī)律，梗死后1 d開始升高，1周達峰值，然后逐漸降低，至術(shù)后8周仍高于術(shù)前，與丁麗等[13]研究的AMI模型大鼠左心室肌組織中BNP mRNA和蛋白表達所表現(xiàn)出的動態(tài)變化類似。AMI兔血漿BNP增加并于梗死后1周達峰值，其主要原因可能是AMI后由于心肌細胞變性、壞死，導致梗死區(qū)擴大及室壁變薄拉長，非梗死區(qū)室壁壓力增高，刺激心室肌細胞合成和分泌BNP，從而導致血漿BNP水平升高。AMI恢復期BNP的持續(xù)升高可能是心臟不斷受到牽拉的結(jié)果，還可能是由一種心肌源性的抗纖維化因子所致[14]。AMI兔BNP明顯升高并于1周達峰值，與其病理改變密切相關(guān)，可以為臨床AMI后BNP最佳檢測時間提供理論依據(jù)，發(fā)揮BNP的最大預測價值。

由于兔冠狀動脈血管走行變異大，普遍較短，主要血管長短不一，結(jié)扎同一部位無法保證梗死面積一致；而且這種心肌梗死模型缺乏人類的動脈粥樣硬化的病理學基礎(chǔ)，與人類心肌梗死的病理過程有一定的差異，且人心肌梗死后往往采取治療措施，因此，本研究結(jié)果與臨床研究結(jié)果可能存在差異。

總之，兔AMI后心功能明顯降低、BNP明顯升高，其變化與病理演變密切相關(guān)。臨床上可以應(yīng)用超聲心動圖動態(tài)觀察心肌梗死后心臟功能及形態(tài)學變化，同時動態(tài)監(jiān)測血漿BNP濃度，兩者綜合評價，為后期治療提供依據(jù)。

[1] Fujita M, Morimoto Y, Ishihara M, et al. A new rabbit model of myocardial infarction without endotracheal intubation. J Surg Res, 2004, 116(1): 124-128.

[2] 楊永輝, 李彤, 趙越, 等. 一種簡易兔心肌梗死模型的建立.中國醫(yī)學創(chuàng)新, 2012, 10(10): 1-3.

[3] 戴淑芳, 龍曉鳳, 紀麗麗, 等. 建立一種家兔心肌梗死模型的新方法. 大連醫(yī)科大學學報, 2012, 34(1): 97-100.

[4] 劉斌, 于海初. 冠狀動脈結(jié)扎法與雙極電凝法制備兔急性心肌梗死模型的對比. 齊魯醫(yī)學雜志, 2011, 26(6): 529-531, 533.

[5] 楊明, 高長青, 李力兵, 等. 兔心肌梗死模型的建立及心功能評價. 山西醫(yī)科大學學報, 2011, 42(5): 370-374.

[6] Schiller NB, Shah PM, Crawford M, et al. Recommendations for quantitation of the left ventricle by two-dimensional echocardiography. Am Soc Echocardiogr, 1989, 2(5): 358-367.

[7] Lee BH, Kim WH, Choi MJ, et al. Chronic heart failure model in rabbits based on the concept of the bifurcation/trifurcation coronary artery branching pattern. Artif Organs, 2002, 26(4): 360-365.

[8] Skyschally A, Schulz R, Heusch G. Pathophysiology of myocardial infarction: protection by ischemic pre- and postconditioning. Herz, 2008, 33(2): 88-100.

[9] 何振山, 齊書英, 候云生, 等. 結(jié)扎兔冠脈4周后左室壁結(jié)構(gòu)與室內(nèi)壓力的改變. 心功能雜志, 1998, 10(3): 14-16.

[10] Loftis MJ, Sexton D, Carver W. Effects of collagen density on cardiac fbroblast behavior and gene expression. J Cell Physiol, 2003, 196(3): 504-511.

[11] Mueller C, Breidthardt T, Laule-Kilian K, et al. The integration of BNP and NT-proBNP into clinical medicine. Swiss Med Wkly, 2007, 137(1/2): 4-12.

[12] Bavry AA, Kumbhani DJ, Rassi AN, et al. Benefit of early invasive therapy in acute coronary syndromes: a meta-analysis of contemporary randomized clinical trials. J Am Coll Cardiol, 2006, 48(7): 1319-1325.

[13] 丁麗, 王如興, 李肖蓉. 急性心肌梗死大鼠左心室心肌組織腦利鈉肽表達變化. 中國微循環(huán), 2009, 13(5): 374-377.

[14] Omland T, Aakvaag A, Bonarjee VV, et al. Plasma brain natriuretic peptide as an indicator of left ventricular systolic function and long-term survival after acute myocardial infarction. Comparison with plasma atrial natriuretic peptide and N-terminal proatrial natriuretic peptide. Circulation, 1996, 93(11): 1963-1969.

（本文編輯 張春輝）

Establishment of Myocardial Infarction Model in Rabbits with Dynamic Investigation of Cardiac Function and Pathological Changes

PurposeTo establish myocardial infarction model in rabbits and to evaluate cardiac function and pathological changes.Materials and MethodsIn 35 New Zealand white rabbits, the left anterior descending branch (LAD) of the coronary artery was ligated. The cardiac function was evaluated using echocardiography, and the blood serum brain natriuretic peptide (BNP) level was examined preoperatively, on postoperative day 1, and in 1 week, 2 weeks, 4 weeks and 8 weeks for comparison. Pathological sections and HE staining were performed to observe pathological changes.ResultsThe death rate was 28.6% (10/35). There was progressive increase in left ventricular end systolic diameter (LVESD) and left ventricular end diastolic diameter (LVEDD) at 1 week, 2 weeks and 4 weeks (P＜0.05). There was progressive decrease in left ventricular ejection fraction (LVEF) and left ventricular fractional shortening fraction (LVFS) at 1 day, 1 week, 2 weeks and 4 weeks (P＜0.05). The BNP level started increasing in 1 day, peaked in 1 week, then gradually decreased but remained higher than preoperative level in 8 weeks (P＜0.01). Pathological section showed typical myocardial cell degeneration, necrosis, fbrosis, calcifcation and scar formation.ConclusionThis myocardial infarction model is satisfactory with signifcant decrease of cardiac function and increase of BNP level.

Myocardial infarction; Acute disease; Echocardiography, Doppler, color; Ventricular function; Natriuretic peptide, brain; Pathology, surgical; Disease models, animal; Rabbits

1.湖南省人民醫(yī)院超聲科 湖南長沙 410005

2.湖南省人民醫(yī)院檢驗科 湖南長沙 410005

3.湖南省人民醫(yī)院病理科 湖南長沙 410005

4.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院超聲科 重慶400016

龍湘黨

Department of Ultrasound, Hu'nan Provincial People's Hospital, Changsha 410005, China

Address Correspondence to: LONG Xiangdang

E-mail: hnlxd1997@126.com

湖南省衛(wèi)生廳科研計劃項目（B2009071）。

R-33；R542.22

2014-04-09

修回日期：2014-08-10

中國醫(yī)學影像學雜志

2014年 第22卷 第9期：655-658

Chinese Journal of Medical Imaging

2014 Volume 22(9): 655-658

10.3969/j.issn.1005-5185.2014.09.004